Imagerie réorganisation spatiale d'une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d'expression transitoire du tabac

Résumé

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Résumé

Visualisation des événements de signalisation dynamiques dans des cellules vivantes a été un défi. Nous avons élargi un système d'expression transitoire établie, la complémentation fluorescente (BiFC) Essai biomolécules dans les cellules épidermiques du tabac, de l'interaction protéine-protéine d'essai pour surveiller la distribution spatiale de la transduction du signal dans des cellules végétales. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test BiFC pour montrer que l'interaction et la signalisation entre l'Arabidopsis MAPKKK YODA et MAPK6 se produisent à la membrane plasmique. Lorsque le BASL de protéine d'échafaudage a été co-exprimé, l'interaction YODA-MAPK redistribué et spatialement co-polarisé avec CFP-BASL. Ce système d'expression de tabac modifiée permet un examen rapide de signalisation localisation et dynamiques des changements (moins de 4 jours) et peut accueillir plusieurs de couleurs de protéines fluorescentes (au moins trois). Nous avons également présenté des méthodes détaillées pour quantifier la distribution des protéines (localisation spatiale asymétrique, ou «polarisation»;) Dans des cellules de tabac. Ce système d'expression de tabac de pointe a un potentiel à être largement utilisé pour le test rapide des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales vivantes.

Introduction

Les protéines interagissent dans un des complexes de réseau et forment hiérarchiques complexes qui jouent un rôle central dans presque tous les processus biologiques qui se produisent dans un environnement cellulaire imprévisible. Cependant, du développement des plantes à des réponses de croissance, il y a eu un manque d'outils pratiques qui peuvent non seulement rapidement, mais aussi efficacement identifier et surveiller ces événements de signalisation dynamiques au niveau subcellulaire.

Le système d'expression de protéine transitoire tabac épiderme des feuilles a appel des avantages pour la visualisation des protéines fluoresce....

Protocole

1. Construction du plasmide

1. Générer les constructions par la technologie du clonage comme décrit précédemment ^1,6.
   1. Tout d'abord utiliser un ADN polymérase haute fidélité avec des amorces appropriées pour amplifier les séquences codantes de BASL, YDA et MPK6 et sous-clone dans les vecteurs d'entrée. Trouver le protocole détaillé dans ^7.
   2. Pour générer les versions négatives dominantes de MPK6 et YDA (DNmpk6 ⁸ et DNyda ^4, respectivement), utiliser les plasmides de MPK6 et YDA entrée en tant que modèle et introduire les mutations ponctuelles par une méthode ⁹ mutagenèse dirigée. <....

Résultats

Pour empêcher la mort cellulaire induite par la signalisation MAPK hyperactif, la kinase de versions inactives YDA (DNyda) et MPK6 (DNmpk6) ont été utilisés dans le test de co-expression dans des cellules de tabac. Ni l'interaction entre DNyda et DNmpk6 révélé par BiFC ni CFP-BASL se modèle de distribution inégale générée (figure 3A-B). Toutefois, lorsque CFP-BASL a été introduit dans la paire d'interaction DNyda-DNmpk6, à la fois des signaux YFP PCP et ont été r.......

Discussion

Utilisation générale et modifications possibles du système d'expression transitoire pour le tabac transduction de signal: surexpression de la protéine fluorescente (FP) -tagged protéines dans l'épiderme du tabac a été utilisé avec succès pour un examen rapide de la protéine localisation subcellulaire dans les cellules végétales. Cependant, l' étude de la distribution de signalisation dynamique du complexe protéique in planta est un sujet difficile e.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phusion ADN polymérase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Kit de mutagénèse dirigée vers le site	Agilent Technology	200521
LB bouillon	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamycine	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomycine	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm Slide	VWR	16004-382
24 x 50 mm Verre de protection	VWR	48393-241
Microscope confocal à balayage laser	Leica  ;	TCS SP5 II	LAS AF Lite logiciel
Objectif 40X	Leica	HCX  ; Plan APO  ;	HCX  ; Plan APO, NA 1.30
Centrifugeuse	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Perforateur	Staples
50 ml tubes de faucon	Genesee Scientific	21-108
N° 5 Pince	Canemco & Marivac	205EQA-Spec