Imagerie réorganisation spatiale d'une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d'expression transitoire du tabac

Résumé

Au niveau subcellulaire, les événements de signalisation sont modulés dynamiquement par des signaux développementaux et environnementaux. Nous décrivons ici un protocole qui utilise le système d’expression transitoire du tabac pour surveiller l’interaction dynamique protéine-protéine et pour révéler l’organisation spatiale de la transduction du signal dans les cellules végétales.

Résumé

Visualisation des événements de signalisation dynamiques dans des cellules vivantes a été un défi. Nous avons élargi un système d'expression transitoire établie, la complémentation fluorescente (BiFC) Essai biomolécules dans les cellules épidermiques du tabac, de l'interaction protéine-protéine d'essai pour surveiller la distribution spatiale de la transduction du signal dans des cellules végétales. Dans ce protocole, nous avons utilisé le test BiFC pour montrer que l'interaction et la signalisation entre l'Arabidopsis MAPKKK YODA et MAPK6 se produisent à la membrane plasmique. Lorsque le BASL de protéine d'échafaudage a été co-exprimé, l'interaction YODA-MAPK redistribué et spatialement co-polarisé avec CFP-BASL. Ce système d'expression de tabac modifiée permet un examen rapide de signalisation localisation et dynamiques des changements (moins de 4 jours) et peut accueillir plusieurs de couleurs de protéines fluorescentes (au moins trois). Nous avons également présenté des méthodes détaillées pour quantifier la distribution des protéines (localisation spatiale asymétrique, ou «polarisation»;) Dans des cellules de tabac. Ce système d'expression de tabac de pointe a un potentiel à être largement utilisé pour le test rapide des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales vivantes.

Introduction

Les protéines interagissent dans un des complexes de réseau et forment hiérarchiques complexes qui jouent un rôle central dans presque tous les processus biologiques qui se produisent dans un environnement cellulaire imprévisible. Cependant, du développement des plantes à des réponses de croissance, il y a eu un manque d'outils pratiques qui peuvent non seulement rapidement, mais aussi efficacement identifier et surveiller ces événements de signalisation dynamiques au niveau subcellulaire.

Le système d'expression de protéine transitoire tabac épiderme des feuilles a appel des avantages pour la visualisation des protéines fluorescentes dans les cellules vivantes. Ce système fournit des semi - conditions in vivo qui permettent la modification des protéines post-traductionnelle et un examen rapide de la localisation des protéines. En examinant le signal complémenté YFP, le dosage de complémentation bimoléculaire fluorescente (BiFC) indique la possibilité d'une interaction protéine-protéine dans les cellules végétales. Par rapport à d' autres méthodes, par exemple, la levure deux hybrides (Y2H) et co-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC fournit également un puissant moyen de visualiser les compartiments où les interactions protéine-protéine peuvent se produire au niveau subcellulaire.

Parce que la division cellulaire asymétrique (ACD) maintient la tige population de cellules tout en générant de nouveaux types de cellules pour la formation de tissu / organe, il est un mécanisme indispensable pour la promotion de la multicellularité eucaryote. Le développement d' Arabidopsis stomatique a été utilisé comme un système modèle pour l' étude ACD dans les plantes. La cellule précurseur, cellule mère meristemoid, divise asymétriquement pour produire deux cellules filles différentes, un meristemoid (subit souches divisions cellulaires comme avant de se terminer dans une paire de cellules de garde) et une cellule de terre de la lignée stomatique (SLGC) (peut se diviser et se différencier en une cellule de revêtement), respectivement (figure 1). En stomatique ACD, le roman rupture des protéines de Asymétrie dans le Lineage stomatique (de BASL) est polarisé premitotically pour conduire asymétries de la division, qui incasymétrie physique lude et le destin des cellules d'asymétrie ^1. Une cascade MAPK composé du MAPKKK YODA et les MAPK, MPK3 et 6 est central pour la division des stomates motifs et sort adoption ^{2,3, 4,5.}

Récemment, Zhang et al. lié à la protéine de polarité BASL à la voie de signalisation MAPK YDA-Arabidopsis stomatique ACD ^6. La voie YODA-MAPK canonique, par MPK3 / 6, phosphoryle BASL et active sa polarisation. Fonctions BASL phosphorylés comme un échafaudage et recrute YODA (YDA) et MPK3 / 6 pour former un complexe de protéines et de concentrer la signalisation au niveau du cortex cellulaire ^6. Polarisation des composantes de MAPK et de la boucle de rétroaction positive entre BASL et la voie MAPK-YDA représente un nouveau mécanisme pour la protéine de polarisation dans les cellules végétales. Signalisation MAPK localement enrichi est supposé être étroitement liée à la différenciation du destin cellulaire dans stomatique ACD ⁶ (Figure 1). Un des key données expérimentales qui ont soutenu ce modèle provenaient des essais de tabac qui ont démontré la redistribution spatiale des MAPK induite par l'expression de BASL ^6.

D'une manière générale, il est facile de surveiller la signalisation MAPK où se produit parce que les molécules de MAPK ont souvent été trouvés partout à l'intérieur d'une cellule. Dans cette étude, nous avons utilisé le système split-YFP pour visualiser l'interaction entre la kinase en amont et en aval les suggérer où le relais de signalisation se produit. Nous avons également étendu l'utilisation du système BiFC par co-exprimant une troisième protéine (CFP-tagged) avec la paire YFP fendue (suggestive d'interaction protéine-protéine) pour visualiser si et comment le YFP complété pourrait être modulée spatialement par la coopération protéine exprimée PCP. Ce faisant, nous avons démontré que la co-expression de la PCP-BASL induite réorganisation spatiale des interactions entre YDA et MPK6, de même la distribution à la structuration polarisée au niveau du cortex cellulaire de l'épiderme du tabaccellules al. Ce système a donc le potentiel d'être développé pour la surveillance des événements de signalisation dynamiques dans les cellules végétales dans des conditions où les cellules sont contestées par les stimuli internes ou externes (par exemple, co-expression d'autres protéines, l' application chimique, pathogène attaque ou changements environnementaux, etc. ).

Protocole

1. Construction du plasmide

1. Générer les constructions par la technologie du clonage comme décrit précédemment ^1,6.
   1. Tout d'abord utiliser un ADN polymérase haute fidélité avec des amorces appropriées pour amplifier les séquences codantes de BASL, YDA et MPK6 et sous-clone dans les vecteurs d'entrée. Trouver le protocole détaillé dans ^7.
   2. Pour générer les versions négatives dominantes de MPK6 et YDA (DNmpk6 ⁸ et DNyda ^4, respectivement), utiliser les plasmides de MPK6 et YDA entrée en tant que modèle et introduire les mutations ponctuelles par une méthode ⁹ mutagenèse dirigée.
2. Pour construire les constructions pour les essais de tabac transitoires, effectuer LR standard (attL x attR de recombinaison) Réactions (procédure détaillée dans ⁷⁾ pour intégrer BASL dans pH35CG ^10, DNyda et DNmpk6 en pXNGW et pXCGW vecteurs ^11, respectivement.
   1. Confirmez les plasmides résultants par la digestion enzymatique et séquençage. Une fois successful, transformer les constructions binaires dans la souche d' Agrobacterium tumefaciens GV3101 ¹² et les cultiver sur des plaques de sélection à 28 ° C pendant 2 - 3 jours.

2. Préparation de la solution d' Agrobacterium Infiltration

1. Inoculer quelques colonies d'Agrobacterium fraîchement transformées dans 10 ml de milieu Luria-Bertani (LB) avec des antibiotiques appropriés (gentamicine 25 ug / ml, rifamycine 25 ug / ml de spectinomycine à 100 pg / ml pour pH35CG, pXNGW et pXCGW construit, les mêmes concentrations de la gentamycine et de la kanamycine rifamycine avec 50 pg / ml pour la p19 (exprimant des protéines contre silençage transgénique) ^13.
2. Cultivez cultures d'Agrobacterium dans un shaker C 28 ° à la vitesse de 200 tours par minute pendant environ 16 heures, puis de mesurer la DO ₆₀₀ (estimé pour atteindre 1,5 à 1,8) (Figure 2A-B). Isoler les cultures à 2500 xg pendant 10 min. Re-suspendre et wash les culots cellulaires avec 10 mM de MgCl ₂ (la solution d'infiltration).
3. Isoler les cultures à nouveau et remettre en suspension les pastilles avec quantité appropriée de la solution d'infiltration pour atteindre la DO finale ₆₀₀ = 0,5 (figure 2C-D). Avant l'infiltration de plantes, de laisser les mélanges de cellules à la température ambiante pendant 1-3 heures. Cette étape permet de maintenir l'homéostasie cellulaire.

3. Plante du tabac et des feuilles Injection

1. Utiliser des plants de tabac (Nicotiana benthamiana), cultivés 4-5 semaines d'âge dans une chambre de croissance des plantes standard (23 ° C avec des cycles de / 8 h-16 h dark-light) ¹⁴ pour l' injection de la feuille.
   Remarque: A ce stade, les plants de tabac ont généralement 6 feuilles (2 grandes, 2 moyennes et 2 petites). Les deux feuilles moyennes sont les plus optimales pour l'injection de feuilles (les deux grands sont trop vieux, alors que les deux petits sont souvent trop jeunes).
2. Avant le jour de l'infiltration, l'eau de la Tobacplantes co pour saturer le sol.
3. Le jour d'infiltration, pré-incuber les plantes dans l'obscurité pendant 1-3 heures. Cette étape permet stomates dans l'épiderme pour ouvrir largement, ce qui facilite grandement l'Agrobacterium en pénétrant dans les cellules des feuilles épidermiques.
4. Utilisation de bandes de couleurs marquées avec des dates, drapeau des feuilles à infiltrer. Marquer les zones à infiltrées avec un sharpie noir épais (en option, les zones infiltrées sont visibles après avoir été infecté.).
5. Prenez des volumes égaux de l'Agrobacterium remise en suspension et les mélanger dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm par douce tourbillonnant (Figure 2F). Note: Dans notre cas, nous avons mélangé 1 ml de p19 avec 1 ml de CFP-BASL, 1 ml de DNyda-NYFP et 1 ml de DNmpk-cYFP.
6. Dans le processus d'infiltration, remplir un 3 ml seringue sans aiguille avec le mélange d'infiltration (1 - 2 ml) et pousser sur le côté inférieur (abaxiale) de la feuille de tabac (figure 2F). Alors que l'infiltration, il est utileà utiliser une main pour pousser et d'autre part pour appuyer doucement sur le côté supérieur (adaxial, contre la force de poussée).
   Note: Une fois que le mélange d'infiltration est injecté avec succès, les zones infectées seront facilement reconnaissables dans l'épiderme. Cependant, l'infiltration peut échouer en raison de l'injection dure (de dommages aux tissus) ou insuffisante push (pas de pénétration de liquide). Pour chaque test, nous suggérons au moins deux injections dans deux feuilles indépendantes (à partir de différentes plantes).
7. Placer les plantes infectées de nouveau dans la chambre de croissance. En règle générale, les expressions de protéines sont détectables après 48 h infiltration suivante.

4. imagerie confocale

1. A 48 heures après l' infiltration, utiliser une perforatrice pour exciser un disque de feuille de la zone injectée (normalement 3 - 4 disques / zone peuvent être produites) (figure 2G). Utilisez des pinces pour transférer doucement les disques de feuilles à une diapositive (le côté abaxiale vers le haut) et les monter avec des gouttes d'eau. Évitez d'appuyer trop hard sur le feuillet de couverture , car les cellules comprimées / endommagées ne montrera pas bien sous le microscope confocal (Figure 2H).
2. Avant l'imagerie confocale, analyser les échantillons montés sur un composé microscope epi-fluorescence pour vérifier les niveaux d'expression. Remarque: D'après notre expérience, les cellules qui présentent un niveau d'expression intermédiaires sont mieux représentés sous le microscope confocal.
3. Commencez avec le 40X (NA 1.3) lentille sur un microscope confocal. Ajuster le coulisseau à la position désirée de sorte que les cellules exprimant des niveaux moyens de protéines fluorescentes restent au centre. Les spectres d'excitation / émission de CFP et YFP sont 458 nm / 480-500 nm et 514 nm / 520-540 nm, respectivement.
4. Activez le bouton "Live" pour prévisualiser les images puis réglez l'intensité du laser et le gain à puce pour le rapport intensité de fluorescence / bruit le plus équilibré. Pour améliorer la qualité d'image, augmenter les pixels de balayage et / ou moyenne trame / ligne. Enfin, réglez le bouton de mise au point reach le plan focal médian et cliquez sur "Capture" pour prendre l'image.
   Note: La PCP et les images YFP peuvent être capturées successivement ou simultanément en cochant ou désactiver l'option de mode de balayage "séquentiel", respectivement.
5. Lorsque Z projection est souhaitée pour la vue en profondeur des cellules, sélectionner le mode d'imagerie "xyz", définir la profondeur de la plage de balayage (10 - 15 um) et récupérer les images à partir du haut vers le bas de la cellule cible . Compiler les images obtenues avec le logiciel Leica en cliquant droit sur le fichier d'image pour sélectionner "renommer" et d'exporter des images sous forme de fichiers .tiff.
6. Photo 30 - 40 cellules pour l'analyse de quantification.

Traitement 5. Image et analyse de Quantification

1. Utilisez le logiciel Fidji (http://fiji.sc/Fiji) pour traiter des images et effectuer la quantification.
   1. Tracer les graphes d'intensité de fluorescence.
      1. Pour mieux visualiser si l'expression CFP / YFP estuniformément répartie, utiliser Fidji pour démontrer la puissance du signal du CFP et YFP le long de la périphérie de la cellule. Pour ce faire, lancer la première Fidji puis sélectionnez "Fichier" et "Ouvrir" pour démarrer l'image. Cliquez sur "ligne" dans le menu d'outils et sélectionnez "ligne segmentée" par un clic droit. Décidez de la région d'intérêt et tracer une ligne le long de la périphérie de la cellule pour tracer la PCP ou le signal YFP (figure 3A-C).
         Note: Fidji mesure la valeur d'intensité de fluorescence absolue le long des lignes segmentées.
      2. Sélectionnez le menu déroulant "Analyser" et "Profil de la parcelle" pour générer un graphique avec la position et l'intensité des valeurs qui représentent les niveaux de CFP / YFP le long de la ligne segmentée. Si vous le souhaitez, dupliquer les valeurs d'intensité (en sélectionnant le menu "Copier") dans EXCEL ou un autre logiciel graphique pour générer des graphiques d'intensité comparables.
   2. Quantifier degré de polarité.
      1. Prélever environ 20 représencellules tatives de 3 expériences répétées pour évaluer le degré de polarité du CFP et YFP dans les cellules de tabac. Calculer le degré de polarité sur la base du rapport de l'intensité de fluorescence élevée (définie comme H) par rapport à la faible intensité de fluorescence (définie comme L). Remarque: La méthode de quantification est expliqué dans la Figure 3.
         1. Pour mesurer les valeurs de H et L, tracer une ligne segmenté le long de la région intéressée à la périphérie de la cellule (décrite ci-dessus), cliquez sur "Analyser" dans le menu déroulant, puis sélectionnez "Mesure". Lorsqu'une fenêtre "Résultats" apparaît, utiliser "moyenne" des valeurs pour effectuer la quantification.
         2. A partir des cellules présentant une expression relativement uniforme de CFP et YFP, par exemple, CFP-BASL (figure 3A) ou YFP complétées de la co-expression de DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3B), obtenir les valeurs H et L en mesurant deux choisis au hasard segments périphériques de longueur égale.
         3. A partir des cellules présentant l' accumulation polaire évidente de protéines fluorescentes, dans ce cas, la co-expression de la PCP-BASL, DNyda-NYFP et DNmpk6-cYFP (figure 3C), collecter les valeurs H des régions périphériques avec des signaux de fluorescence enrichis et les Ls des régions à faible / pas d'accumulation de fluorescence.
         4. Réunir les rapports résultants de H / L de 20 cellules ensemble et essai pour la distribution normale. Calculer les valeurs de p par le test t de Student (pour la distribution normale) ou le test de Kolmogorov-Smirnov (KS) (pour la distribution non-normale).

Résultats

Pour empêcher la mort cellulaire induite par la signalisation MAPK hyperactif, la kinase de versions inactives YDA (DNyda) et MPK6 (DNmpk6) ont été utilisés dans le test de co-expression dans des cellules de tabac. Ni l'interaction entre DNyda et DNmpk6 révélé par BiFC ni CFP-BASL se modèle de distribution inégale générée (figure 3A-B). Toutefois, lorsque CFP-BASL a été introduit dans la paire d'interaction DNyda-DNmpk6, à la fois des signaux YFP PCP et ont été redistrib...

Discussion

Utilisation générale et modifications possibles du système d'expression transitoire pour le tabac transduction de signal: surexpression de la protéine fluorescente (FP) -tagged protéines dans l'épiderme du tabac a été utilisé avec succès pour un examen rapide de la protéine localisation subcellulaire dans les cellules végétales. Cependant, l' étude de la distribution de signalisation dynamique du complexe protéique in planta est un sujet difficile e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phusion ADN polymérase	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL Kit de mutagénèse dirigée vers le site	Agilent Technology	200521
LB bouillon	AMRESCO	J106-2KG
Bacto Agar	AMRESCO	J673-1KG
Gentamycine	Sigma-Aldrich	G3632-1G
Rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501-1G
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K4000-25G
Spectinomycine	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 x 75 mm Slide	VWR	16004-382
24 x 50 mm Verre de protection	VWR	48393-241
Microscope confocal à balayage laser	Leica  ;	TCS SP5 II	LAS AF Lite logiciel
Objectif 40X	Leica	HCX  ; Plan APO  ;	HCX  ; Plan APO, NA 1.30
Centrifugeuse	Thermo Scientific	SORVALL 6+
Perforateur	Staples
50 ml tubes de faucon	Genesee Scientific	21-108
N° 5 Pince	Canemco & Marivac	205EQA-Spec