Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

Summary

Les cultures à faible densité de neurones primaires de l’hippocampe nécessitent généralement une couche nourricière gliale pour fournir des facteurs neurotrophiques et maintenir la longévité. Nous décrivons ici une méthode simplifiée de culture de neurones à ultra-faible densité sur des lamelles de verre en présence d’une couche nourricière neuronale à haute densité, ce qui facilite l’étude de mécanismes neuronaux autonomes spécifiques.

Abstract

La culture de neurones hippocampiques primaires in vitro facilite l' interrogation mécaniste de nombreux aspects du développement neuronal. neurones hippocampiques embryonnaires dissociées peuvent souvent se développer avec succès sur des lamelles de verre à haute densité dans des conditions sans sérum, mais les cultures à faible densité nécessitent généralement une alimentation de facteurs trophiques par les co-culture avec une couche glie d'alimentation, la préparation de ce qui peut prendre du temps et laborieux. En outre, la présence de cellules gliales peut fausser l'interprétation des résultats et des études opposent sur les mécanismes spécifiques des neurones. Ici, une méthode simplifiée est présentée pour ultra-basse densité (~ 2.000 neurones / cm ^2), à long terme (> 3 mois) la culture de neurones hippocampiques primaire qui est dans des conditions libres de sérum et sans support de cellules gliales. les neurones de basse densité sont cultivées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine et basculés sur les neurones à haute densité cultivées dans une plaque à 24 puits. Au lieu d'utiliser des points de paraffine pour créer un espace between les deux couches de neurones, les expérimentateurs peuvent simplement graver le fond en plastique du puits, où les neurones à haute densité se trouvent, pour créer un microspace propice à la croissance des neurones de basse densité. La co-culture peut être facilement maintenue pendant> 3 mois sans perte significative des neurones de basse densité, ce qui facilite l'étude morphologique et physiologique de ces neurones. Pour illustrer cet état de culture réussie, les données sont fournies pour montrer la formation des synapses profuse dans les cellules de faible densité après culture prolongée. Ce système de co-culture facilite aussi la survie des neurones individuels rares îlots cultivés dans des substrats de poly-D-lysine et donc la formation de liaisons autaptic.

Introduction

Growing neurones hippocampiques dans des conditions in vitro permet l' observation et la manipulation expérimentale de ces neurones qui sont par ailleurs pas possible in vivo. Cette approche expérimentale est largement utilisé pour révéler les mécanismes neuronaux de la croissance, la polarité, la spécification des neurites, le trafic et la localisation subcellulaire des protéines, la formation des synapses et la maturation fonctionnelle ^1. Ces tests in vitro des neurones hippocampiques en culture, lorsqu'il est récolté à partir des stades embryonnaires tardives, sont relativement pur (> 90%) des cellules glutamatergiques....

Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des souris ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arizona, et conformes aux directives du NIH.

1. Tissue Source pour hippocampique Neuron Culture

1. Pour générer souriceaux prénatales pour la culture des neurones hippocampiques, utiliser des souris de temps enceintes (C57BL6 / J) qui sont élevés dans la maison ^17. Le jour avec détection de bouchon vaginal est désigné comme E0.5. Le moment de la récolte prévue pour la culture est E16,5-E17.5.
   Remarque: Ce protocole décrit les cultures d....

Results

Le protocole décrit ici permet de succès ultra-faible densité, la culture à long terme des neurones glutamatergiques purs sans avoir besoin de cellules gliales servant de couche d'alimentation. Le protocole est schématisée sur la figure 1, qui comprend la préparation de haute densité (de poly-D-lysine revêtu 24 puits) et les neurones de basse densité (à la poly-D-lysine lamelles de verre revêtues) séparément, et la co-culture subséquente qui peut être maintenue jusqu'à t.......

Discussion

Nous présentons un protocole détaillé pour la culture à long terme des neurones glutamatergiques hippocampiques ultra-basse densité dans des conditions sans sérum. A ~ 2000 neurones / cm ^2, la densité est au moins deux fois plus faible que la plupart des préparations «faible densité» de la culture , avec ou sans le soutien de la glie rapportée par la littérature existante ^{2,3,11,13,14.} En plus d'être ultra-faible densité, ce protocole est nouvelle et significative de deux façons. Tout d'abo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protéger de la lumière
B27 supplément	Life Technologies	17504-044	aliquote, stocker en format 0,6ml
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	diluer 100X  ;
antibiotique-antimycosique (AA)	Life Technologies	15240-096	diluer 100X  ;
		de culture complet	Milieu neurobasal avec 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Milieu			identique à 'Milieu neurobasal’Milieu
		d’alimentation	Neurobasal avec 1X B27 supplément
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	préparer 100X stock à 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
tampon au borate	Sigma-Aldrich	B6768 (acide borique) ; 71997 (borax)	1,24 g d’acide borique et 1,9 g de borax dans 400 ml de H2O, pH à 8,5 utiliser HCl
12 mm lamelles en verre rond	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 verre, acheter chez Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	voir protocole pour plus de détails
2X HEPES buffered salin (HBS)	Promega	E1200	voir protocole pour plus de détails
Filtre à seringue	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmide kit de préparation de plasmide	Qiagen	12362	pour la préparation d’un anticorps anti-MAP2 d’ADN plasmidique de qualité transfection
anti-MAB3418	Millipore		, clone AP20
anticorps anti-p-Tau	Anticorps polyclonal de lapin	Millipore	AB10417
anticorps anti-NR1	Millipore	MAB1586	, clone R1JHL
Anticorps anti-GluR1	polyclonal de lapin	Millipore	AB1504
saline équilibrée de Hank	ThermoFisher	14025092	format 500ml