Article de méthode

Technique à la cible microinjection du Developing Xenopus Kidney

DOI :

10.3791/53799

⸱

3 mai 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous présentons un protocole pour utiliser des cartes de destin et des traceurs de lignées pour cibler les injections dans des blastomères individuels qui donnent naissance au rein d’embryons de Xenopus laevis.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le rein embryonnaire de Xenopus laevis (grenouille), pronéphros, se compose d'un seul néphron, et peut être utilisé comme modèle pour les maladies rénales. Embryons de Xenopus sont grandes, à développer l' extérieur et peuvent facilement être manipulés par micro - injection ou des interventions chirurgicales. En outre, les cartes du destin ont été établis pour les premiers embryons de xénope. microinjection ciblée dans le blastomère individu qui finira par donner naissance à un organe ou d'un tissu d'intérêt peut être utilisé pour surexprimer sélectivement ou renverser l'expression des gènes dans cette région restreinte, ce qui diminue les effets secondaires dans le reste de l'embryon en développement. Dans ce protocole, nous décrivons comment utiliser des cartes de destin Xenopus établies pour cibler le rein en développement Xenopus (les pronéphros), par microinjection dans blastomère spécifique d'embryons 4 et 8 cellules. L'injection de traceurs de lignée permet de vérifier le ciblage spécifique de l'injection.Après les embryons se sont développés à l'étape 38 - 40, toute monture immunocoloration est utilisé pour visualiser le développement pronephrique, et la contribution des cellules ciblées aux pronéphros peut être évaluée. La même technique peut être adaptée pour cibler d'autres types de tissus, en plus des pronéphros.

Introduction

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Le rein embryonnaire de Xenopus, les pronéphros, est un bon modèle pour étudier le développement du rein et de la maladie. Les embryons se développent à l'extérieur, sont de grande taille, peuvent être produites en grand nombre, et sont facilement manipulés par microinjection ou des interventions chirurgicales. En outre, les gènes qui régissent le développement du rein chez les mammifères et les amphibiens sont conservés. Reins de mammifères progresser à travers trois étapes: les pronéphros, mésonéphros et métanéphros 1, tandis que les amphibiens embryonnaires ont un pronéphros et amphibiens adultes ont un métanéphros. L'unité de filtrage de base de ces formes de rein est le néphron, et les mammifères et les amphibiens nécessitent les mêmes cascades de signalisation et des événements inductifs à subir néphrogenèse 2, 3. Le pronéphros Xenopus contient un seul néphron composé de proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules, et un glomus (analogue au niveau du glomérule chez les mammifères) , 1, 4-6 (figure 1 ). Le seul grand néphrons présent dans les pronéphros Xenopus le rend approprié comme un modèle simple pour l'étude des gènes impliqués dans les processus de développement du rein et de la maladie.

Cartes Cell sort ont été établis pour les premiers embryons de xénope et sont librement disponibles en ligne à Xenbase 7-11. Ici, nous décrivons une technique de micro - injection de traceurs de la lignée de cibler pronéphros Xenopus développement, bien que la même technique peut être adaptée pour cibler d' autres tissus tels que le cœur ou les yeux. traceurs sont des marqueurs de la lignée (y compris les colorants vitaux, les dextranes marqués par fluorescence, des enzymes détectables par voie histochimique et l'ARNm codant pour des protéines fluorescentes, etc.) qui peuvent être injectés dans un blastomère précoce, permettant la visualisation de la descendance de cette cellule au cours du développement. Ce protocole utilise MEM-RFP ARNm, membrane de codage cible rouge protéine fluorescente 12, comme traceur de la lignée. La technologie de micro-injection cibléeniques pour blastomères individuels dans des embryons de 4 et 8 cellules décrites ici peuvent être utilisées pour l'injection avec morpholinos pour abattre l'expression des gènes, ou avec de l'ARN exogène pour surexprimer un gène d'intérêt. En injectant dans la ventrale, blastomère végétale, principalement les pronéphros de l'embryon seront ciblés, laissant les pronéphros controlatéral comme un contrôle de développement. Co-injection d'un traceur vérifie que le bon blastomère a été injecté, et montre quels tissus dans l'embryon est née de la blastomère injecté, en vérifiant le ciblage des pronéphros. Immunocoloration des pronéphros permet la visualisation de la façon dont les tubules pronephrique ont été ciblés. Surexpression et knockdown effets peuvent ensuite être marqué contre le côté opposé de l'embryon, qui sert de contrôle du développement, et peuvent être utilisés pour calculer l'indice pronephrique 13. La disponibilité des cartes du destin cellulaire permet cette technique de micro-injection ciblée pour être utilisée pour cibler les tissus OTHer que les pronéphros, et co-injection d'un traceur fluorescent permet de microinjection ciblée pour chaque tissu à vérifier avant l'analyse.

Pendant embryon microinjection, la température de développement doit être réglementé étroitement, étant donné que le taux de développement de Xenopus est très dépendante sur elle 14. Les embryons doivent être incubés à des températures plus fraîches (14 - 16 ° C) pour les injections 4 et 8 cellules parce que le temps de développement est ralenti. A 22 ° C, le temps de développement de l'étape 1 (1 cellule) à l'étape 3 (4 cellules) est d'environ 2 heures, tandis que à 16 ° C le temps de développement à l'étape 3 est d'environ 4 heures. Il faut environ 15 minutes pour aller d'un embryon 4 cellules à une 8 cellules (stade 4) embryon à 22 ° C, mais il faut environ 30 minutes à 16 ° C. De même, à 22 ° C, il ne prend que 30 minutes pour un embryon de 8 cellules de progresser à un embryon de 16 cellules (étape 5). Ce temps est augmenté à 45 minutes à 16 ° C. lerefore, il est utile de ralentir le rythme des embryons de développement pour permettre assez de temps pour les injections au stade 8 cellules avant que les embryons progressent au stade 16 cellules. En outre, des températures de croissance peuvent être modulées pour accélérer ou ralentir le développement embryonnaire jusqu'à ce que le rein a pleinement développé.

L'épiderme des embryons de xénope têtard stade est relativement transparent, permettant une imagerie facile des pronéphros en développement sans dissection ou de compensation du tissu 15. En raison de la relative transparence des embryons de xénope, imagerie des cellules vivantes est également possible 16,17. Whole monture immunocoloration pour visualiser les pronéphros est possible avec des anticorps établis qui étiquettent proximale, intermédiaire, distale et tubules de connexion de l' étape 38 - 40 embryons qui permettent d'évaluer le développement pronephrique après manipulation de l' expression du gène ciblé dans les embryons de xénope 18-20.

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Protocole

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Le protocole suivant a été approuvé par l'Université du Texas Health Science Center au centre de Houston pour des animaux de laboratoire Comité de médecine bien-être animal, qui sert de soins en établissement et l'utilisation Comité (protocole #: HSC-AWC-13-135).

1. Identification et sélection des blastomères pour Injections de rein ciblées

  1. Avant de générer des embryons, utiliser le tableau normal du Xenopus développement 21 pour comprendre l'orientation des divisions cellulaires précoces dans l'embryon. Sinon, l' accès des diagrammes des premiers stades de développement Xenopus sur Xenbase 11.
  2. Accédez aux Xenopus cartes interactives du destin cellulaire sur Xenbase 11 pour sélectionner blastomère sera ciblée pour la microinjection.
  3. Observez que l'embryon de cellule unique a un pôle animal sombre pigmentée et un pôle végétal, qui est blanc et yolky. A noter qu'une membrane de protection, connue sous le vitelline envelope, couvre l'embryon.
  4. Notez que la première coupure se produit généralement entre les côtés gauche et droit de l'embryon. Ces cellules contribuent également à la lignée pronephrique.
  5. Notez que le deuxième clivage sépare la partie dorsale et ventrale moitiés de l'embryon, conduisant à un embryon de quatre cellules. Les cellules dorsales sont plus petites et moins de pigment que les cellules ventrales (figure 2A et la figure 3A).
    1. Identifier les blastomères ventrales (V, les grandes cellules, sombres) sur les côtés gauche et droit, qui contribuent plus au rein en développement que la dorsale (D; petites cellules, lumière) blastomères (figure 2A).
    2. Si l' injection dans un embryon 4 cellules, injecter le blastomère ventral gauche pour cibler le rein gauche (figure 3A et la section 3).
  6. Le troisième clivage bissecte les côtés animales et végétales, résultant en un embryon de huit cellules. À ce stade, il y a quatre blastomères animaux [gauche et à droite ventrale(V1) et dorsale (D1)] et quatre blastomères végétaux [gauche et à droite ventrale (V2) et dorsale (D2)] (figure 2B et la figure 3B).
    1. Localisez les, blastomères végétales ventrales (V2). Ces blastomères contribuent davantage au développement de rein toutes les autres cellules à ce stade (figure 2B). Pour cibler le rein gauche d'un embryon de 8 cellules, injecter dans le blastomère gauche V2 (figure 3B et la section 3).
  7. Notez que les quatrième et cinquième clivage bissectrices des blastomères animales et végétales. Deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, résultant en un embryon de 16 cellules. Les cellules sont nommées d'après leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2 à partir du stade de 8 cellules donne lieu à V2.1 , V2.2 et descendants au stade de 16 cellules (figure 2C). La cellule V2.2 au stade 16 cellules fournit la majorité des cellules qui contribuent à l'élaboration du rein.
  8. Notez que les sixième et septième clivages se traduisent par une 32 cellule embryo. Encore une fois, deux descendants sont générés à partir de chaque blastomère, qui sont nommés suivant leur prédécesseur. Par exemple, le blastomère V2.2 à partir du stade 16 cellules donne lieu à V2.2.1 et V2.2.2 au stade 32 cellules. Il existe un système d'attribution de nom alternatif au stade 32 cellules dans lequel les cellules sont identifiées en quatre rangées A, B, C et D (de l'animal à végétale), et quatre colonnes 1, 2, 3 et 4 ( de dorsale ventrale). Ainsi, le blastomère V2.2.2, ce qui contribue le plus aux pronéphros en développement, est appelé C3 dans ce système de nommage alternatif (figure 2D).

2. Préparation d'embryons

  1. Préparer 50 ml de solution Dejelly (2% de cystéine, NaOH à pH 8,0).
  2. Isoler les deux testicules d'une seule grenouille mâle selon les protocoles standards 14. Placez les testicules dans un plat de 60 mm de Pétri remplie avec 10 ml de solution de stockage Testicules (Modifié Ringers [MMR 1x Marc; 0,1 M de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES à pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% d' albumine de sérum bovin, 50 ug / ml de gentamycine). Conserver les testicules à 4 ° C.
    Remarque: Testicules peut être stocké pendant environ 7-10 jours à 4 ° C, mais l'efficacité de la fertilisation diminuera plus les testicules ont été stockés.
  3. Déposer une grenouille femelle pour obtenir des oeufs selon des protocoles standard 14. Ramassez les oeufs dans une boîte de Pétri de 100 mm. Verser tout excès d'eau.
  4. Couper ¼ de testis alors qu'il est dans une solution de stockage à l'aide de pinces et Testicules une lame de rasoir. Transférer le morceau de testis à la boîte de Petri contenant des œufs. Ajuster la taille de la partie testiculaire utilisée pour tenir compte de la taille des testicules, combien de temps le testicule a été stocké, et combien d'oeufs doivent être fécondé. Généralement utiliser ¼ à 1/3 d'un testicule fraîchement disséqués pour fertiliser un embrayage d'œufs.
  5. Couper la partie testiculaire en petits morceaux à l'aide de pinces et d'une lame de rasoir. Ajouter suffisamment 0.3x MMR+ 30 mg / ml de gentamicine à la boîte de Pétri pour couvrir les oeufs. Agiter le MMR dans le plat pour mélanger.
  6. Attendez environ 30 minutes pour la fécondation ait lieu à la température ambiante. Notez que l'hémisphère animal (le côté pigmentée de l'embryon) sera assis sur le dessus de l'embryon après la fécondation efficace. Ensuite, retirez le MMR de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert. Ajouter la solution Dejelly assez pour le plat pour couvrir les embryons.
  7. Au cours des prochaines minutes, agiter doucement le plat par intermittence. Une agitation vigoureuse du plat à ce moment peut causer des défauts d'axe.   La couche de gelée sur les embryons se dissoudra, et les embryons se rassemblent dans le centre du plat pendant tourbillonnant. Une fois que les embryons sont étroitement en contact entre eux dans le centre de l'assiette, retirer la solution Dejelly avec une pipette de transfert. Ne pas laisser les embryons dans la Solution Dejelly pendant plus de 5 minutes, ou les embryons peuvent être endommagés.
  8. Laver les embryons dejellied 3 - 5 fois en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicine par le versant avec précaution ou pipetage hors du MMR et en remplissant le plat avec le nouveau vaccin ROR. Ne pas enlever tout le MMR de l'antenne, ou les embryons peuvent être endommagés.
  9. Retirez tous les œufs non fécondés ou des morceaux de testis de la boîte de Pétri à l'aide d'une pipette de transfert.
  10. Incuber embryons entre 14 et 22 ° C.
    Nota: Les embryons cultivés à des températures plus basses se développent plus lentement que les embryons cultivés à des températures plus élevées. Timing des stades de développement peuvent être trouvés sur Xenbase 22.
    1. Pour l'espace sur leur développement, le lieu de la moitié des embryons provenant d'une seule fécondation dans une boîte de Pétri maintenue à 14 ° C, et l'autre moitié des embryons dans une boîte de Pétri maintenue à 18 ° C. Ceci permet d'avoir deux ensembles d'injections dans des embryons de cellules 4 ou 8 cellules à partir d'une seule fécondation.

3. Préparation des solutions d'injection et de micro-injection d'embryons

  1. Préparer une solution injectable contenant 0,01ng / nl protéine liée à la membrane rouge fluorescent (MEM-RFP) ARNm 9 tandis que les embryons se développent au stade 4 cellules ou 8 cellules. Conserver la solution d'injection sur la glace jusqu'à ce que prêt à injecter.
  2. Charger un "tube capillaire en verre de remplacement dans un extracteur d'aiguille, avec la partie supérieure du tube de remplacement aligné avec la partie supérieure du boîtier aiguille de traction. Réglez le # 2 valeur de la chaleur à 800, et la valeur de traction à 650. Appuyez sur la touche" 7 tirer "pour tirer l'aiguille. Cela va créer 2 aiguilles à partir d'un seul 7" tube capillaire en verre.
  3. Couper la pointe d'une aiguille tirée avec une paire de pinces Dumont.
    Remarque: Après avoir tiré l'aiguille, la pointe est scellé fermé et doit être coupé ouvert. Le plus proche de la pointe de l'aiguille qu'il est coupé, plus le diamètre de la pointe de l'aiguille sera. Bien que le diamètre de la pointe ne sera pas affecter le volume d'injection avec le système de microinjection utilisé ici, une pointe avec un plus grand diamètre est plus susceptible d'endommager l'embryon.
  4. Glissez le micropipette virole sur le dos de l'aiguille. Ensuite, glisser le grand joint torique de trou sur le dos de l'aiguille derrière le collet.
  5. Remplissez l'aiguille avec de l'huile minérale à l'aide d'une aiguille hypodermique de calibre 27, en faisant attention de ne pas obtenir des bulles d'air dans l'aiguille.
  6. Glissez l'aiguille sur le piston de la micro-injecteur, d'un coin de l'aiguille dans le grand trou du blanc entretoise en plastique installé sur le piston. Le plongeur doit avoir un petit joint torique le plus proche du corps du micro-injecteur, suivie par l'entretoise blanche, grand joint torique de trou, et virole. Fixer l'aiguille en serrant la pince. Tirez doucement sur l'aiguille pour vous assurer qu'il est correctement fixé.
  7. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton "vide" sur la boîte de contrôle de micro-injecteur jusqu'à ce qu'il ya deux bips.
  8. Introduire à la pipette 3 pl de solution d'injection sur un morceau de parafilm. Insérer la pointe de l'aiguille dans le talon de la solution d'injection sur le Parafilm. Appuyez et maintenez enfoncé le bouton "remplir" sur le microiboîte njector de commande pour dessiner la solution d'injection dans l'aiguille.
  9. Remplir une boîte de 60 mm de Pétri bordée de 500 microns maille polyester avec 5% Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Pipetter prudemment 20 - 30 4 cellules ou 8 cellules d'embryons dans le plat.
  10. En utilisant une boucle de cheveux 14, manipuler les embryons afin que le blastomère à injecter est tournée vers l'aiguille. Pour cibler le rein gauche, aligner les embryons de sorte que les blastomères ventrales gauche d'embryons 4 cellules ou blastomères V2 gauche des embryons à 8 cellules face à l'aiguille.
  11. Injecter 10 nl de solution d'injection dans le blastomère choisi de chaque embryon dans le plat.
    Remarque: Le maillage au fond de la boîte de Petri stabilise les embryons et les empêche de rouler, en leur permettant d'être injectées sans l'utilisation d'une boucle de cheveux pour la stabilisation.
  12. Transfert injecté embryons dans des puits d'une plaque de culture qui ont été remplis avec 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine. Incuber l'embryon injectés à 16 ° C pendant au moins une heure pour permettre aux blastomères injectés à guérir.
  13. Transférer les embryons cicatrisées dans les puits d'une nouvelle plaque de culture qui ont été remplis de 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicine par étape 9 (avant gastrulation).
  14. Incuber les embryons à 14-22 ° C jusqu'à ce que les embryons atteignent stade 38 - 40 21.

4. Fixation et immunocoloration des Embryons

  1. Préparer 50 ml de sulfate de MOPS / EGTA / magnésium / formaldéhyde tampon [MEMFA: 100 mM de MOPS (pH 7,4), 2 mM d' EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% (v / v) de formaldéhyde].
  2. En utilisant une pipette de transfert, mettre 10 - 20 étape 38 - 40 embryons dans un flacon en verre. Ajouter 10 pi 5% benzocaïne dans 100% d'éthanol dans le flacon et inverti flacon pour mélanger. Attendre 10 min pour anesthésier les embryons.
  3. Retirer le RMM du flacon à l'aide d'une pipette en verre. Si le traitement de plusieurs flacons en même temps, les flacons peuvent être maintenus en position verticale dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits.
  4. Avec un tube de verreTTE, remplir le flacon avec MEMFA. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 1 heure à température ambiante.
  5. Retirer la MEMFA du flacon à l'aide d'une pipette en verre. Remplissez le flacon avec 100% de méthanol. Placer le flacon sur une plate-forme à bascule en trois dimensions pendant 10 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage une fois de plus, et de stocker les embryons dans 100% de methanol pendant une nuit à -20 ° C.
  6. Préparer 1x solution saline tamponnée au phosphate-sérum-albumine bovine-Triton (PBT): 1 x PBS, 2 mg / ml de sérum-albumine bovine, 0,1% de Triton X-100.
  7. Préparer la solution d'anticorps primaire: 1x PBT avec 10% de sérum de chèvre à une dilution 1: 5 de l' anticorps monoclonal de souris 4A6 anticorps (pour marquer les membranes des tubules intermédiaires distale et de liaison 20), une dilution à 01:30 d' un anticorps monoclonal de souris 3G8 (à la lumière de l' étiquette des tubules proximaux 20), et une dilution 1: 250 d'anticorps polyclonal de lapin de RFP (pour étiqueter le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C.
  8. Préparer le secondasolution d'anticorps de ry: 1x PBT avec du sérum de chèvre 10%, 1: 500 Alexa 488 chèvre anti-IgG de souris (concentration en stock 2 mg / ml, à l'étiquette 4A6 et 3G8), et 1: 500 Alexa 555 chèvre anti-IgG de lapin (stocks concentration de 2 mg / ml, pour marquer le traceur MEM-RFP). Conserver à 4 ° C, recouvrant le tube en aluminium pour protéger de la lumière.
  9. Vous pouvez également recueillir les anticorps primaires et secondaires après coloration, et enregistrer à 4 ° C pour une réutilisation dans des expériences futures. Si l'anticorps doit être sauvegardé pour réutilisation, ajouter l'azide de sodium à 0,01%.
  10. Immunocoloration les embryons en utilisant des protocoles établis 18.

5. Visualisation des embryons et l'analyse des tissus ciblés pronephrique

  1. Tamiser les embryons immunohistochimique pour vérifier que le bon blastomère a été injecté en affichant la fluorescence du traceur fluorescent sous un stéréomicroscope à 1X (pour voir l'embryon entier) et 5X (pour voir rein) grossissement. Placer les embryons dans une plaque de verre multi-bien avec le nouslls remplis 1x PBT à l'aide d'une pipette de transfert avec la pointe coupée. Manipuler les embryons avec une boucle de cheveux. Utiliser uniquement les embryons qui ont la co-injecté traceur présent dans le pronéphros sur le côté gauche de l'embryon (figure 3C, et la figure 4C F, F) pour une surexpression du gène ou de l' analyse knock - down.
  2. Vous pouvez également effacer les embryons dans Murray Effacer (2 parties de benzoate de benzyle: 1 partie alcool benzylique) en plaçant les embryons dans un flacon en verre et remplir le flacon avec Murray Clear. Visualisez les embryons en utilisant une plaque de puits de verre.
    Remarque: Murray Clear est un solvant organique, et doit être manipulé avec précaution. Porter des gants, et utiliser uniquement des flacons en verre et pipettes avec Murray Clear.
  3. embryons Conserver à 4 ° C dans 1x PBT pendant 2 - 3 semaines. Pour le stockage à long terme des embryons, les embryons déshydrater en lavant deux fois dans 100% de methanol à la température ambiante pendant 10 min. Conserver les embryons à -20 ° C dans 100% de méthanol.

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Résultats

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Microinjections de 4 et 8 cellules d' embryons de xénope avec MEM-RFP ARNm montrent différents niveaux de ciblage pour les pronéphros. La figure 4 montre la scène 40 embryons avec des motifs appropriés d'expression de l' ARNm MEM-DP. Les embryons ont été injectés dans le blastomère ventral gauche (figure 4A), et triés pour le motif d'expression correcte du MEM-DP ARNm. En plus d'exprimer MEM-RFP dans le proximal, intermédiaire, distale et relian...

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Discussion

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Cibler les pronéphros de développer des embryons de xénope repose sur l' identification et l' injection de la bonne blastomère. L' injection de la blastomère V2 des embryons à 8 cellules cible les pronéphros gauche 18. Cela laisse les pronéphros controlatérale droite comme un contrôle interne. Si morpholino knockdown ou d'ARN surexpression est utilisé pour modifier le développement du rein, les pronéphros controlatérale droite peuvent être utilisés pour comparer les effets de knockdow...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par un National Institutes of Health subvention NIDDK (K01DK092320) et le financement de démarrage du département de pédiatrie à l'Université du Texas Medical School McGovern.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodiumFisherS271-3
Chlorure de potassiumFisherP217-500
Sulfate de magnésiumFisherM63-500
Chlorure de calciumFisherC79-500
HEPESFisherBP310-500
EDTAFisherS311-500
Solution de gentamycine, 50 mg/mlAmrescoE737-20ML
L-cystéine, 99 %+Acros Organics52-90-4
FicollFisherBP525-100
Boîte de Pétri 100 mm x 15 mmFisherFB0875712
Mini Fridge IIBoekel260009Incubateur de paillasse pour embryons.
Gap43-RFPPour la fabrication de l’ARN traceur. Réf. : Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10 000 M.W.InvitrogenD1817Tracer.
Qualité biologie moléculaire, USP eau purifiée stérileCorning46-000-CI
Tubes de remplacement Drummond 7Aiguilles de micro-injectionDrummond3-000-203-G/XL
Extracteur d’aiguilleSutter InstrumentsP-30
Pince fineDumont11252-30Pour casser la pointe de l’aiguille de microinjection.
Micro-injecteurNanoject IIDrummond3-000-204
Huile minérale, lourdeFisherCAS 8042-47-5Huile pour aiguilles.
27 G Aiguille hypodermique monojectCovidien8881200508Pour charger l’huile minérale dans l’aiguille de micro-injection.
Seringue Luer-LokBDde309646 Pour charger l’huile minérale dans l’aiguille de micro-injection.
Boîte de Pétri 60 mm x 15 mmFisherFB0875713A
800 microns Maille polyesterPetites piècesCMY-0800-C
Pipettes de transfertFisher13-711-7MPour le transfert d’embryons. Coupez l’embout pour que les embryons soient facilement absorbés par la pipette.
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsNest Biotechnology
MOPSFisherBP308-500
EGTAAcros Organics67-42-5
FormaldéhydeFisherBP531-500
15 mm x 45 mm Flacon à visFisher03-339-25BPour fixer, colorer et stocker les embryons.
Cellule à 24 puits Plaque de cultureNest Biotechnology
BenzocaineSpectrumBE130
EthanolFisherBP2818-4
MéthanolFisherA412-4
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x poudreFisherBP661-50
Albumen sérique bovinFisherBP1600-100
Triton X-100FisherBP151-500
Mini rocker 3D, modèle 135Denville Scientific57281
Sérum de chèvre, origine néo-zélandaiseInvitrogen16210064
Azoture de sodiumFisherS227I-25
Anticorps monoclonal 3G8Centre de ressources européen sur le xénope Tubules.
Anticorps monoclonal 4A6européen de ressources sur le xénopeAnticorps primaire pour marquer les tubules intermédiaires, distaux et connectants.
anticorps anti-RFP pAb, IgG purifiés/MBLPM005de lapin Anticorps primaire pour marquer le traceur Gap43-RFP.
Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgGLife TechnologiesA11001Anticorps secondaire pour marquer les tubules rénaux.
Alexa Fluor 555 chèvre anti-lapin IgGLife TechnologiesA21428Anticorps secondaire pour marquer le traceur Gap43-RFP.
9 Plaque de cavitéCorning7220-85
Benzyl benzoateFisher105862500Facultatif - pour éliminer les embryons
Alcool benzyliqueFisherA396-500Facultatif - pour éliminer les embryons
Plasmide " .. 5 ml Anticorps primaire à marquer proximal Centre

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84(2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

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