Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour cribler et caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Le test de diffusion sur microlames et le test de libération de colorant utilisent des substrats bactériens cibles pour l’évaluation qualitative et quantitative de l’activité enzymatique.

Résumé

Les évaluations initiales de grandes banques microbiennes pour des producteurs potentiels de nouvelles protéines antimicrobiennes nécessitent des méthodes qualitatives et quantitatives pour dépister les enzymes cibles avant d’investir davantage d’efforts de recherche et de ressources. L’objectif de ce protocole est de démontrer deux essais complémentaires pour la réalisation de ces évaluations initiales. Le test de diffusion sur microlames fournit un criblage de détection initial ou simple pour permettre l’évaluation qualitative et rapide de l’activité protéolytique contre un éventail de substrats cibles bactériens viables et tués par la chaleur. En contrepartie, la sensibilité et la reproductibilité accrues de l’essai de libération de colorant fournissent une plate-forme quantitative pour évaluer et comparer les influences environnementales affectant l’activité hydrolytique des antimicrobiens protéiques. La possibilité de marquer des substrats spécifiques de culture cellulaire tués par la chaleur avec le colorant R bleu brillant Remazol élargit cette capacité à adapter le test de libération de colorant pour caractériser l’activité enzymatique d’intérêt.

Introduction

Les agents antimicrobiens jouent un rôle essentiel dans le ciblage d’un large éventail de micro-organismes tels que les virus, les champignons et les bactéries. Les activités antimicrobiennes produites par diverses bactéries varient en termes de spécificité cible, allant d’un large spectre à une espèce, y compris des agents pathogènes bactériens cliniquement pertinents ¹. Dans la nature, les composés protéiques antimicrobiens comme les bactériocines et les lysines représentent un arsenal microbien d’outils d’autodéfense, de réplication et d’acquisition de nutriments ^2,3. Servant de médiateurs de la dynamique des populations au sein des communautés microbiennes, les antimicrobiens protéiques offrent un avantage concurrentiel à l’organisme producteur par rapport aux espèces sensibles non productrices ⁴. En tant qu’enzymes recombinantes et probiotiques, ces protéines ont également une importance économique et sociétale, car le besoin de nouvelles sources de contrôle des agents pathogènes augmente à chaque nouvelle expansion de la résistance aux antimicrobiens au sein de la population bactérienne ⁵.

Les premières évaluations des antimicrobiens protéiques nouvellement découverts comprennent la détermination des caractéristiques physiques de base inhérentes à l’enzyme. Les méthodes de criblage rapide d’antimicrobiens potentiels permettent de sélectionner des candidats ayant des activités hydrolytiques contre les substrats cibles souhaités. Le test de diffusion sur microlames et le test quantitatif de libération de colorant permettent d’utiliser une variété de substrats dans la détection de l’hydrolyse enzymatique. Pour les enzymes antimicrobiennes protéiques ayant une activité contre la paroi cellulaire bactérienne, la polyvalence de ces tests permet un dépistage qualitatif et quantitatif rapide et efficace contre des cellules bactériennes viables (test de microlames uniquement), des substrats de cellules bactériennes entières tués par la chaleur ou du peptidoglycane purifié de la bactérie cible. Ces tests ont une utilité dans la découverte d’enzymes antimicrobiennes pour une utilisation dans des domaines tels que les thérapies alternatives, les compléments alimentaires et les inhibiteurs de la production de biofilms.

L’essai de diffusion sur microlames et l’essai de libération de colorant sont des méthodes éprouvées pour la détection et la caractérisation de nouveaux antimicrobiens protéiques. Le test de diffusion sur microlames fournit une estimation relative (qualitative) de l’activité antimicrobienne et permet une inférence minimale de la concentration et de l’activité enzymatiques. En utilisant cette méthode, l’activité est facilement visualisée comme le développement d’une zone de lyse, l’absence d’activité entraînant une absence de formation de zone. Le taux de développement de la zone et le diamètre de la zone sont indicatifs de la quantité et de la pureté de l’enzyme présente dans l’échantillon ; Cependant, ce taux et la qualité de l’éclaircissement du substrat dans la zone peuvent également être affectés par la présence de contaminants, l’exhaustivité de la réaction d’hydrolyse et le type de substrat. Les contaminants interférents peuvent affecter le taux de diffusion des enzymes à partir du puits, tandis qu’une hydrolyse incomplète ou une variation du type de substrat peut entraîner une zone trouble de lyse ⁶.

Le test de libération de colorant évalue quantitativement la quantité de produits colorants Remazol brilliant blue R liés de manière covalente libérés dans le surnageant de réaction à partir du substrat hydrolysé enzymatiquement. La méthode ne présente qu’une légère variabilité associée à une différence de substrat, ce qui permet une plus grande sensibilité pour la détection de l’hydrolyse par rapport au test de diffusion sur microlames. Ces propriétés permettent à la méthode d’être utile dans la caractérisation des propriétés biochimiques de l’enzyme et dans la normalisation de l’essai pour la comparaison entre différentes enzymes antimicrobiennes.

Dans ce protocole, nous fournissons des méthodes pour effectuer le test de diffusion de base sur microlames et le test de libération de colorant, tout en démontrant l’échelle des limites de détection et la variabilité pour chacun. Les tests sont utilisés pour effectuer des évaluations de base d’une protéine antimicrobienne inconnue purifiée à partir du surnageant de culture d’un isolat bactérien de sol non caractérisé. Les activités observées contre les substrats cellulaires bactériens dans les essais permettent de comparer les activités de réaction entre une protéine antimicrobienne non caractérisée auparavant et la α-chymotrypsine, une enzyme protéolytique témoin. Ces protocoles fournissent une base pour l’application des deux techniques qui peuvent être étendues et modifiées pour s’adapter à des applications variées.

Protocole

1. Préparation de bactéries et de peptidoglycane Substrats

Nota: Les substrats bactériens de cellules entières et des peptidoglycanes purifiés sont utilisés comme substrats d'enzymes, tant dans le test de diffusion de la microplaque et le dosage de colorant à libération prolongée. Ces substrats doivent être préparés avant la réalisation des réactions enzymatiques. Le protocole suivant décrit leur préparation.

1. Whole Bacterial cellulaire Substrat
   1. Produire le substrat cellulaire bactérienne en inoculant 500 ml de bouillon nutritif avec 2 ml de culture d'une nuit de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incuber à 30 ° C sous agitation (125 tpm) jusqu'à ce que la culture atteigne une phase de croissance exponentielle, définie comme une phase de croissance rapide entraîne le doublement de la culture bactérienne. Pour la culture de Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), en utilisant un bouillon nutritif en tant que milieu de croissance à 37 ° C sous agitation (125 tpm).
   2. Heat-tuer chaque culture par autoclavage pendant 10 min à 121 ° C sous 3 atm de pression.
   3. Récolter le substrat bactérien tué par la chaleur par centrifugation pendant 20 min à 5000 x g. Laver le culot trois fois avec de l'eau de type 1 et remettre en suspension dans une quantité minimale d'eau. Dans cette étude, suspendre les substrats dans 1200 ul.
   4. Aliquoter 300 pi des substrats de cellules bactériennes à 1,5 ml microtubes et conserver à 20 ° C.
2. Substrat peptidoglycane Purifié
   1. Purifier peptidoglycane de la bactérie du substrat cible ^7-10 ou acquérir auprès d' un fournisseur (voir Matériaux et tableau Équipement). Purifier préparations brutes de peptidoglycane accessoires polymères de la paroi cellulaire.

2. Qualitative Microslide Diffusion Assay [Modifié à partir de Lachica, et al. ^11]

Note: Le test de diffusion de la microplaque estune méthode qualitative pour détecter la présence d'une enzyme antimicrobienne dans un échantillon. Que l'enzyme se diffuse à travers un substrat de matrice contenant de l'agarose, une zone de dégagement se développe comme l'enzyme hydrolyse le substrat. Le protocole suivant décrit la préparation et l'exécution de l'essai de diffusion de la microplaque pour détecter qualitativement la présence d'antibiotiques de protéines.

1. Déterminer la concentration de l'enzyme antimicrobienne être évaluée en utilisant un kit d'acide bicinchoninique (BCA) Protein Assay selon le protocole du fabricant.
2. Utiliser un tampon phosphate salin (PBS) comme tampon d'enzyme; cependant, de déterminer empiriquement le tampon approprié pour l'enzyme donnée.
3. Effectuer une dilution en série de l'enzyme antimicrobienne en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) comme tampon de réaction. La dilution en série utilisé dans ces essais de diffusion MicroSlide produit finaux masses de protéines de dosage de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg et 10 pg par volume réactionnel.
4. Distribuer masses protéiques dans des tubes de microcentrifugation individuels et ajuster les volumes de protéines à 20 pi en utilisant PBS en préparation pour l'addition à MicroSlide puits de réaction.
5. Préparer une solution d'agarose à 0,5% par dissolution de 0,25 g d'agarose dans 50 ml de PBS. Chauffer la solution à ébullition jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous. Déterminer l'eau perdue pendant le processus de fusion en poids et rajouter à la solution.
6. Ajouter 50 ul d'azide de sodium à 10% dans de l'eau à la solution d'agarose et d'ajuster la température de la solution à 50 ° C dans un bain d'eau. L'azoture de sodium est ajouté pour inhiber la croissance des bactéries contaminantes pendant l'incubation du test de diffusion de la microplaque. Si les cellules viables sont utilisées comme substrat, omettre l'azoture de sodium de la solution d'agarose.
7. Décongeler le substrat bactérien tué par la chaleur sur la glace.
8. Remettre en suspension le substrat bactérien dans 12 ml de solution d'agarose à environ répondant à la turbidité d'un 2,0 McFarland équivalence standard (voir tableau Matériaux). Comparez les turbidités des solutions en visualisant une ligne noire sur un fond blanc à travers les solutions, en ajoutant substrat bactérienne à l'agarose jusqu'à ce que la turbidité approximative est obtenue.
9. Pipeter immédiatement 3 ml de la solution d' agarose-substrat pour chaque microplaque (25 x 75 x 1 mm ^3).
10. Après diapositives solidifient, punch trois puits dans la couche d'agarose-substrat de chaque microplaque en utilisant un perce-bouchon (diamètre 4,8 mm). Ajouter 20 pi de chaque protéine dilution en série ajustée à leurs puits respectifs.
11. En utilisant du PBS (20 ul) ou l'albumine sérique bovine (5 ug dans 20 ul de PBS) dans un puits témoin négatif. Utiliser des enzymes bactériolytiques connues appropriées pour le substrat, tel que le lysozyme, comme témoin positif.
12. Incuber la lame dans une chambre humide à 37 ° C ou la température d'activité optimale de l'enzyme. La durée d'incubation dépend de la concentration etl'activité spécifique de l'enzyme antimicrobienne. Une durée de réaction typique est d'une nuit (environ 16 h).
13. Après incubation, observer les glisse sous les images de lumière et de capture indirectes de l'essai en développement à l'aide d'un appareil photo reflex mono-objectif numérique avec une lentille de 60 mm à une distance focale d'environ 30 cm.
    Note: L'activité enzymatique de la protéine antimicrobienne pour le substrat donné est en corrélation avec le développement d'une zone claire d'hydrolyse, qui se forme autour du puits que l'enzyme se diffuse dans la gélose.
14. Pour être admissible à l'activité enzymatique, observer les tailles des zones qui se forment autour de chaque puits. Une forte activité enzymatique concerne qualitativement à une zone plus grande, alors que la faible activité enzymatique concerne qualitativement à une zone plus petite.

3. Substrat Étiquetage - Remazol Brilliant Blue R Dye Étiquetage [modification de Zhou ^12]

Remarque: Dans l'essai de colorant à libération, le substrat est de façon covalente linked à remazol brillant R colorant bleu. Le protocole suivant décrit la préparation de substrats d'enzymes teints.

1. Faire un hydroxyde de sodium 250 mM (NaOH) en dissolvant NaOH 1 g dans 99 ml d'eau de type I à utiliser pour faire un 200 mM Remazol brillant R colorant bleu (RBB) solution.
2. Faire une solution mM RBB 200 en dissolvant 1,25 g RBB dans 98,75 ml ± 1 ml d'une solution de NaOH mM frais 250 (étape 3.1).
3. Re-suspendre les cellules bactériennes tuées par la chaleur à une concentration de 0,5 g de poids humide dans 30 ml de solution RBB. Pour peptidoglycane purifié, re-suspendre le peptidoglycane à une concentration de 0,3 g de poids humide dans 30 ml de solution RBB.
4. Incuber le mélange réactionnel dans un erlenmeyer sur une plateforme rotative pendant 6 heures à 37 ° C avec agitation douce.
5. Transférer le mélange réactionnel à un incubateur à 4 ° C, et laisser incuber pendant une 12 heure supplémentaire sous agitation douce.
6. Après incubation, récolter le substrat teint par centrifugation à 3000 xgpendant 30 min. Décanter la solution de colorant à partir de la pastille de substrat.
7. Éliminer le colorant non soluble lié de manière covalente à partir des substrats en lavant les cellules ou le peptidoglycane marqués par un colorant à plusieurs reprises (environ 3 à 5 lavages) avec de l'eau de type I suivie d'une centrifugation. Avec chaque addition d'eau, re-suspendre complètement la pastille.
   Remarque: lorsque non lié, colorant soluble est plus visible dans l'eau de lavage après centrifugation. Le substrat doit être donné un lavage supplémentaire. Notez que le substrat restera bleu, tandis que le surnageant du dernier lavage sera clair.
8. Stocker les substrats teints en suspension dans une quantité minimale d'eau à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. Quantitative Dye-release Assay

Note: Au cours de l'essai de colorant à libération, l'hydrolyse du substrat RBB-teinte dans la réaction de presse enzymatiques produits teints dans le surnageant de réaction. mesure colorimétrique de la quantité de colorant libéré indique le amount de l'activité enzymatique présente dans l'échantillon pour une enzyme donnée. La méthode quantitative permet la comparaison des différentes enzymes à travers des substrats et permet une variation des conditions environnementales qui influencent la réaction enzymatique (par exemple, la température, la salinité et le pH). Le protocole suivant décrit la préparation et l'exécution de l'essai de colorant à libération pour détecter quantitativement l 'activité enzymatique des antimicrobiens de protéines.

1. Préparation du colorant à libération Assay
   1. Laisser le substrat coloré congelé pour revenir à la température ambiante et laver deux fois avec du tampon d'essai (PBS), qui est déterminée de manière empirique pour l'enzyme donnée.
   2. Calculer le volume de substrat, la suspension dont on a besoin en multipliant le volume de réaction de 200 ul par le nombre de colorant tests de libération doit être effectuée.
   3. Préparer la suspension de substrat en ajoutant substrat coloré au volume de tampon de dosage, déterminé 4.1.2, jusqu'à ce qu'une densité optique (DO) de 2,0 est atteint à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre. Pour rester dans les limites fonctionnelles du spectrophotomètre, mesurer le 2.0 OD ₅₉₅ 1,0 pour une dilution 1: 1 de la solution concentrée. Utilisez le tampon d'essai comme un blanc.
      Remarque: La turbidité de substrat pour la réaction peut être augmentée au-delà de 2.0 pour faire correspondre les niveaux d'enzymes très efficaces d'activité.
   4. Suspendre l'antimicrobienne de la protéine devant être évaluée dans un tampon d'essai à une concentration d'environ 1 mg / ml.
   5. En utilisant l'essai sur microplaque d'un kit de dosage BCA Protein selon le protocole du fabricant, de déterminer la concentration réelle de l'échantillon de protéine à doser. Ajuster la concentration de la suspension de pâte à 1 mg / ml en utilisant un tampon d'essai.
2. Utilisation du colorant à libération dosage pour déterminer les Conditions d'incubation optimales pour une protéine antimicrobienne
   1. Diluer la suspension antimicrobienne de la protéine du stock à 100 ng / pl. Cette concentration donne afmasse réactionnelle inale de 1 ug de protéine par unité de volume (10 ul) a été ajouté à la réaction d'essai.
   2. Déterminer la gamme thermique à évaluer pour la protéine bactériolytique. La plage thermique comprise dans ces essais 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C et 65 ° C.
   3. Effectuer les essais de réaction dans 0,5 ml microtubes. Pour chaque condition thermique, ajouter 10 pi de la protéine du stock à 200 pi de suspension préparée de substrat.
   4. Incuber dans un cycleur thermique pendant 8 heures avec mélange par inversion une fois par heure.
   5. Après incubation, arrêter les réactions en ajoutant 25 pi d'éthanol.
   6. Retirer digérées, substrat insoluble par centrifugation à 3000 g pendant 2 min, et transférer 150 pi du surnageant de réaction pour chaque mélange réactionnel à une microplaque de 96 puits à fond plat, en prenant soin de ne pas perturber le culot de substrat non digérés.
   7. Mesurer l'activité enzymatique de la protéine Antimicrobial du substrat donné en déterminant la quantité de colorant soluble dans RBB dissocie du substrat après l'hydrolyse enzymatique. Pour quantifier l'activité enzymatique, mesurer l'absorbance du surnageant à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre de microplaque. Augmentation de l'absorbance par le colorant soluble libérée dans le surnageant à partir du substrat marqué est une mesure quantitative de l'activité enzymatique.
      Remarque: Le changement d'absorbance est représentée par des unités d'activité (UA), où 1 résultats UA à une augmentation de 0,01 dans la densité optique du colorant à libération réaction surnageant à 595 nm. Une réaction à blanc, mis en incubation avec tous les composants réactionnels à l'exception enzyme est utilisée pour soustraire tout colorant qui libère du substrat RBB marqué en raison de l'incubation. La température optimale enzymatique fournit la mesure de l'unité d'activité de pointe.
   8. Répéter les étapes 4.2.1 à 4.2.7 en utilisant divers tampons d'incubation, pour déterminer les conditions optimales de tampon pour l'enzyme antimicrobienne. en tdes dosages es, utilisent du PBS.
3. Utilisation du colorant à libération dosage pour déterminer la concentration active minimale à la température optimale d'incubation pour une protéine antimicrobienne
   1. Effectuer une dilution en série du stock antimicrobien suspension de protéines en utilisant un tampon de dosage. La gamme de séries de dilution variera avec l'activité de l'enzyme antimicrobienne. La dilution en série utilisé dans ces essais a produit des quantités finales de protéines de dosage de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 pg et 10 pg.
   2. Effectuez chaque essai de réaction dans une microplaque de fond 48 puits plat. Pour chaque condition d'essai, ajouter 10 ul de la suspension de protéine respective à 200 pi de la suspension préparée de substrat. Régler toute variation de volume de la solution ajoutée à la réaction de 10 ul en utilisant un tampon de réaction de la protéine.
   3. Sceller la microplaque avec un film plaque d'étanchéité pour éviter la variation de volume due à l'évaporation. Incuber dans un incubateur agitateur à la valeur optimale déterminée entempérature cubation pour la protéine donnée antimicrobien pendant 16 heures avec agitation.
   4. Après incubation, arrêter la réaction en ajoutant 25 pi d'éthanol à chaque puits et retirer le substrat non digéré par centrifugation à 3000 g pendant 2 min.
   5. Transférer 150 pi du surnageant de réaction pour chaque mélange réactionnel à une microplaque de 96 puits à fond plat, en prenant soin de ne pas perturber le culot du substrat non digéré.
   6. Pour quantifier l'activité enzymatique, mesurer l'absorbance du surnageant à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre de microplaque. Une réaction à blanc, mis en incubation avec tous les composants réactionnels à l'exception enzyme est utilisée pour soustraire tout colorant qui libère du substrat RBB marqué en raison de l'incubation. Augmentation de l'absorbance par le colorant soluble libérée dans le surnageant à partir du substrat marqué fournit une mesure quantitative de l'activité enzymatique.
      Remarque: Le changement d'absorbance est représentée par les unités d'activité (UA), où 1 résultats UA àune augmentation de 0,01 de densité optique du colorant à libération réactionnel surnageant à 595 nm.

Résultats

Le test de diffusion de microplaque et dosage quantitatif de colorant de presse sont des méthodes efficaces pour le dépistage et la mesure des enquêtes initiales de nouveaux antimicrobiens de protéines. Chaque essai a des avantages et des limites; Cependant, lorsqu'elle est effectuée conjointement, ils permettent le dépistage rapide initial et la caractérisation de base d'un antimicrobien.

L'essai de diffusion de la microplaque permet efficacement le criblage rapide de banques microbiennes, produisant des antimicrobiens protéiques. Lorsque les niveaux de concentration de l'enzyme sont particulièrement préoccupantes, la sensibilité de détection de contraintes peut limiter l'essai, ce qui nécessite une plus grande quantité d'enzyme doit être ajoutée à la réaction ainsi que le dosage de colorant à libération prolongée. Comme cela est illustré sur la figure 1, les propriétés qualitatives du dosage permet à l'observateur de comparer les quantités d'enzyme par rapport présentes dans chaque puits.

figure 1A (25 ug d'enzyme), le bord d' attaque de la zone affiche une lyse turbide ou incomplète du substrat, tandis que la zone la plus proche du puits affiche une lyse de substrat plus complète. Ce phénomène, d'un produit de la concentration décroissante de l'enzyme diffusant au niveau du bord d'attaque, complique la mesure précise du diamètre de la zone. Étant donné que les puits B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), E (1,0 ug) et F (0,1 ug) sont observées sur la figure 1, le diamètre de la zone de lyse complète se dissipe à l' extinction en corrélation avec la quantité réduite d'enzyme. Pour connaître l'état F (0,1 ug), la concentration d'enzyme à l'intérieur de l'agarose est inférieure à la limite qui permet la diffusion de l'enzyme devant être visualisé comme il se déplace à travers l'agarose, de l'hydrolyse du substrat. Le test de diffusion de microplaque a également été exécuté à l' aide de Bacillus subtilis purifiées Peptidoglycan comme substrat (Figure 2). Tandis que la zone définie est inférieure à celle observée avec les cellules entières Salmonella enterica en raison de la réticence des peptidoglycane de suspension uniformément dans l'agarose, l'hydrolyse du peptidoglycane par l'enzyme inconnue antimicrobien est manifeste.

Le dosage de colorant à libération est un test plus sensible et polyvalent que le test de diffusion de microplaque, permettant une limite inférieure de détection et la variation des facteurs environnementaux qui influent sur la réaction enzymatique. Dans les dosages représentatifs, on a fait varier la température pour déterminer la température optimale pour l'enzyme antimicrobienne, déterminée à 35 ° C dans du PBS (figure 3). Cet optimum est clairement visible dans le surnageant de la réaction que l' augmentation des quantités de couleur bleue (figure 3B), ainsi que représenté en unités d'activité dérivées de mesures d'absorbance à 595 nm (figure 3A). lela polyvalence de l'essai de colorant libération permet au chercheur de faire varier non seulement la température mais aussi le tampon de réaction et les composants du tampon afin de déterminer rapidement les conditions d'incubation optimales pour une enzyme donnée.

Le niveau de l'enzyme inconnue antimicrobien (figure 4) et le contrôle de l' enzyme α-chymotrypsine (figure 5) L' activité a été mesurée à la température d'incubation optimale déterminée de 35 ° C dans du PBS contre le substrat tué par la chaleur de Bacillus subtilis RBB- marqué. La comparaison des résultats de la figure 4 et la figure 5 montre que l'enzyme antimicrobienne inconnu a presque le double de l'affinité pour le B. substrat subtilis. En outre, le contrôle α-chymotrypsine n'a pas digérer complètement le B. tué par la chaleur subtilis substrat à l' intérieur du puits (données non présentées). L'activité de la commande d'α-chymotrypsine commence à se plaquerAu environ 0,3 ug par rapport à l'augmentation constante des unités d'activité pour tous les quantités d'enzyme pour l'enzyme antimicrobienne inconnue (figure 4 et figure 5). Ceci peut indiquer que l'enzyme possède une activité inconnue constante supérieure ou qu'il existe un plus grand nombre de sites de clivage à la disposition de l'enzyme au sein de l'B. substrat subtilis.

Figure 1:. Activité enzymatique contre Salmonella enterica cellules entières substrat Le test de diffusion de microplaque est utilisé pour évaluer qualitativement l'activité d'une protéine inconnue antimicrobienne contre Salmonella enterica subsp enterica tué par la chaleur (ATCC 10708).. Les masses protéiques de l'agent antimicrobien inconnu en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), qui ont été ajoutés dans les puits respectifs deles diapositives inclus 25 ug (puits A), 15 ug (puits B), 10 ug (bien C), 5 ug (bien D), 1 pg (bien E), et 0,1 ug (bien F). PBS seul a été utilisé pour les témoins négatifs des essais. Les zones de lyse ont été imagées après une incubation de 6 h. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:. Enzyme Activité contre Bacillus subtilis cellulaire peptidoglycane mur L'essai de diffusion de la microplaque a été utilisé pour évaluer qualitativement l'activité d'une protéine inconnue antimicrobienne contre peptidoglycane de Bacillus subtilis 168. En suspension dans 20 ul de PBS, 10 pg de l'agent antimicrobien inconnu a été ajouté au puits A des microplaques. PBS seul a été utilisé comme négatifle contrôle pour le dosage (puits B). La zone de lyse a été imagée après une incubation de 6 heures à 37 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3:. Optimale Température de réaction pour une protéine antimicrobienne La polyvalence du dosage de colorant libération permet à la variation des paramètres physiques et chimiques, telles que des températures d'incubation et des tampons, pour déterminer leur influence sur l'activité de l'enzyme d'intérêt ^6. Comme cela est illustré sur cette figure, l'activité de la protéine antimicrobienne inconnue (1 pg) a été évaluée dans du PBS contre RBB marquées Bacillus subtilis tuées par la chaleur dans une gamme de températures d'incubation. Affiché comme unités d'activité (UA) en (A), l'absorbance de RBB-bound produits libérés dans le surnageant après hydrolyse a été mesurée à 595 nm en utilisant un spectrophotomètre de microplaque. À chaque condition de température, les réactions sans enzyme ajoutée ont été utilisés pour soustraire les effets d'un colorant libéré résultant de l'incubation à différentes températures. Les surnageants de réaction correspondant à chaque température d'incubation ont été imagées avant la mesure d'absorbance (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4:. Gamme d'activité pour une protéine antimicrobienne La gamme d'activité pour l'antimicrobien de protéine inconnue a été mesurée en unités d'activité après incubations nuit pour 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, et 1000 ng telle que mesurée par la prot BCAein essai (A). Pour ces réactions, le RBB marqué B. niveau du substrat subtilis a été augmentée pour donner une densité optique de 5,0 à 595 nm pour assurer que la réaction avec la plus grande quantité d'enzyme (1000 ng) n'a pas hydrolyser complètement tout substrat disponible dans la période d'incubation de la réaction. Les réactions témoins sans enzyme ajoutée ont été utilisés pour soustraire les effets d'un colorant libéré provoquée par l'incubation seul. Les surnageants de réaction correspondant à chaque quantité d'enzyme ont été imagées avant des mesures d'absorbance (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5:. Gamme d'activité pour α-chymotrypsine La gamme d'activité pour α-chymotrypsine a été mesurée comme activunités Ity après des incubations d'une nuit à 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 et 1000 ng d'enzyme (A). Pour ces réactions, le RBB marqué B. niveau du substrat subtilis a été augmentée pour donner une densité optique de 5,0 à 595 nm pour assurer que la réaction avec la plus grande quantité d'enzyme (1000 ng) n'a pas hydrolyser complètement tout substrat disponible dans la période d'incubation de la réaction. Les réactions témoins sans enzyme ajoutée ont été utilisés pour soustraire les effets d'un colorant libéré provoquée par l'incubation seul. Les surnageants de réaction correspondant à chaque quantité d'enzyme ont été imagées avant des mesures d'absorbance (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le test de diffusion de microplaque et le test de colorant à libération offrent des avantages pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens de protéines non identifiés auparavant. Ces méthodes rapides et sensibles permettent le criblage à haut débit de banques de source organisme pour l'identification des enzymes d'intérêt avant d'investir des ressources plus importantes de recherche. En tant que haut niveau des enzymes cibles sont identifiées, les variations des dosages de détection peuvent être utilisés pour détecter rapidement l'enzyme ou de déterminer les caractéristiques biochimiques de l'enzyme. Par exemple, au cours d'un procédé de purification de la protéine en plusieurs étapes, le dosage de la diffusion de la microplaque peut détecter rapidement les fractions contenant l'enzyme d'intérêt. En outre, les optima de réaction pour l'enzyme peut être déterminée en modifiant les tampons de réaction et les températures d'incubation dans le dosage de colorant à libération prolongée.

La plage de masse enzyme nécessaire pour la détection dans le test de diffusion de la microplaque est une fonction de l'enzyme tystics. les limites de détection du dosage nécessitent généralement l'utilisation de quantités plus élevées d'enzyme que le dosage de colorant à libération prolongée. Dans cette étude, la comparaison des limites de détection de l'essai de diffusion de la microplaque (figure 1) pour le dosage de colorant libération (figure 4) a démontré que le dosage de la diffusion de la microplaque est une technique moins sensible que le dosage de colorant à libération prolongée . Lorsque la concentration d'enzyme est pas une préoccupation, le dosage de microplaque permet le dépistage rapide initial des bibliothèques pour la production d'antimicrobiens de protéines contre les substrats cibles avec de faibles exigences de main-d'œuvre et d'équipement. Bien que nécessitant plus d'efforts et de l'équipement, le dosage de colorant à libération est plus sensible et reproductible, ce qui donne des résultats quantitatifs qui permettent la comparaison entre les dosages colorant libération des mêmes ou différentes enzymes pour un substrat donné. Les deux méthodes peuvent être facilement réalisées dans la plupart des laboratoires de microbiologie sans avoir besoin d'instruments hautement spécialisés. Dans le reprédes dosages tifs, l'enzyme de contrôle, α-chymotrypsine, a été détecté à des quantités aussi faibles que 100 ng (figure 5) en utilisant le dosage de colorant libération, tandis que la quantité minimale détectée dans l'essai de diffusion de la microplaque était de 1 ug (données non présentées).

Fournir une utilité comme un test de détection qualitative pour les enzymes antimicrobiennes, un certain nombre de variantes du test de diffusion ont été rapportés ^11,13. En examinant ces tests, le test de diffusion de microplaque a été développé pour sa sensibilité relativement élevée comme un écran initial et pour sa facilité de réaction observance. Modification du travail de Lachica et al. , ¹¹ dans lequel les superpositions d'agarose ont été utilisés pour détecter la production de nucléases par des souches de Staphylococcus aureus, l'essai de diffusion de la microplaque fonctionne de façon similaire à la méthode d'immunodiffusion radiale ¹⁴ que la protéine se diffuse à partir du puits dans la agarose contenant le substrat. Le immunodiffu radialProcédé sion arrête l'expansion de la zone d'immunoprécipitation lorsque le système atteint un équilibre de formation d'un complexe entre l'antigène et l'anticorps diffusant au sein de l'agarose. En revanche, le substrat de l'essai de diffusion de la microplaque est d'abord digéré par la protéine antimicrobienne de diffusion dans une zone d'expansion continue de la lyse entourant le puits. Le diamètre croissant de la zone continue jusqu'à ce que l'enzyme perd son activité ou le substrat est épuisé. Le taux de la production de la zone de lyse est accélérait comme la pureté et donc l'activité spécifique de l'enzyme ou de la concentration de l'enzyme ajoutée aux puits augmente.

Permettant d' évaluer quantitativement l'activité enzymatique des antibiotiques contre des protéines tuées par la chaleur B. subtilis, le dosage de colorant à libération a été choisi. essais colorimétriques utilisant Remazol bleu brillant R colorant (RBB) marqué à des substrats permettent d'évaluer polyvalent et sensible de la protéine activi antimicrobienty. L'hydrolyse enzymatique des résultats de substrat RBB marqués dans la libération des produits bleus solubles qui peut être facilement mesurée par un spectrophotomètre à 595 nm. Plusieurs variantes du RBB colorant test de libération, mis au point pour caractériser d'autres enzymes antimicrobiennes de protéines, montrent la souplesse de ce dosage pour une application avec d'autres substrats. Par exemple, pour déterminer les effets de la lysostaphine activité bactériolytique, Zhou et al., A rapporté un essai de colorant à libération en utilisant des cellules de staphylocoques RBB-teints et staphylococcique peptidoglycane comme substrats ^12. Dans une modification de l'application de ce RBB colorant test de libération, le substrat de Micrococcus luteus RBB marqué a été proposé pour être utilisé comme un moyen rapide et sensible pour diagnostiquer et dépister les maladies telles que l' infection bactérienne et la présence d'un carcinome malin, qui peut être corrélée au taux d'expression de lysozyme humain dans le sérum sanguin ^15. En outre, des substrats de cellules bactériennes RBB marquées ont unLSO été utilisé dans un procédé de zymogramme pour la détection de lysozyme ^16.

Nous démontrons la limite de détection abaissée, la commodité et la reproductibilité du dosage à libération de colorant, ce qui permet le criblage de banques rapide pour la production d'enzymes. Les modifications du dosage permettent des dosages quantitatifs en aval de la caractérisation biochimique, y compris les effets de la température, le pH et la salinité, ainsi que les effets d'autres enzymes protéolytiques sur l'activité des protéines antimicrobiennes ^6. En outre, le dosage quantitatif de colorant libération peut être utilisé pour comparer les activités des multiples enzymes pour un substrat donné. RBB colorant essai de libération a rapporté l'utilité pour des enzymes ayant une activité contre les polysaccharides, en plus de la caractérisation et la détection des protéines agents antimicrobiens. Pettersson et Eriksson ont rapporté un dosage pour détecter une activité endoglycanase utilisant amorphe, les perles de polysaccharide RBB-teintes de la cellulose, le xylane, le mannane, et chiten ^17. Dans une expansion de ces résultats, une méthode sensible pour la détection des enzymes chitinase produites par Bacillus thuringiensis Bt-107 a été développé en utilisant la chitine colloïdale marquée avec RBB ^18. A partir de ces études et d'autres sources de substrats RBB-teintes disponibles dans le commerce ont émergé pour une utilisation dans la détection de l'activité glycolytique, y compris ceux contre la kératine, l'amylopectine, l'amylose, le glycogène, la laminarine, d-xylane, glucane Azo-orge, et de l'amidon.

Dans cette étude, on démontre l'utilité du dosage de libération de colorant dans un format de microplaque, ce qui réduit le volume du substrat RBB marqué et l'enzyme nécessaire pour produire le résultat colorimétrique. Comme cela est illustré sur la figure 4 et la figure 5, la microplaque de colorant essai de libération fournit une limite inférieure de détection de l'essai de diffusion de la microplaque pour la détection d' une activité enzymatique. En ce qui concerne une utilisation rapide, la conservation de la main-d'œuvre, et la facilité d'interprétation, le microessai de diffusion roslide présente une utilité dans des criblages à haut débit initial pour détecter la présence de l'activité antimicrobienne, ainsi que l'indication de la présence de la protéine antimicrobienne dans l'isolement des protéines et des étapes de purification en aval. La combinaison de ces deux essais se complètent mutuellement dans le criblage et la caractérisation initiale ultime de nouveaux agents antimicrobiens protéiques

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microplaque à fond plat de 48 puits avec couvercle à faible évaporation	Becton Dickinson	3078
Microplaque à fond plat de 96 puits (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agarose	Fisher Scientific	BP162-100
&alpha ;-chymotrypsine	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
borer	Humboldt	H-9661
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Étalon d’équivalence McFarland (2.0)	Fisher Scientific	R20412
microlames	Fisher Scientific	22-38-103
bouillon nutritif	Fisher Scientific	S25959B
peptidoglycane de Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
solution saline tamponnée au phosphate (1x)	Teknova	P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit	Life Technologies	23227
Spectrophotomètre de microplaques Synergy HT	BioTek Instruments, Inc.
Remazol colorant R bleu brillant (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	Type Culture Collection	10708
azoture de sodium	Fisher Scientific	S227-100
hydroxyde de sodium (NaOH)	Fisher Scientific	S318-500
Titer Tops film de polyéthylène adhésif prédécoupé	Biotechnologie diversifiée	T-TOPS-50
Eau distillée ultra-pure	Invitrogen	10977-015
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
>Solution
solution d’agarose 50 ml PBS 0,25 g d’agarose			Ajouter 10 % d’azoture de sodium à la solution de PBS/agarose fondue
nutritif moyen 4 g de bouillon nutritif 500 ml d’eau de type I
de sodium (NaOH) 1 g de NaOH 99 ml d’eau de
type I200 mM de colorant R bleu brillant Remazol (RBB) 1,25 g RBB 98,75 ml 250 mM de solution