In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Wei Ding; Michelle E. Bishop; Lascelles E. Lyn-Cook; Kelly J. Davis; Mugimane G. Manjanatha

doi:10.3791/53833

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Article de méthode

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d' ADN et l' ADN oxydative dommages de foie de rat

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DOI :

10.3791/53833

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4 mai 2016

Wei Ding¹ , Michelle E. Bishop¹ , Lascelles E. Lyn-Cook¹ , Kelly J. Davis² , Mugimane G. Manjanatha¹

¹Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, ²Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

Dans cet article

Résumé

Le test des comètes alcalines mesure les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. En ajoutant une étape de digestion de l’endonucléase III ou de la 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase humaine, le test peut détecter efficacement les dommages oxydatifs à l’ADN. Nous décrivons les méthodes d’utilisation de ces tests pour détecter les dommages à l’ADN dans le foie du rat.

Résumé

Des dommages à l’ADN non réparés peuvent entraîner une instabilité génétique, ce qui peut à son tour favoriser le développement du cancer. Par conséquent, l’identification des agents potentiellement dommageables de l’ADN est importante pour protéger la santé publique. Le test in vivo sur les comètes alcalines, qui détecte les dommages à l’ADN sous forme de ruptures de brins, est particulièrement pertinent pour évaluer les dangers génotoxiques des xénobiotiques, car ses réponses reflètent l’absorption, la distribution tissulaire, le métabolisme et l’excrétion in vivo (ADME) des produits chimiques, ainsi que le processus de réparation de l’ADN. Comparé à d’autres tests in vivo sur les dommages à l’ADN, le test est rapide, sensible, visuel et peu coûteux, et, en convertissant les dommages oxydatifs à l’ADN en cassures de brins à l’aide d’enzymes de réparation spécifiques, le test peut mesurer les dommages oxydatifs à l’ADN de manière efficace et relativement exempte d’artefacts. La mesure des dommages à l’ADN avec le test de la comète peut être effectuée à l’aide de plans d’étude toxicologique aigus et subchroniques, et en intégrant le test de la comète à d’autres évaluations toxicologiques, le test répond aux exigences de bien-être animal en utilisant au maximum les ressources animales. Un autre avantage majeur des tests est qu’ils ne nécessitent qu’une petite quantité de cellules et que les cellules n’ont pas besoin d’être dérivées de populations cellulaires en prolifération. Les tests peuvent également être effectués avec une variété d’échantillons humains obtenus auprès de personnes cliniquement ou professionnellement exposées.

Introduction

Le test des comètes alcalines mesure les ruptures d'ADN au niveau d'une seule cellule. Les suspensions de cellules individuelles sont noyées dans agarose sur une lame de microscope et les cellules ont été lysées pour former nucléoïdes, qui contiennent des boucles surenroulées de l'ADN. Electrophorèse à pH> 13 résultats dans la perte de surenroulement dans des boucles d'ADN contenant la rupture des brins, les brins d'ADN libérés migrent vers l'anode, la création de structures de comète qui peuvent être observées par microscopie à fluorescence. ADN Fragmenté migre de la «tête» de la comète dans la «queue» en fonction de la taille du fragment, et....