Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d' ADN et l' ADN oxydative dommages de foie de rat

15.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/53833

⸱

4 mai 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

Dans cet article

Résumé

Le test des comètes alcalines mesure les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. En ajoutant une étape de digestion de l’endonucléase III ou de la 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase humaine, le test peut détecter efficacement les dommages oxydatifs à l’ADN. Nous décrivons les méthodes d’utilisation de ces tests pour détecter les dommages à l’ADN dans le foie du rat.

Résumé

Des dommages à l’ADN non réparés peuvent entraîner une instabilité génétique, ce qui peut à son tour favoriser le développement du cancer. Par conséquent, l’identification des agents potentiellement dommageables de l’ADN est importante pour protéger la santé publique. Le test in vivo sur les comètes alcalines, qui détecte les dommages à l’ADN sous forme de ruptures de brins, est particulièrement pertinent pour évaluer les dangers génotoxiques des xénobiotiques, car ses réponses reflètent l’absorption, la distribution tissulaire, le métabolisme et l’excrétion in vivo (ADME) des produits chimiques, ainsi que le processus de réparation de l’ADN. Comparé à d’autres tests in vivo sur les dommages à l’ADN, le test est rapide, sensible, visuel et peu coûteux, et, en convertissant les dommages oxydatifs à l’ADN en cassures de brins à l’aide d’enzymes de réparation spécifiques, le test peut mesurer les dommages oxydatifs à l’ADN de manière efficace et relativement exempte d’artefacts. La mesure des dommages à l’ADN avec le test de la comète peut être effectuée à l’aide de plans d’étude toxicologique aigus et subchroniques, et en intégrant le test de la comète à d’autres évaluations toxicologiques, le test répond aux exigences de bien-être animal en utilisant au maximum les ressources animales. Un autre avantage majeur des tests est qu’ils ne nécessitent qu’une petite quantité de cellules et que les cellules n’ont pas besoin d’être dérivées de populations cellulaires en prolifération. Les tests peuvent également être effectués avec une variété d’échantillons humains obtenus auprès de personnes cliniquement ou professionnellement exposées.

Introduction

Le test des comètes alcalines mesure les ruptures d'ADN au niveau d'une seule cellule. Les suspensions de cellules individuelles sont noyées dans agarose sur une lame de microscope et les cellules ont été lysées pour former nucléoïdes, qui contiennent des boucles surenroulées de l'ADN. Electrophorèse à pH> 13 résultats dans la perte de surenroulement dans des boucles d'ADN contenant la rupture des brins, les brins d'ADN libérés migrent vers l'anode, la création de structures de comète qui peuvent être observées par microscopie à fluorescence. ADN Fragmenté migre de la «tête» de la comète dans la «queue» en fonction de la taille du fragment, et la fluorescence relative de la queue de la comète par rapport à l'intensité totale (de la tête et de la queue) peut être utilisé pour quantifier l' ADN rupture 1 , 2. Le test est simple, sensible, polyvalent, rapide et relativement peu coûteux 1. La détection d'ADN fragmenté causées par des agents endommageant l'ADN est utilisé un dosage pour la quantification des lésions de l'ADN dans les cellules ou les noyaux isolés à partir individeux tissus d'animaux traités avec le matériau (x) potentiellement génotoxiques. En raison de ses avantages, le test in vivo de la comète est recommandé comme un second test in vivo de génotoxicité (jumelé avec le test du micronoyau in vivo) pour effectuer des évaluations de sécurité des produits en cours Conférence internationale sur l' harmonisation (ICH) 3 et Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA ) 4 lignes directrices réglementaires. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé le test pour évaluer des dommages de l' ADN in vivo induite par les ingrédients alimentaires, les produits pharmaceutiques et les nanomatériaux 5-10. Rat foie sera utilisé comme exemple dans ce protocole, mais le test des comètes peut être réalisée avec d'autres tissus / organes d'animaux de laboratoire, aussi longtemps que des cellules individuelles intactes peuvent être isolées à partir du tissu.

Certains types de dommages à l'ADN sont difficiles à détecter que les ruptures d'ADN sans modifier le test des comètes alcalines de base. Dans le cas des dommages oxydatifs à l'ADN, brin breaks peuvent être créés au niveau des lésions oxydatives de l'ADN par digestion avec des enzymes de réparation tels que la 8-oxoguanine ADN-N glycosylase humaine 1 (hOGG1, ce qui crée des pauses à la 8-oxoguanine (8 oxoGua) et la méthyl-fapy-guanine 11. en outre, l' endonucléase III (endo III) crée des sauts principalement à pyrimidines oxydées 1. Ainsi, l'addition d'une étape enzymatique digestion permet le dosage d' une méthode spécifique et sensible pour mesurer les dégâts oxydatifs de l' ADN in vivo 12. en utilisant ces tests, nous avons démontré les dommages oxydatifs à l'ADN induite par la substance toxique dans le foie des rats et des souris 6-8 et dans le cœur des rats 10.

Le test des comètes alcalines a de nombreuses applications en toxicologie génétique et la biosurveillance humaine: 1) en tant que suivi dans l' essai in vivo pour génotoxiques identifiés par sensibles tests in vitro 3,13, 2) pour évaluer les mécanismes de lésions de l' ADN xénobiotiques-induite dans plusieurs tissus 14, 3) pour examiner si unecancérogène fonctionne à l' aide d' un génotoxique ou un mode non génotoxique d'action (MOA) 7, 4) pour évaluer l' ADN réparation des dommages 15, 5) pour étudier les maladies humaines et les expositions professionnelles 16 et 6) comme un test de criblage à haut débit potentiel de spécifique d' un organe de génotoxicité 17.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Éthique déclaration: procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) au Centre FDA / national pour la recherche toxicologique.

NOTE: La conception de l' étude décrite ici est basée sur le protocole développé par le Centre japonais pour la validation des méthodes alternatives (JaCVAM) pour leur validation de l'essai in vivo rongeur alcaline de la comète 18, et en outre modifié en fonction des recommandations du guide de l' OCDE TG489 19 .

1. Préparation

  1. préparation de diapositives
    1. Dissoudre l' agarose ordinaire de fusion à 1% (p / v) dans un tampon phosphate (Ca 2+, Mg 2+ libre et sans rouge de phénol) par chauffage dans un four à micro - ondes.
    2. Placer la solution agarose fondu 1% standard dans un bain d'eau C 55 ° et équilibrer la température du bain. microscope en verre Dip glisse dans la solution d'agarose, égoutter tout excess agarose et essuyez le dos des lames propres. Placer les lames à la verticale sur une surface plane et laisser les lames sécher à la température ambiante; stocker les lames dans un endroit sec.
  2. Préparation des solutions d'essai de comète
    1. Préparer une solution à 0,5% d'agarose à bas point de fusion. Dissoudre l' agarose bas point de fusion dans un tampon phosphate (Ca 2+, Mg 2+, et sans rouge de phénol) par chauffage dans un four à micro - ondes. Gardez la solution à 37-45 ° C pendant la préparation de diapositives comète; jeter toute solution d'agarose restant après.
    2. Préparer un tampon de lyse. Faire une solution 100 mM de disodique acide éthylènediaminetétraacétique (disodique EDTA, M. 372,24 g / mol), 2,5 M de chlorure de sodium (NaCl, M. 58.44 g / mol), et 10 mM tris hydroxyméthyl aminométhane (Tris Base, M. 121.14 g / mol) dans de l'eau purifiée et ajuster le pH à 10 avec 10 une solution N d'hydroxyde de sodium (NaOH, M. 40 g / mol). Le jour de l'utilisation, ajouter le Triton X-100 et le diméthylsulfoxyde (DMSO, M. 78,13 g / mol) à la solution finale à atteindre concentrations de 1% et 10%, respectivement, et on agite à 4-10 ° C pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
    3. Faire tampon d'enzyme fraîche le jour de l'utilisation. Préparer une solution contenant 40 mM d'acide 2- [4- (2-hydroxyéthyl) pipérazin-1-yl] éthanesulfonique (HEPES, M. 238,3 g / mol), 100 mM de chlorure de potassium (KCI, M. 74,55 g / mol), 0,5 mM EDTA disodique et 0,2% de sérum albumine bovine (BSA, MM 66463 g / mol) dans de l'eau purifiée. Ajuster le pH à 8,0 avec une solution 10 N d'hydroxyde de potassium (KOH, 56,1 g / mol). On agite à la température ambiante et vérifier la dissolution complète avant l'utilisation.
    4. Préparer une solution tampon alcaline contenant du NaOH 300 mM et 1 mM d'EDTA disodique dans de l'eau purifiée. Agiter à 4-10 ° C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Mesurer le pH de la solution avant l'utilisation et assurez-vous que le pH est> 13.
    5. Préparer une solution de 0,4 M de Tris base dans l'eau purifiée, et ajuster à pH 7,5 avec de l'acide chlorhydrique (HCl, M. 36.46). Conserver la solution à 4-10 ° C. Ceci est un tampon neutralisant.
    6. Faire frèch hachant tampon le jour de l'utilisation. Préparer une solution contenant 20 mM d' EDTA disodique et 10% de DMSO dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Ca2 +, Mg 2+, et sans rouge de phénol). Stocker sur la glace jusqu'à utilisation.
    7. Pour préparer la solution de coloration, diluer la tache solution mère nucléique fluorescente d'acide avec du Tris-borate-EDTA (tampon TBE) à 1: 10.000 (v / v). Protéger la solution de la lumière en utilisant une feuille d'aluminium. Conserver à 2-8 ° C et utiliser avec 24 h.

2. Préparation de la cellule unique Suspensions de foie de rat

  1. Euthanasier rats avec CO 2 méthodes suivantes de gaz recommandées dans les lignes directrices American Veterinary Medical pour l'euthanasie des animaux: 2013 Édition 20.
    1. Régler le débit de CO 2 à 2,75. Mettez le rat dans la chambre de l' euthanasie (par exemple, pot de dessicateur, cage de rat avec couvercle ventilé) et tourner sur le CO 2 en ouvrant le robinet de la bouteille. Attendre 1,5 à 2,5 min jusqu'à ce que larat devient inconscient. Augmenter le flux de CO 2 à sa valeur maximale. Après l'arrêt de la respiration, laisser le rat dans la chambre pendant environ 1 minute pour assurer l'euthanasie. Vérifier l'euthanasie en palpant pour confirmer que le rat n'a pas le rythme cardiaque, et pincer les orteils pour déterminer que le rat ne retire pas sa branche.
  2. Désinfecter le poil peau avec 70% d'éthanol. Ouvrez la cavité abdominale et enlever le foie intact avec des ciseaux chirurgicaux. Après avoir retiré le foie, enlever le lobe latéral gauche du foie restant avec des ciseaux chirurgicaux. Placez le lobe latéral gauche sur une planche à découper et couper deux 3-4 mm sections transversales adjacentes d'épaisseur à l'aide d'une lame à un seul tranchant rasoir jetable.
  3. Placez une section transversale sur du papier filtre (pour empêcher le curling de la section), et placer la section dans 10% de formol tamponné neutre (FBN). Faire en sorte que le rapport de NBF à 10% pour les tissus est de 10: 1 ou plus. Après un temps de fixation d'au moins 72 heures, procEss le foie pour l'histopathologie (voir la section 7 ci-dessous).
  4. Placez la deuxième section de foie transversale dans 5 ml glacée émincer tampon (section 1.2.6) dans une boîte de 6 cm de Pétri et rincer 3 fois pour éliminer le sang résiduel.
  5. Transférer la section de foie dans un nouveau tube de centrifugeuse de 2 ml contenant 1 ml de tampon de hachage glacée. Émincer la section du foie bien rincé avec une paire de ciseaux fins pour libérer les cellules. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour retirer tous les morceaux de tissu.
  6. Placez la suspension cellulaire unique sur la glace et utiliser pour faire des diapositives dans 1 h. Vérifier la concentration de cellules en comptant (par exemple, avec un hémocytomètre ou compteur de cellules électronique) pour veiller à ce que sa concentration est d' environ 2 x10 6 cellules / ml.

3. Préparation de Comet Diapositives

  1. Mélanger un volume de la suspension cellulaire unique avec 10 volumes de fusion, 37 ° C, une solution d'agarose à bas point de fusion à 0,5% (section 1.2.1).pipette Immédiatement 100 pi sur une lame revêtue d'agarose régulière du point de fusion (section 1.1). Immédiatement placer une lamelle sur le mélange de cellules-agarose. Faire au moins 8 diapositives pour chaque échantillon.
    NOTE: Toutes les lames doivent être identifiées par un numéro ou un code similaire et de leur identité enregistrées, de sorte que les lames peuvent être marqués en aveugle (voir 6.2.2 ci-dessous).
  2. Poser les diapositives plat et refroidir à 4 ° C pendant 30 min.
  3. Après le gel est solidifié, retirer délicatement les lamelles et plongez les lames dans un tampon de lyse pré-refroidie (section 1.2.2). Protéger les diapositives de la lumière et de garder les lames dans le tampon de lyse à 4 ° C de 1 h (minimum) à O / N (maximum).

4. Traitement enzymatique de Comet Diapositives

  1. Retirer 6 des 8 lames préparées à partir de chaque échantillon de tissu provenant du tampon de lyse et les rincer 3x pendant 5 minutes à chaque fois avec le tampon de l'enzyme (section 1.2.3) à température ambiante. Utilisez les deux lames restantes pour l'essai comète alcaline without enzyme-traitement (voir 5.1, ci-dessous). Après rinçage, enlever l'excès de liquide par égouttage et buvard les diapositives avec les tissus.
  2. Et diluer hOGG1 Endo III stocks enzyme avec du tampon enzymatique à 1: 1000 (v / v). Placer sur la glace jusqu'à utilisation.
  3. Appliquer 200 pi des solutions suivantes aux diapositives préparées à partir de chaque groupe de traitement: 200 pi de tampon d'enzyme seule (2 diapositives utilisées comme diapositives de référence), III solution Endo 200 solution ul de hOGG1 (2 lames) ou 200 pi (2 lames).
  4. Mettre les lames dans des boîtes de Pétri doublées avec des serviettes en papier humides, couvrir les lames avec Parafilm, et incuber à 37 ° C pendant 45 min pour Endo III traités et les diapositives de référence et 30 min pour les diapositives hOGG1 traitées.
  5. Après incubation, rincer les lames avec de l'eau distillée et poursuivre le traitement comme décrit dans 5.2, ci-dessous.

5. Dénouement et Électrophorèse

  1. Pour les lames non traitées avec des enzymes, enlever les lames du tampon de lyse, Égoutter les lames et rincer une fois avec un tampon de neutralisation à froid (section 1.2.5) pendant 5 min pour éliminer les détergents et les sels résiduels.
  2. Placer les lames de Steps 4.5 et 5.1 de façon aléatoire dans un réservoir d'électrophorèse sur gel horizontal, en évitant tous les espaces. Remplir le réservoir avec fraîchement préparé pH> 13 tampon d'électrophorèse (section 1.2.4) jusqu'à ce que le niveau de liquide ne couvre que les diapositives (éviter les bulles sur l'agarose et assurez-vous que le réservoir est de niveau). Enregistrez le pH du tampon et de la température au début de l'ADN de déroulement.
  3. Laisser les lames restent dans le tampon alcalin pendant 20 min pour permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des dommages en milieu alcalin responsable.
  4. Pendant le déroulement, le programme de l'alimentation pour produire 0,7 V / cm dans la cuve d'électrophorèse (V / cm = Volts, divisée par la distance en cm entre les électrodes positives et négatives).
  5. Après déroulement, appuyez sur le bouton d'exécution sur l'alimentation. Si nécessaire, ajuster le courant de 300 mA, en augmentant ou en abaissant le niveau de mémoire tampon. Gardez eniveau de tampon e juste au-dessus de la surface des lames. Effectuer une électrophorèse à 4 ° C pendant 20 min. Notez l'emplacement de la diapositive, la température du tampon et le courant (ampères) au début et à la fin de l'électrophorèse.
    NOTE: Trop tampon se traduira par des tensions plus faibles qui peuvent interférer avec la migration de l'ADN.
  6. Après électrophorèse, neutraliser l'excès d'alcali en soulevant doucement les lames de la cuve et plongeant dans un tampon de neutralisation (section 1.2.5) pendant 5 min. Égoutter les diapositives et répéter deux fois.
  7. Fixer les lames en les immergeant dans le froid éthanol à 100% pendant 5 min. Laisser sécher les lames d'air et le placer dans un endroit sec pour le stockage.

6. ADN Coloration, Comet visualisation et d'analyse

  1. coloration de l'ADN
    1. Placer les lames sur un plateau en carton ou en métal et ajouter 200 pi de solution tache de travail nucléique fluorescente d'acide (section 1.2.7) à chaque diapositive et couvrir avec une lamelle de verre. Protéger les diapositives dela lumière permettent aux diapositives de rester en contact avec la solution de coloration pendant au moins 30 min avant de marquer. Colorer les lames dans des lots de 20 à la fois.
    2. Avant de lire chaque diapositive, doucement épongez loin la solution de coloration en excès, en faisant attention à ne pas perturber le verre de protection.
  2. Visualisation Comet et notation
    1. Utiliser une caméra fixée à un microscope à fluorescence pour afficher des images en direct de la glissière comète sur le moniteur de l'ordinateur.
    2. Aléatoirement choisir un champ de microscope contenant des cellules. Utilisation d'une souris, sélectionnez une cellule. Cliquez sur le centre de la «tête de comète" avec le clic gauche de la souris.
      REMARQUE: Le logiciel calcule tous les paramètres de mesure pour la cellule et ajoute les données dans un fichier de données.
    3. Note toutes les cellules dans le champ en cours (voir étape 6.2.4), puis utiliser les commandes de scène du microscope et la vidéo à l'écran pour trouver un autre ensemble de cellules. Note ces cellules comme décrit dans 6.2.2.
    4. Note la diapositive fdroit rom à gauche et vers le bas vers le haut. Choisissez environ 10 champs au hasard. Au cours de ce processus, toute cellule comète appropriée qui apparaît dans le champ de vision doit être marqué sans parti pris.
      REMARQUE: Ne pas marquer une comète si une des conditions suivantes est remplie: 1) il est situé sur l'un des bords de la lame; 2) deux ou plusieurs comètes se chevauchent; 3) il y a des débris dans la queue; 4) le logiciel ne peut pas différencier entre la tête et la queue; ou 5) la coloration du noyau et / ou la queue diffère grandement des autres comètes sur la diapositive.
      NOTE: Les comètes avec la quasi-totalité de leur fluorescence d'ADN dans la queue sont souvent désignés comme des comètes «hérisson». comètes hérisson ne devraient pas être marqués, mais le nombre de hérissons détectés au cours de la notation de diapositives doivent être enregistrées et déclarées en pourcentage des comètes totales.
    5. Analyser au moins 75 comètes par diapositive, à la lecture de deux diapositives par organe / tissu pour obtenir au moins 150 cellules / comète échantillon total. Après que le nombre requis de cellules à partir d'une lame ont soiten a reçu, le résultat est enregistré dans un fichier tableur pour l'analyse ultérieure des données.

7. histopathologie Analyse

  1. Après un minimum de 72 heures de fixation dans 10% FBN, suivie par le tissu de rognage 21, traiter systématiquement et intégrer le lobe du foie latéral gauche des échantillons dans une paraffine cire à base de support 22. Section des échantillons à environ 5 microns et de recueillir sur des lames de verre.
  2. Colorer les sections avec hématoxyline & éosine (H & E):
    1. Chauffer les lames avec les sections de tissu de paraffine dans un four à 60 ° C pendant 2 heures avant la procédure de coloration.
    2. Utilisez xylène pour Déparaffiner les côtés. Réhydrater les lames avec de l'éthanol gradué (EtOH) à une course rinçage à l'eau du robinet.
    3. Placer les lames dans 450 ml d'hématoxyline pendant 2 min et 40 sec. Rincer les lames avec de l'acide (acide acétique glacial 2 ml à 450 ml d'eau déminéralisée) pour 4 sec suivant par 5 min en cours d'exécution l'eau du robinet de rinçage.
    4. Placez le glissées dans 450 ml d'EtOH à 70% contenant 1 ml d'hydroxyde d'ammonium pendant 2 min, puis rinçage à l'eau courante du robinet pendant 2 minutes et 30 secondes, et 70% d'EtOH rinçage pendant 1 min.
    5. Incuber les lames avec 450 ml de solution d'éosine Y contenant de l'acide acétique glacial 4 ml pendant 3 min.
    6. Déshydrater les lames avec EtOH gradué. Effacer les diapositives avec du xylène (trois fois 1 min chaque), et maintenir les lames dans le xylène jusqu'à ce que des lamelles sont placées sur les lames.
  3. Examiner les lames par microscopie optique, les résultats records, et des lésions non néoplasiques qualité de la gravité comme 1 (minimal), 2 (légère), 3 (modéré), ou 4 (marqué).
    NOTE: Le degré de sévérité appliquée pour une lésion spécifique est basée sur la proportion relative du foie avec la lésion (= minimum <1-15%; légère = 16-35%, modérée = 36-60%, et marqué = 61- 100%).

Analyse 8. Données

  1. L'animal est considéré comme l'unité expérimentale pour les évaluations statistiques. endommagement de l'ADN est exprimée en% DNA dans la queue.
  2. dommages oxydatifs à l'ADN est calculé comme suit: les diapositives de référence (pas de traitement enzymatique) fournissent une estimation des pauses ADN de fond brin (SB).
    REMARQUE: Les lames d'enzymes traitées fournissent une mesure de cassures et de bases oxydées (SB + OX). En supposant une dose - réponse linéaire pour l' ADN% dans la queue en fonction des dommages de l' ADN, la soustraction de SB de SB + OX donne une estimation des ruptures de brins d' ADN de oxydées pyrimidines / purines modifiées 23.
  3. Analyser l'ADN% dans la queue en fonction de la dose par une ANOVA, suivie d'un test de Dunnett pour des comparaisons par paires des réponses chez les animaux traités au contrôle du véhicule.
    NOTE: Tous les tests sont une queue et une valeur p inférieure à 0,05 est fixé comme critère de signification statistique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Le test des comètes alcalines in vivo a été réalisée conjointement avec le test des comètes enzyme modifiée pour mesurer les dommages de l' ADN direct et oxydatif dans le foie des rats traités avec de l' acétate de cyprotérone (CPA) 5. CPA est un médicament hormonal synthétique qui provoque des tumeurs du foie de rat d'une manière spécifique du sexe, avec cinq fois plus fortes doses nécessaires pour induire des tumeurs du foie chez les rats mâles par rappo...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ce protocole décrit la mesure concurrente de dommages à l'ADN et à l'oxydation directe dans le foie de rat au niveau de la cellule unique. Le protocole général est applicable à tout tissu à partir duquel les cellules ou les noyaux individuels peuvent être isolés avec un minimum de lésions de l' ADN induites par le traitement ( à savoir, des lésions de l' ADN induites et non par l'agent d'essai, mais la manipulation et le traitement des tissus d'origine animale). Dans notre recherche,...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Aucun des auteurs n’a d’intérêts concurrents ou conflictuels. Les informations contenues dans ces documents ne constituent pas une diffusion formelle d’informations par la FDA et ne représentent pas la position ou la politique de l’agence.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Food and Drug Administration des États-Unis. Nous tenons à souligner la publication originale de l’étude CPA par Elsevier B.V. : Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Analyse dose-réponse spécifique au sexe de la génotoxicité chez les rats F344 traités à l’acétate de cyprotérone. Recherche sur les mutations 774 : 1-7, 2014 (PMID : 25440904)

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lamelles (n° 1, 24 x 50 mm)Fisher12-544-14
Lames de microscopeFisher12-550-123
Diméthylsulfoxyde (DMSO)  ;Fisher67-68-5
EDTA, DisodiumFisherBP120-1
Solution saline tamponnée au phosphateFisherICN1860454
1x Solution saline équilibrée Hanks (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
Agarose à bas point de fusion ( LMP)Lonza50081NuSieve GTG Agarose
à fusion normale (NMA)  ;FisherBP1356-100
Bandelettes en papier pour tester le pH (pH 7,5-14)FisherM95873
Chlorure de potassiumFisher7447-40-7
Hydroxyde de potassiumFisher1310-58-3
Étiquettes pour lames (0,94 x 0,5 po)FisherNC9822036
Chlorure de sodium (NaCl)  ;Fisher7647-14-5
Hydroxyde de sodium (NaOH)  ;Fisher1310-73-2
SYBR&trade ; Or  ;InvitrogenS11494
Triton X-100  ;Fisher9002-93-1
Base Trizma  ;Fisher77-86-1
Tubes à centrifuger microcentrifugation de 2,0 mlFisher05-402-6
Crépine à cellules (40 µ ; m)Fisher22363547
Endonuclease III (Nth)  ;New England BiolabsM0268SDilution 1:1 000
hOGG1  ;New England BiolabsM0241SDilution 1:1 000

Références

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Tissu hépatique de ratsuspension de cellules uniquesélectrophorèse sur gelmicroscopie à fluorescenceenzymes hOGG1 et Endo IIIdommages à l'ADN induits par le CPA
In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d' ADN et l' ADN oxydative dommages de foie de rat
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.