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Article de méthode

Isolement et Cannulation de parenchyme cérébral artérioles

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DOI :

10.3791/53835

⸱

23 mai 2016

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Nevada School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole simple et reproductible pour l’isolement des artérioles intracérébrales (un groupe de vaisseaux sanguins englobant les artérioles parenchymateuses, les artérioles pénétrantes et les artérioles précapillaires) chez la souris, à utiliser dans la myographie de pression, l’immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

Résumé

artérioles intracérébrales parenchymateuses (AP), qui comprennent les artérioles parenchyme, artérioles pénétrantes et artérioles pré-capillaires, sont très résistants vaisseaux sanguins se ramifient des artères et des artérioles piales et plonger dans le parenchyme cérébral. Individuel PA perfuser un territoire cylindrique discret du parenchyme et les neurones contenus dans. Ces artérioles sont un acteur central dans la régulation du flux sanguin cérébral tant au niveau mondial (d'autorégulation cérébrovasculaire) et localement (hyperémie fonctionnelle). AP font partie de l'unité neurovasculaire, une structure qui correspond à la circulation sanguine régionale de l'activité métabolique dans le cerveau et comprend également des neurones, des astrocytes et des interneurones. Perfusion par AP est directement liée à l'activité des neurones dans ce territoire particulier et l'augmentation des neurones du métabolisme conduisent à une augmentation de la perfusion locale provoquée par la dilatation de l'alimentation PA. Règlement des AP diffère de celui de mieux caractériséartères piales. vasoconstriction induite par la pression est plus grande dans les AP et les mécanismes vasodilatateurs varient. En outre, les AP ne reçoivent pas innervation extrinsèque des nerfs périvasculaires - innervation est intrinsèque et de nature indirecte par contact avec endfeet astrocytaire. Ainsi, les données relatives à la régulation contractile accumulées par des études utilisant des artères piales ne se traduit pas directement à la compréhension de la fonction PA. En outre, il reste à déterminer comment les états pathologiques, comme l'hypertension et le diabète, affectent la structure PA et réactivité. Cette lacune est en partie la conséquence des difficultés techniques liées à l'isolement PA et cathétérisme. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole pour l'isolement et la canulation des AP de rongeurs. De plus, nous montrons des exemples d'expériences qui peuvent être effectués avec ces artérioles, y compris la constriction induite par l'agoniste et de la réactivité myogénique. Bien que l'accent de ce manuscrit est sur canulation PA et myographie de pression, isolé PAs peuvent également être utilisés pour des études biochimiques, biophysiques, moléculaires, et d'imagerie.

Introduction

La circulation cérébrale est organisée uniquement pour soutenir les besoins métaboliques de neurones centraux, les cellules qui ont limité les réserves d'énergie et sont par conséquent très sensible aux variations de la pression d'oxygène et d'éléments nutritifs nécessaires. Comme particulier neuronaux sous - populations devient actif lorsque des tâches spécifiques sont effectuées, la vascularisation favorise une augmentation très localisée de la perfusion pour éviter l' hypoxie locale et de l' épuisement des éléments nutritifs 1. Ceci est une forme d'hyperémie fonctionnelle connue sous le nom de couplage neurovasculaire, et dépend du bon fonctionnement de l'unité neurovasculaire, composée de neurones actifs, les astrocytes et les artères cérébrales 2. Artérioles parenchyme intracérébrales, un groupe de vaisseaux sanguins englobant parenchymateuse, pénétrantes et artérioles pré-capillaires, sont importants au centre de cette réponse et il est alors essentiel de les étudier individuellement afin d'étudier le couplage neurovasculaire 3.

artérioles parenchymateuses sont petites (20-70 um de diamètre interne) à haute résistance des vaisseaux sanguins qui irriguent les populations neuronales distinctes dans le cerveau. Branching out des artères piales sur la surface, artérioles parenchyme pénètrent dans le parenchyme cérébral à près de 90 ᵒ angle pour alimenter la microcirculation du sous - sol (figure 1). Ces artérioles jouent un rôle crucial dans le maintien de la pression de perfusion appropriée car ils sont des vaisseaux les plus distaux contenant des muscles lisses qui protègent les capillaires. Contrairement à la circulation pial de surface, artérioles parenchyme manquent branches collatérales et anastomoses, et par conséquent sont des «goulets d' étranglement» de la circulation cérébrale 4. En conséquence, le dysfonctionnement des artérioles parenchymales contribue au développement de maladies vasculaires cérébrales telles que l'altération cognitive vasculaire et les petits accidents vasculaires cérébraux ischémiques (également connu comme AVC silencieux ou lacunaires). études iNDICATe que la dysfonction parenchyme artérioles peut être induite par l' hypertension artérielle essentielle 5, le stress chronique 6, et est un événement précoce dans maladie des petits vaisseaux modèle de souris génétique 7. Occlusion En outre, induite expérimentalement des artérioles pénétrantes simples chez les rats est suffisante pour causer de petits accidents vasculaires cérébraux ischémiques qui sont de forme cylindrique, semblable à celles observées chez les humains âgés de 8.

En plus de ces distinctions anatomiques, mécanismes de régulation de la fonction contractile diffèrent entre les artères et artérioles piales parenchymateuses. Myogénique vasoconstriction est plus grande dans les artérioles parenchymales 9, probablement en raison de l'absence d'innervation extrinsèque 10, modes distincts de transduction mécanique 11, et des différences dans la signalisation intracellulaire de Ca2 + 12,13 dans les cellules musculaires lisses vasculaires. Les preuves suggèrent que les mécanismes de vasodilatateurs endothélium-dépendante diffèrent également entre ces vascusegments lar, avec les artères parenchymateuses présentant une plus grande dépendance à l' égard des mécanismes impliquant Ca 2+ -activated canaux K + et communication électrotonique au sein de la paroi vasculaire par rapport aux facteurs diffusibles tels que l' oxyde nitrique et prostacyclines 14. Par conséquent, les données recueillies dans des expériences utilisant des artères piales peuvent pas nécessairement à parenchymateuse artérioles, laissant un vide dans nos connaissances sur le contrôle local de perfusion cérébrale.

Malgré leur importance, les artérioles parenchyme sont largement sous-étudiées, principalement en raison des difficultés techniques avec l' isolation et de montage pour ex vivo étude. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour isoler et cathétériser artérioles parenchymateuses cérébrales, qui peut être utilisé pour myographie sous pression ou pour isoler les tissus à des fins immunomarquage, électrophysiologie, la biologie moléculaire et de l'analyse biochimique.

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Protocole

1. Canule et de la Chambre Préparation

  1. Insérer des capillaires en verre de borosilicate propres (diamètre extérieur: 1,2 mm, diamètre intérieur: 0,69 mm, 10 mm de longueur) dans les rainures d'un extracteur de pipette avec un filament de platine (diamètre: 100 um).
  2. Utilisation des paramètres appropriés, tirer le capillaire pour générer une canule avec une longue et fine pointe (Figure 2) en utilisant un extracteur micropipette. Les paramètres utilisés sont: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10.
  3. Insérer la canule dans le support de la chambre de myographe de pression. Alignez les canules de manière appropriée.
  4. Casser soigneusement les conseils des canules en utilisant une pince sous le microscope binoculaire au diamètre souhaité. Ici , nous montrons une canule avec une pointe de 10 pm (Figure 2).
  5. Remplir les deux canules avec du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) contenant 1,8 mM de Ca 2+; remplir la chambre avec Ca 2+ -free LCRa supplémenté avec du sérum bovin à 1%albumine (BSA) + 10 uM diltiazem (toutes les solutions doivent être préparées avant le début de l'expérience). En fonction de la taille de la chambre, faire varier le volume de LCRa entre 5 et 20 ml. Rangez la chambre à 4 ᵒ C jusqu'au moment de commencer cathétérisme.
    REMARQUE: Le diltiazem est un inhibiteur de type L réversible tension gated calcium qui provoque une dilatation des arterioles, ce qui facilite canulation

2. Isolement du parenchyme artérioles

  1. Euthanasier l'animal immédiatement avant la dissection en utilisant des protocoles standard dans le laboratoire qui sont approuvés par le comité de protection des animaux de l'institution. L'utilisation de barbituriques ou de dioxyde de carbone est préférable, car d' autres anesthésiques couramment utilisés peuvent avoir des effets vasodilatateurs dans la circulation cérébrale 15. Toutes les procédures d'animaux présentés ici ont été approuvés par Institutional Animal Care et utilisation Comité de l'Université du Nevada School of Medicine, et sont en agcco rd avec les National Institutes of Health "Principes directeurs dans le soin et l'utilisation des animaux».
  2. Euthanize l'animal en utilisant du dioxyde de carbone. Avant la décapitation, veiller à ce que l'animal a cessé de respirer et est insensible quand pinçant ses pattes.
  3. Décapitez l'animal à l'aide d'un ciseau tranchant (de la souris) ou guillotine (rat). Retirez la peau de la tête de l'animal et couper le long de la suture crânienne médiane en utilisant une pointe de ciseaux bien. En utilisant une pince émoussée (souris) ou une pince osseuse retirer délicatement les os du crâne et d'exposer le cerveau. Retirez le cerveau lentement et avec précaution pour ne pas endommager les artères piales de surface. Placer le cerveau dans un récipient rempli avec 20 ml de Ca2 + -free LCRa supplémenté avec 1% de BSA dans de la glace.
  4. Remplir un plat de dissection contenant un tampon avec de la glace froide Ca2 + LCRa additionné de 1% de BSA et de transférer le cerveau avec la face ventrale vers le haut à ce plat (figure 2A). Placer le plat sous une dissectiontion au microscope (Figure 3A). Epingler le cerveau au tampon en utilisant des aiguilles de calibre 27. Soyez prudent d'éviter de placer des broches à proximité de l'artère cérébrale moyenne (MCA).
  5. Localisez le Cercle de Willis et le MCA ramification de celle-ci. En utilisant des ciseaux pointus et alignés printemps Vannas, couper un petit rectangle autour de la MCA. Assurez-vous que le rectangle est proche de 5 mm de diamètre sur toute la longueur de l'ACM. La partie supérieure du rectangle doit être passé le point du cercle de Willis (proximal au Cercle de Willis, figure 2B, flèche) ramification.
  6. À l'aide des ciseaux à ressort Vannas, effectuer une contre-dépouille dans la profondeur du tissu pendant environ 2 - 3 mm.
    NOTE: Cette partie est essentielle pour une bonne isolation des artérioles du parenchyme, et il peut prendre quelques essais pour y arriver. Si la coupe est la note fait assez profonde, les artérioles parenchymateuses isolées sera de courte durée; si la coupe est trop profonde, les artérioles se casseront à leur point de branchement lorsque le disséquéele tissu est enlevé.
  7. Pin vers le bas l'extrémité la plus distale de la tranche de cerveau dans le plat de dissection avec le MCA vers le haut (distale du cercle de Willis) en utilisant des broches d'insectes. Faire une incision peu profonde pour couper le pia près de la broche, en faisant attention à ne pas couper trop profondément dans le cortex cérébral sous-jacent (sinon les broches ne tiendront pas).
  8. saisir soigneusement chaque côté de la pia avec de petites pinces et commencer à peler le pia du cortex. Si nécessaire, tenir à la MCA, veiller à ce que la membrane pial environnante ne soit pas endommagé.
  9. Garder le pelage jusqu'à ce que le pia contenant le MCA est libre du cortex. Notez que la résistance contre l'écaillage augmentera près du cercle Willis. Soyez très prudent à ce stade, parce que les artérioles parenchymateuses plus seront dans cette région.
  10. Une fois que le pia est libre, placez - le soigneusement sur ​​le dessus de la garniture sur le plat de dissection avec la surface opposée à parenchymateuse artérioles orientés vers le bas (figure 2B).
  11. Utilisation Vannas ciseaux à ressort, découper les artérioles disséqués libres de la MCA, assurant que les extrémités de l'enceinte sont coupés carrément.
  12. artérioles recueillies peuvent être utilisées pour myographie la pression, l'analyse moléculaire, ou l'isolement du muscle lisse natif ou des cellules endothéliales.

3. Pression myographie

  1. Préparer la suture à l'avance. Couper le fil vert foncé en nylon en 5 morceaux mm et placer sur le côté collant d'un ruban adhésif double face sur une boîte de Pétri. Sous le microscope de dissection, séparer chaque morceau dans ses filaments à l'aide de pinces fines, et de préparer de manière lâche un noeud simple demi-clé en faisant passer une extrémité du filament dans l'autre.
  2. En utilisant des pinces, choisissez un noeud hors du ruban adhésif double face, en veillant à ne pas l'attraper avec trop de pression. Tirer le fil de suture dans la solution de bain, toboggan noeud sur la canule et le serrer à une distance de l'extrémité de la canule. Répétez ce processus pour avoir 2 sutures sur chaque canule.
  3. Enduire un verremicropipette avec une solution de BSA à 10%, puis rincer l'excédent avec Ca 2+ -free LCRa additionné de 1% de BSA.
  4. Tirez 50 pi de solution dans la micropipette de verre, tirer vers le haut une artériole parenchymateuse et transfert à la chambre de myographie de pression. Poussez le piston dans un mouvement fluide pour distribuer l'artériole parenchymateuse dans la chambre pour l'empêcher de coller à la chambre interne de la micropipette de verre.
  5. En utilisant deux pinces super fine, ouvrir la lumière de l'AP, en prenant soin de ne toucher la fin du navire.
  6. À l'aide des pinces pour tenir les bords de l'artériole parenchymateuse, tirer avec précaution le récipient sur la canule. Tirer suffisamment loin de la canule , de sorte que le récipient ne soit pas au bout effilé de la canule (figure 3A).
  7. Desserrez les 2 sutures sur la canule et les serrer sur le navire (figure 3B). Espacez les sutures à part un peu sur le navire, et tirez vers l'opérateur tandis que tighil dix. Assurez-vous que toutes les branches sont liées avant de fermer l'extrémité opposée de l'artériole parenchymateuse.
  8. Tournez chambre autour et fermer l'extrémité opposée de l'artériole parenchymateuse comme un aveugle-sac. Pour ce faire, ouvrir les liens sur la canule opposée et passer sur l'artériole. fermer lentement le noeud de telle façon que l'artériole parenchymateuse sera liée à la partie de la canule. Évitez étirement longitudinal de l'artériole. (Figure 3C).
    REMARQUE: si l'objectif de l'étude est de perfuser des médicaments à travers la lumière, Cathétériser l'extrémité opposée au lieu de lier l'artériole parenchymateuse sur le côté de la canule. Assurez-vous que les canules n'ont pas de cristaux de sel ou de build-up internes qui bloquent l'écoulement intraluminal. Réglementer débit de manière appropriée afin de maintenir la contrainte de cisaillement dans les niveaux physiologiques. Une étude menée par Shih et al. Montre les taux d'écoulement à l' intérieur de pénétration artérioles chez les rats 8, et peut servir de guide initial pour piétudes de lot.
  9. transférer soigneusement la chambre à l'étage du microscope à être utilisé pour l'enregistrement de diamètre du vaisseau. Fixez la chambre sur la platine du microscope, reliant la sonde de température et d'entrée et de sorties pour la perfusion dans les tubes appropriés. Pressuriser l'artériole à 40 mmHg la pression intraluminale pour artérioles parenchymales de souris ou de 50 mm Hg pour artérioles de rat, en utilisant un système de pression disponible au laboratoire (colonne d'eau, une pompe péristaltique couplée à un transducteur de pression, etc.). La figure 4D représente un exemple d' une pompe péristaltique couplée à un transducteur de pression pour pressuriser l'artériole canulée.
  10. Allumez le système utilisé pour détecter les changements de diamètre (Figure 3E). Réglez les paramètres sur le microscope, tels que l'éclairage et le contraste, afin d'obtenir la meilleure détection possible. Idéalement, les parois de l'artériole doit être sombre et la lumière translucide. Une fois que la détection est appropriée, commencer à enregistrer til expérimenter.
  11. Démarrez le système de surfusion. Laver la canule, sous pression artériole parenchymateuse avec chaud LCRa (37 ᵒ C) contenant 1,8 mM Ca 2+ pour 15 à 20 min à un débit compris entre 3 à 5 ml / min. Cette LCRa ne doit pas contenir diltiazem ou BSA.
  12. Remplacer le LCRa régulier avec 60 mM de KCl LCRa pour évaluer la viabilité de la préparation. À ce stade, les AP doivent présenter 10 - 20% constriction à 60 mM KCl. Si l'artériole ne restreint pas dans cette mesure, enlever et cathétériser une autre artériole.
  13. Laver le KCl 60 avec régulière LCRa. Attendez jusqu'à ce que la génération du tonus myogène spontanée, ce qui pourrait prendre jusqu'à une heure. Si artériole n'a pas tonus myogène alors, le remplacer par un autre artériole.
    REMARQUE: Myogenic ton est observée comme un déclin progressif, et parfois lente, la réduction du diamètre de la lumière du vaisseau sans stimulation par des agonistes contractiles ou d'une solution à haute KCI. tonus myogénique est calculée par la suivante formula: (1 - (diamètre de lumière actif / diamètre de la lumière passive)) x 100 5 Une quantité appropriée de tonus myogène peut varier selon les traitements, les souches, les espèces, la transgénèse, etc.. En général, le ton myogénique physiologique varie de 15 à 30% 5.

4. Exemple pression myographie Expériences: Rétrécissement Agonist-induite et Myogenic Réactivité

  1. Préparer une série de dilutions d'un agoniste de choix dans LCRa en utilisant des concentrations appropriées. Pour l'exemple actuel , le thromboxane A 2 agoniste du récepteur U46619 a été utilisé. Une solution stock de 1 ml de U46619 à une concentration de 1 mM a été préparée. Transfert de 100 ul de la solution 1 mM dans un nouveau tube contenant 900 ul d'aCSF pour obtenir une dilution de 10 fois du médicament, conduisant à une solution contenant 100 uM U46619. Répétez ce processus pour 6 dilutions allant de 1 mM à 100 nM pour préparer une courbe de constrictor concentration-réponse.
  2. Ajouter ledu volume total de la solution contenant l'agoniste (1 ml pour la première dose, suivi par 900 ul de toutes les doses ultérieures) à 100 ml d'superfusing LCRa. Cela conduira à un supplément de 100 fois la dilution de l'agoniste. Ainsi, les concentrations finales de l'agoniste dans l'intervalle de bain de 10 pM à 10 pM. Laisser artérioles à incuber pendant ~ 10 min à chaque concentration, jusqu'à ce que le diamètre luminal atteint un état d'équilibre.
  3. Laver l'agoniste par superfusing AP avec LCRa sans médicaments jusqu'à ce que le diamètre PA est de retour à la valeur initiale. Incuber l'artériole parenchymateuse en Ca2 + -free LCRa (sans BSA) supplémenté avec 10 uM diltiazem + EGTA 2 mM pour induire la dilatation maximale et d' enregistrer un diamètre passif de l'artériole.
  4. Enlever l'artériole parenchymales de la canule en tirant avec précaution sur tout en maintenant à l'extrémité des traverses. Laver la chambre de récipient avec de l'eau à double désionisée pour éliminer les débris et l'excès d'agoniste. Remplir la chambre avec Ca2+ LCRa -free + BSA et Cathétériser autre artériole. Il est recommandé de ne pas effectuer plus d'une expérience par artériole.
  5. Pour effectuer une expérience de réactivité myogénique, permettent l'artériole parenchymateuse stabiliser à 40 mmHg la pression intraluminale jusqu'à ce que ton spontané myogénique est généré (décrit ci-dessus). Réduire la pression intraluminale à 5 mmHg et laisser PA à équilibrer pendant environ 5 - 10 min, jusqu'à ce que le diamètre luminal atteint l'état d'équilibre. Augmenter par étapes la pression intraluminale utilisant l'intervalle de choix (par exemple de 5 à 140 mm de Hg à 20 mm Hg par incréments).
  6. Ne pas exposer l'artériole à la pression intraluminale inférieure à 5 mmHg, car cela pourrait provoquer l'effondrement et endommager l'endothélium, modifiant ainsi les résultats de l'expérience.
  7. A la fin de la courbe de pression, superfuse l'artériole parenchymateuse avec Ca 2+ -free LCRa (sans BSA) supplémenté avec 10 uM diltiazem + 2 mM d' EGTA et répéter les étapes de pression, à partir de la lowest pression.
    NOTE: Cela donnera les diamètres passifs de l'AP, qui sont nécessaires pour calculer tonus myogène de%, définie par la formule:% ton = (1 - (diamètre actif / passif de diamètre)) x 100.

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Résultats

La figure 5A montre un rétrécissement représentant des AP de souris à 60 mM KCI LCRa pour évaluer l'intégrité de la préparation. AP devrait constriction entre 15-30% en présence de 60 mM de KCl. Si le rétrécissement est inférieur à 15%, jeter le PA et cathétériser les uns les autres, car elle suggère que l'artériole a été endommagé au cours du processus d'isolement et de cathétérisme.

La fi...

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Discussion

artérioles parenchyme cérébral sont artérioles de résistance élevée avec quelques anastomoses et les branches qui irriguent populations neuronales distinctes. Ces vaisseaux sanguins spécialisés sont des acteurs centraux dans l' autorégulation cérébrovasculaire et le couplage neurovasculaire par astrocyte médiée par vasodilatation 1. L'importance de ces vaisseaux sanguins spécialisés dans les maladies vasculaires cérébrales est connue depuis environ 50 ans, lorsque le travail de pionnier du Dr Miller F...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Financé par NHLBI R01HL091905 (SE), la subvention de recherche CADASIL (FD) de la Fondation unie contre la leucodystrophie et AHA 15POST247200 (PWP). Les auteurs tiennent à remercier Samantha P. Ahchay d’avoir fourni l’image de la figure 1, et le Dr Gerry Herrera, Ph.D., d’avoir fourni des commentaires critiques sur le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Liquide céphalo-rachidien artificiel
NaClFisher ScientificS-640
KClFisher ScientificP217
MgCl AnhydrusSigma-AldrichM-8266
NaHCO3Fisher ScientificS233
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG2870
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA9647
Isolation/Cannulation
Stereo MicroscopeOlympusSZX7
Pince Super FineScience Tools11252-00
Vannas Spring ScissorsFine Science Tools15000-00
Wiretrol 50 &mu ; lVWR Scientific5-000-1050
0.2 &mu ; m Filtre à seringue stérileVWR Scientific28145-477
Extracteur de micropipettesSutter InstrumentsP-97
Verre borosilicaté D.E. : 1,2 mm, D.I. : 0,68 mmSutter InstrumentsB120-69-10
Fil de nylon vert foncéSystèmes vivants InstrumentationTHR-G
Alignement linéaire Chambre à récipient uniqueSystèmes vivants InstrumentationServocontrôleur de pression CH-1-LIN
avec pompe péristaltique Instrumentationvivants AnalyseurPS-200
Instrumentation des systèmes vivants EnregistreurVDA-10
avec logiciel d’enregistrement et d’analyse LabScribe 3 Instrumentationdes systèmes vivantsDAQ-IWORX-404
Unitéde chauffageWarner Instruments64-0102
Régulateur de température automatiqueWarner InstrumentsTC-324B
Systèmes de dimensions vidéo à quatre canaux

Références

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