Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Quantification de l'expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

12.6K vues

⸱

DOI :

10.3791/53837

⸱

8 avril 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Dans cet article

Résumé

L’immunohistochimie est une technique de laboratoire puissante pour évaluer la localisation et l’expression des protéines dans les tissus. Les méthodes semi-automatisées actuelles de quantification introduisent de la subjectivité et créent souvent des résultats irreproductibles. Nous décrivons ici des méthodes d’immunohistochimie multiplexée et de quantification objective de l’expression et de la co-localisation des protéines à l’aide de l’imagerie multispectrale.

Résumé

L’immunohistochimie est une technique de détection clinique et de recherche couramment utilisée pour étudier l’expression et la localisation des protéines dans les tissus. De nombreux systèmes semi-quantitatifs ont été développés pour marquer l’expression à l’aide de l’immunohistochimie, mais la subjectivité inhérente limite la reproductibilité et la précision des résultats. De plus, l’étude de biomarqueurs se chevauchant spatialement tels que les facteurs de transcription nucléaire est difficile avec les techniques actuelles d’immunohistochimie. Nous avons développé et optimisé un système d’investigation simultanée de plusieurs protéines en utilisant des méthodes à haut débit d’immunohistochimie multiplexée et d’imagerie multispectrale. L’immunohistochimie multiplexée est réalisée par application séquentielle d’anticorps primaires avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort ou à la phosphatase alcaline. Différents chromogènes sont utilisés pour détecter chaque protéine d’intérêt. Les lames colorées sont chargées dans un scanner de lames automatisé et un protocole est créé pour l’acquisition automatisée d’images. Une bibliothèque spectrale est créée en colorant un ensemble de lames avec un seul chromogène sur chacune. Un sous-ensemble d’images colorées représentatives est importé dans un logiciel d’imagerie multispectrale et un algorithme permettant de distinguer le type de tissu est créé en définissant des compartiments tissulaires sur les images. Les compartiments subcellulaires sont segmentés à l’aide d’une contre-coloration à l’hématoxyline et en ajustant l’algorithme intrinsèque. Le seuillage est appliqué pour déterminer la positivité et la co-localisation des protéines. L’algorithme final est ensuite appliqué à l’ensemble des tissus. Les données qui en résultent permettent à l’utilisateur d’évaluer l’expression des protéines en fonction du type de tissu (par exemple, épithélium ou stroma) et du compartiment subcellulaire (noyau, cytoplasme ou membrane plasmique). L’analyse de co-localisation permet d’étudier les types de cellules doublement positives, doublement négatives et simples positives. La combinaison de l’imagerie multispectrale avec l’immunohistochimie multiplexée et l’acquisition automatisée d’images est une méthode objective et à haut débit pour l’étude des biomarqueurs dans les tissus.

Introduction

Immunohistochimie (IHC) est une technique de laboratoire standard pour la détection de la protéine dans le tissu, et IHC est encore largement utilisé dans la recherche et la pathologie de diagnostic. L'évaluation de la coloration IHC est souvent semi-quantitative, l'introduction d'un biais potentiel dans l'interprétation des résultats. De nombreuses approches semi-quantitatives ont été développés qui incorporent à la fois l' intensité de la coloration et de la portée de coloration dans le diagnostic final de 1-4. D' autres systèmes comprennent l' intensité de notation et localisation subcellulaire afin de mieux localiser l' expression 5. Incorporation des scores moyens de téléspectateurs multiples est souvent utilisé afin de minimiser les effets de polarisation unique spectateur 6. En dépit de ces efforts, la subjectivité dans l' analyse reste encore, en particulier lors de l' évaluation de la mesure de la coloration 7. Protocole de normalisation et de la subjectivité de l'entrée en minimisant humaine est primordiale pour créer des résultats précis et reproductibles IHC.

content "> Il existe d' autres options que IHC pour déterminer l' expression des protéines dans les tissus. Dans le cadre de la recherche, l' immunohistochimie a traditionnellement été considérée comme un moyen d'examiner la localisation des protéines 8, tandis que d' autres techniques telles que immunoblotting sont considérés comme l' étalon - or pour étudier l' expression des protéines . tissu Détermination ou une expression spécifique de compartiment cellulaire est difficile sans incorporer des techniques avancées telles que le fractionnement cellulaire ou microdissection laser 9,10. L'utilisation d'anticorps fluorescents sur des lames de tissus offre un compromis raisonnable, mais fond autofluorescence en raison de NADPH, lipofushines, réticulaire fibres, le collagène, l' élastine et peuvent rendre difficile une quantification précise 11.

Plates - formes de pathologie de calcul automatiques sont une voie prometteuse pour plus quantification objective de la pathologie coloration 12-15. La combinaison de l'imagerie multispectrale avec des microréseaux de tissusfacilite l'analyse à haut débit de l'expression des protéines dans les grandes tailles d'échantillon. Avec ces techniques, l' analyse des protéines co-localisation, l' hétérogénéité de coloration, et des tissus et la localisation subcellulaire est possible tout en réduisant sensiblement les préjugés et le temps nécessaire à l' analyse inhérents, tout en retournant les données d'une manière continue plutôt que le format catégorique 16. Par conséquent, le but de cette étude était de démontrer l'utilité de la méthodologie et pour effectuer des immunohistochimie multiplexé avec l'analyse, en utilisant un logiciel d'imagerie multispectrale.

Ce protocole est écrit pour le manuel, la coloration immunohistochimique multiplex d'une seule lame de coupe de tissu avec quatre anticorps monoclonaux optimisés. Comme expérience représentative, anti-lapin nucléaire récepteur alpha des œstrogènes (ERa) et du récepteur d'androgène (AR) sont multiplexés avec liée à la membrane anti-souris et CD147 lié à la membrane anti-souris de la E-cadhérine. Tout anticorps de choix peut être Substituted pour les anticorps énumérés ici, mais chaque combinaison d'anticorps nécessite une optimisation séparée. Prétraitement pour tous les anticorps doivent être identiques. Les anticorps AR et CD147 doivent être optimisés individuellement, puis comme un cocktail. Chaque anticorps est détecté en utilisant un système de polymère exempte de biotine et l'un des 4 chromogènes uniques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

NOTE: Le protocole décrit ici coloration et analyse d'un microréseau tissulaire (TMA), décrit précédemment 12,17,18. La section TMA 4 um d'épaisseur a été obtenu à partir d'un bloc de paraffine à l'aide d'un microtome standard.

NOTE: Une bibliothèque spectrale pour les 4 chromogènes et de contraste devrait être créé pour l'image de quantification. Pour ce faire, le protocole optimisé pour chaque anticorps individuel doit être exécuté avec un anticorps par diapositive, moins la contre-coloration finale. Un cinquième lame doit être colorée avec l'hématoxyline pour générer les 5 images nécessaires pour créer la bibliothèque spectrale.

1. Multiplex immunohistochimie

  1. diapositives Faire cuire dans un four à 60 ° C pendant 20 min. L'utilisation d'une hotte chimique, immerger diapositive dans 100% de xylène. Répétez l'opération pour 2 changements de xylène. Immergez diapositive dans 100% d'éthanol pendant 5 min. Répéter l'opération avec frais 100% d'éthanol.
  2. Immergez diapositive dans 95% d'éthanol pendant 3 min. Répéter l'opération avec frais95% d'éthanol. Immergez diapositive dans 70% d'éthanol pendant 3 min. Immergez glisser dans l'eau distillée pendant 3 min. Répéter l'opération avec de l'eau distillée fraîche. Tap coulissant verticalement pour évacuer l'eau de la diapositive. Appliquer 200 ul de peroxydase endogène bloqueur prête à l'emploi pendant 5 min.
  3. Égoutter peroxydase bloqueur de la diapositive et plongez dans 45 ml de tampon d'extraction prêt à l'emploi (pH inférieur à 7,0). Placer le récipient à glissière dans une cocotte-minute et démarrer le programme mis à 124 ° C pendant 4 min. Laisser autocuiseur refroidir pendant 20 min. avant l'ouverture.
  4. Retirer le contenant de tampon de récupération et laisser refroidir 10 min supplémentaires. Rincez coulissant dans l'eau distillée pendant 10 minutes. Vider l'eau de la diapositive et de délimiter soigneusement le tissu sur la lame avec un stylo barrière hydrophobe.
  5. Ajouter 200 pi de tampon phosphate salin slide (PBS) .Transfert à un récipient plat avec couvercle (chambre d'incubation) contenant de la gaze humide.
  6. Préparer 1 litre de 1 x solution saline tamponnée au Tris avec du Tween-20 (TBST) en diluant 50 ml de 20x tampon Tris salin contenant 1% de Tween-20 et 950 ml d'eau distillée.
  7. Égoutter PBS de la diapositive et appliquer 200 pi de 1x TBST. Incuber pendant 2 min. Égoutter TBST de la diapositive et revenir diapositive à la chambre d'incubation. Appliquer 200 pi de bloc de protéines universel prêt à l'emploi, à proximité chambre et incuber pendant 7 min.
  8. Égoutter bloc de protéines et de revenir diapositive à la chambre d'incubation. Diluer l'anticorps anti ERa 1: 400 en y ajoutant 0,6 ul d'anticorps à 239,4 ul de diluant d'anticorps. Appliquer 200 pi d'anticorps dilué à glisser et à proximité chambre.
  9. Incuber diapositive à la température ambiante pendant 2 heures. Égoutter anticorps à partir de lame et rincer avec TBST suivi par immersion pendant 5 min dans TBST.
  10. Égoutter TBST de la diapositive et revenir diapositive à la chambre d'incubation. Appliquer 200 pi de chèvre polymère anti-lapin peroxydase de raifort à utiliser prêt et à proximité chambre. Incuber pendant 30 min. à température ambiante. diapo Rincer à l'TBST et lieu coulissant dans le récipient de TBST pendant 5 min.
  11. Préparer brun peroxydase de raifort-3,3'-diaminobenzidine (DAB HRP) chromogène par l'addition de 8 pl de chromogène DAB pour le tampon de substrat DAB 250 ul et bien mélanger.
  12. Égoutter TBST de la diapositive, retour diapositive à la chambre d'incubation et d'appliquer 200 pi de brun chromogène HRP-DAB pendant 6 min. Rincer soigneusement la lame avec de l'eau distillée et le lieu coulissant dans un récipient d'eau distillée.
  13. Mélanger la solution dénaturante en combinant 50 ul du premier réactif d'élution avec 150 ul du second réactif tampon. Vider l'eau hors de la diapositive et appliquer une solution dénaturant diluée à la diapositive pendant 3 min. à température ambiante. Décanter et rincer réactif dénaturant avec TBST. Immergez diapositive dans TBST pendant 5 min.
  14. Préparer AR / CD147 cocktail d'anticorps par dilution de 4,2 ul d'anticorps anti-AR et 2,8 ul d'anticorps anti-CD147 avec 203 ul de diluant d'anticorps. Égoutter TBST de la diapositive, revenir diapositive à la chambre d'incubation et d'appliquer 200 pi de AR / CD147 cocktail à la diapositive. Fermer la chambre et incuber pendant 1 heure à température ambiante. diapo Rincer à l'TBST et plonger dans TBST pendant 5 min.
  15. Égoutter TBST, retour diapositive à la chambre d'incubation et d'appliquer 200 pi d'anti-lapin de polymère de la phosphatase alcaline de chèvre prête à l'emploi. Fermer la chambre et glissez incuber pendant 30 min. à température ambiante. diapo Rincer à l'TBST et plonger dans TBST pendant 5 min.
  16. Préparer rouge phosphatase alcaline chromogène en ajoutant 3,2 ul de chromogène rouge à 250 pi de tampon chromogène rouge et bien mélanger.
  17. Égoutter TBST de la diapositive et revenir diapositive à la chambre d'incubation. Appliquer 200 pi de dilution alcaline phosphatase rouge chromogène à la diapositive, à proximité chambre et incuber pendant 7 min.
  18. Égoutter chromogène et bien rincer la lame avec de l'eau distillée. Placer les lames dans un récipient d'eau distillée pendant 5 min. Vider l'eau de la diapositive, rincer à l'TBST et revenir à la chambre d'incubation. Appliquer 200 pi de chèvre polymère anti-souris-HRP à la diapositive et closchambre e. Incuber pendant 30 min. à température ambiante.
  19. Égoutter polymère de la lame et rincer avec du TBST. Placer la lame dans TBST pendant 5 min. Préparer 200 pi de pourpre chromogène HRP lié en ajoutant 3,2 ul du réactif de stabilisation à 250 pi du tampon et bien mélanger. Ajouter 3,2 pi de chromogène pourpre et bien mélanger, puis 3,2 ul du réactif de peroxyde d'hydrogène et bien mélanger.
  20. Égoutter TBST hors diapositive et appliquer 200 pl de chromogène pourpre prêt à lame et incuber pendant 7 min. à température ambiante. diapo Rincer à l'eau distillée toboggan et placer dans un récipient d'eau distillée pendant 5 min.
  21. Mélanger la solution dénaturante par mélange de 50 ul du premier réactif d'élution avec 150 ul du second réactif tampon. Vider l'eau hors de la diapositive et appliquer une solution dénaturant diluée à la diapositive pendant 3 min. à température ambiante.
  22. Rincer réactif dénaturant off avec TBST. Placer la lame dans le récipient de TBST pendant 5 min. Diluer anti- E-cadhérine anticorpsà 1: 200 en y ajoutant 1,1 ul d'anticorps à 218,9 pi du diluant d'anticorps. Égoutter le TBST de la diapositive, retour diapositive à la chambre d'incubation et d'appliquer 200 pi de E-cadhérine à la diapositive. Fermer la chambre et incuber 30 min. à température ambiante.
  23. diapo Rincer à l'TBST et lieu coulissant dans le récipient de TBST pendant 5 min. Égoutter le TBST de la diapositive, revenir diapositive à la chambre d'incubation et d'appliquer polymère HRP anti-souris 200 pi de chèvre. Incuber à température ambiante pendant 30 min. diapo Rincer à l'TBST et lieu coulissant dans le récipient de TBST pendant 5 min.
  24. Préparer noir HRP lié chromogène en ajoutant 8 pi de chromogène à 250 pi de tampon. Appliquer 200 pi chromogène à glisser et développer pendant 2 min. Rincer soigneusement diapo avec de l'eau distillée et plongez dans un récipient d'eau distillée.
  25. Diluer hématoxyline en ajoutant 40 ul hématoxyline à 200 ul d'eau distillée. Vider l'eau de la diapositive et appliquer 200 pi de hématoxyline diluée à glisser pendant 30 secondes. slide Rinsel'eau du robinet à fond en cours d'exécution pendant 2 min., puis rincer à l'eau distillée pendant 30 secondes. Placer la lame dans un four à 60 ° C pendant 15-30 min.
  26. Immergez diapositive fraîchement préparé 100% de xylène pendant 30 secondes, essuyer l'excès de xylène off et ajouter une goutte de milieu de montage permanent. Coverslip avec un n ° 1,5 lamelle.

Acquisition et analyse 2. Automated image

  1. Chargez lames colorées sur un scanner de diapositives automatique. Basé sur le diamètre, la séparation, et le nombre de noyaux TMA, de créer un protocole de balayage automatisé selon le manuel d'instructions du fabricant.
  2. Ouvrez le logiciel d'imagerie multispectrale pour construire une bibliothèque spectrale de lames de contrôle colorées avec des chromogènes individuels et le toboggan hématoxyline tachée. Ouvrez un cube image acquise à partir d'une lame de contrôle et sélectionnez quatre à cinq zones colorées positivement pour définir optiquement que chromogène. Répéter l'opération avec l'image des cubes d'autres lames de contrôle jusqu'à ce qu'une bibliothèque representi spectrale complèteng tous chromogènes est créé, puis enregistrez la bibliothèque spectrale.
  3. Commencer un nouveau projet dans le logiciel d'imagerie multispectrale. Sélectionnez "multispectrale (.im3)" pour l'option de format d'image et "Brightfield" pour le format de l'échantillon. Tout d'abord, configurer le projet en choisissant les options désirées: "Tissue Segment", "Trouver Caractéristiques", "phénotypage", "Score" et "Exporter". À ce stade, la résolution d'image peut être modifiée afin d'accélérer le temps d'analyse, si désiré.

Segmentation 3. Tissue

  1. Importez la bibliothèque spectrale précédemment créé et sélectionnez tous les chromogènes à inclure dans l'analyse.
  2. Ouvrir l'image cubes pour être inclus dans l'ensemble en sélectionnant l'option "Open Cube d'image" données d'entraînement. Pour garantir la précision de la formation, sélectionner au moins 18% du nombre total d'images à analyser. Choisissez des images qui représentent tous les états pathologiques pour augmenter la précision de la segmentation. Cette portion d'images is appelé l'ensemble des images de formation.
  3. Blanc images de l'équilibre dans la formation prévue en sélectionnant l'outil de compte-gouttes et le choix d'une zone dans une image qui est blanc.
  4. Sélectionnez le bouton "Advance" pour passer à la segmentation des tissus. Utilisez le panneau "Tissue Catégories" pour choisir les types de tissus à analyser (ie «tissu» et «non-tissu»). Pour de plus précise la localisation tissulaire de la protéine, plusieurs catégories de tissus peuvent être utilisés ( par exemple ". Épithéliums", "stroma" et "non-tissu»).
  5. Commencez à créer l'algorithme et la définition des catégories de tissus en dessinant autour de groupes de cellules à l'intérieur des images de formation. Lorsque vous avez terminé avec une catégorie de tissu, répéter pour d'autres catégories de tissus. Assurez-vous de choisir des groupes de cellules dans les images qui sont caractéristiques de ce type de catégorie de tissus.
  6. Répétez ce processus pour toutes les images au sein de l'ensemble des images de formation.
  7. Sélectionner les composants (chromogènes) à inclure dans training pour le "tissu Segmenter". Lorsque vous effectuez l'analyse des images de fond clair immunohistochimie, tous les composants sont normalement inclus dans la formation. Inclure les images de coloration négative abondantes dans la formation prévue pour éviter les biais lors de cette étape.
  8. Choisissez une "Pattern Scale" approprié pour la formation du segmenteur de tissus. Sous un grossissement de 20x, une grande échelle de modèle est généralement approprié. Lorsque vous travaillez avec des tissus avec une architecture fine sous un grossissement plus élevé, une échelle de modèle plus petit est plus approprié.
  9. Sélectionnez le bouton "Train Tissue Segmenter" pour commencer à former le segmenteur de tissus. Observer une précision boîte de pop-up affichant reflétant la proportion de pixels au sein des régions de formation qui sont correctement classés.
    REMARQUE: Le logiciel tente continuellement d'améliorer la précision de l'algorithme jusqu'à l'arrêt manuel. Nous avons déjà démontré que la formation sur 18% des images résultats dans 97% de précision de formation 12.
  10. Après le segmenteur de tissu est formé, choisissez une résolution de segment approprié. la résolution du segment correspond à temps requis pour les images du segment, avec une résolution grossière nécessitant moins de temps et une résolution fine nécessitant plus de temps.
  11. Segment l'ensemble du jeu de la formation d'images en cliquant sur "Segment Images". Laisser le logiciel suffisamment de temps pour appliquer l'algorithme à toutes les images de formation. Une fois terminé, examiner la formation prévue pour trouver tous les tissus mal classés avec l'algorithme de formation actuel.
  12. Pour affiner le processus de segmentation des tissus, ajouter, modifier ou supprimer des régions de formation de tissus. Utilisez l'option "bords de finition" si les pixels s'étendent sur les bords d'une catégorie de tissu dans un autre. Si de petits groupes de pixels sont mal classés, ajuster le seuil de la taille du segment minimum.
  13. Lorsque les modifications sont terminées, sélectionnez "Segment Images", ce sera re-former le segmenteur de tissu pour créer un nouvel algorithme pour la segmentation des tissus. L'algorithme précédentest automatiquement enregistré et peut être retourné si nécessaire.
  14. Quand à l'aise avec les résultats de l'algorithme de segmentation de tissu, avancer à la segmentation de la cellule en sélectionnant le bouton "Avancé".

4. Cellule Segmentation

  1. Choisissez les compartiments subcellulaires à inclure dans la segmentation des cellules. Assurez-vous que "Nuclei" est déjà sélectionné pour choisir "cytoplasme" ou "membrane".
    NOTE: "Membrane" segmentation ne doit être choisi lors d'un marqueur spécifique de la protéine de la membrane a été inclus dans IHC, tels que E-cadhérine.
  2. Dans l'onglet "Nuclei", il y a plusieurs options. Commencez par choisir les réglages appropriés pour la segmentation nucléaire (voir étape 4.3). Choisissez si les catégories individuelles ou tous les tissus seront inclus dans la segmentation.
  3. Sélectionnez une approche de segmentation nucléaire
    1. Sélectionnez le contre-coloration "Pixel-Based (Seuil)" approche pour une méthode simplifiée pour obtenir une bonnerésultats sans connaître beaucoup sur les paramètres de traitement d'image.
      NOTE: Cela rend souvent un bon premier choix. Lors du choix d'une approche, "Pixel-Based (Seuil)» est plus approprié quand il y a une contre-coloration nucléaire fiable, tandis que «Objet-Based" doit être utilisé s'il y a un manque de contre-coloration nucléaire cohérente.
    2. Sélectionnez le "Pixel-Based (Seuil)" approche quand il y a une contre-coloration nucléaire fiable.
      NOTE: Cette approche est purement à base de pixels. Cette approche peut également être utilisée pour d'autres besoins d'analyse d'images qui peuvent être remplies avec un simple seuil, comme la détection de tous les pixels dans une catégorie de tissu qui tache positive pour une tache IHC.
    3. Sélectionnez l'approche de l'objet à base si le nucléaire de contraste ne fournit pas une coloration uniforme et spécifique des objets nucléaires, et les approches morphométriques-plus avancées sont nécessaires pour détecter les noyaux.
    4. Sélectionnez "Composants pour la segmentation nucléaire", "Nucloreille Taille "et" Clean-up "si l'utilisateur souhaite définir davantage les paramètres de segmentation des noyaux.
  4. Sélectionnez les paramètres de forme cytoplasme
    1. Sélectionnez le bouton "Advance" pour passer à la segmentation cytoplasme.
      NOTE: Il existe plusieurs options dans le cytoplasme segmentation à choisir. L'option appelée «distance intérieure au noyau" est à base de pixels. Elle reflète la distance entre l'extérieur du noyau et l'intérieur du cytoplasme. L'augmentation de cette valeur diminue la probabilité que le signal nucléaire traverse dans le compartiment de cytoplasme.
    2. Sélectionnez ensuite, «distance extérieure au noyau".
      NOTE: Ceci est également basé sur les pixels. La distance extérieure au noyau reflète la distance entre l'extérieur du noyau et l'extérieur de la cellule. Cette valeur peut être grande ou assez petit pour inclure ou exclure des signaux de la membrane si on le souhaite.
    3. Next select, "taille minimale".
      NOTE: La taille minimale, pixel base, reflète la taille de l'échantillon de cytoplasme minimum pour être inclus dans l'analyse. Si la taille du cytoplasme est plus petite dans une cellule particulière telle que lorsque les cellules sont serrées ensemble, cette segmentation cytoplasme est exclu de l'analyse.
    4. Sélectionnez l'option suivante, "Component" avec "primaire", "secondaire", et sélectionnez "tertiaire" comme des options secondaires.
      NOTE: Ici on peut choisir un marqueur cytoplasmique spécifique. Semblable à la segmentation nucléaire, si un marqueur spécifique IHC cytoplasmique a été utilisé, ce composant peut être utilisé pour définir le cytoplasme en trouvant une valeur de seuil minimum. Ceci aide à définir le cytoplasme mais pas nécessaire pour une précision acceptable.
    5. Le passage à la dernière des trois options à onglets est "Membrane". Ici, l'utilisateur définit le compartiment à membrane avec un marqueur protéique. Choisissez "primaire", "secondaire", et / ou «tertiaire» pour chaque marqueur spécifique de la membrane utilisée. Réglez "pleine échelle OD "pour trouver un seuil minimum ou un point positif pour chaque marqueur sur les membranes cellulaires.
    6. Poursuivant sous l'onglet "Membrane" et sélectionnez l'option "Taille maximale de cellule".
      NOTE: Ceci est la distance à la valeur de la membrane, en pixels, qui spécifie la taille maximale des cellules. Une valeur de 12 est normalement approprié pour les images prises à un grossissement de 20x.
    7. Après avoir sélectionné toutes les options, sélectionnez "Segment image" ou "Segment All". Appliquer les paramètres pour les images et les observer «individuellement» ou en mode «Galerie».
      REMARQUE: Réglez les paramètres et les seuils si nécessaire, et re-segment jusqu'à satisfait des résultats de segmentation des cellules dans l'ensemble des images de formation.

5. phénotypage de cellules

REMARQUE: précise la cellule de segmentation est nécessaire afin d'obtenir le phénotypage cellulaire précise, et la fonction de phénotypage est trainable.

  1. Utilisez la fonction "Ajouter &# 34; bouton pour ajouter phénotypes à la liste des "phénotypes". Les utilisateurs peuvent sélectionner une couleur pour le phénotype.
  2. Cliquez sur "Modifier phénotypes" pour attribuer un phénotype à une cellule. Cliquez sur une cellule particulière pour faire apparaître un menu déroulant, permettant à l'utilisateur de choisir le phénotype et de passer ensuite. Identifier au moins cinq (5) cellules dans chaque phénotype afin de procéder. 25 Le choix d'une ou plusieurs cellules de chaque phénotype est nécessaire pour obtenir des résultats optimaux.

6. La notation IHC et co-localisation

  1. Choisissez "Advance" pour passer à la "Score IHC ou IF" étape. Choisissez une "Catégorie de tissu" de marquer.
    NOTE: Une seule catégorie de tissu peut être marqué au cours d'une analyse particulière, mais si les résultats de la notation dans une autre catégorie de tissus sont souhaités, l'analyse peut être répétée plus tard avec des paramètres différents.
  2. Choisissez un type désiré "Scoring".
    NOTE: Positivity crée deux bacs (positifs et négatifs) pour un composant d'intérêt, Tout en double positivité est utilisé pour l'analyse de co-localisation. D'autres options incluent 4-bin, 10-bin, et 50-bin analyses pour un marqueur de choix.
  3. Choisissez la cellule "Compartiment" pour être utilisé dans la notation analyse.
  4. Semblable à trouver un seuil minimal pour la composante nucléaire primaire, sélectionnez "Voir les données des composants" et déplacez le curseur sur les images de formation pour trouver des seuils minimaux de densité optique appropriés de coloration pour les cellules positives pour le composant (s) d'intérêt.
  5. Si les cellules intensément colorées sont à exclure, abaisser le seuil maximum à un niveau approprié. Sinon, utilisez le bouton automatique pour choisir un maximum de seuil pour l'analyse.
  6. Choisissez la formation d'images pour marquer dans le but de valider les valeurs de seuillage.
    NOTE: Le pourcentage de cellules dans un bac particulier sera retourné et peut être comparé par inspection visuelle ou le comptage manuel. Une fois terminé, sélectionnez "Advance" pour passer à l'étape "Exporter".

7. L'application de l'algorithme et Batch Analysis

  1. Testez l'algorithme créé par la segmentation des tissus, la segmentation de la cellule, et les valeurs de notation en exportant les données pour l'ensemble de la formation. Suivez les invites pour créer un nouveau dossier pour le répertoire d'exportation. Sélectionnez les images et les tables à créer et inclus dans l'analyse. Effectuer l'analyse en sélectionnant "Exporter pour tous».
  2. Les tableaux sont exportés dans des fichiers texte séparés par des tabulations et peuvent être ouverts dans la plupart des programmes d'analyse de données.
  3. Lorsque l'analyse est terminée, afficher les données de segmentation de la cellule et de notation pour les images à la fois haute et basse coloration pour évaluer la précision des réglages.
  4. Lorsque vous êtes satisfait des paramètres, appliquer l'algorithme créé à partir de l'ensemble de formation d'images à l'ensemble des images par le biais d'analyses de lots. Cliquez sur l'onglet "Analyse par lots» et un algorithme sera copié à partir du projet actif.
  5. Choisissez un nouveau répertoire d'exportation et sélectionner les images et les tables doivent être inclus dans l'analyse. Sous l'option fichiers d'entrée, sélectionnez "Ajouter des images" et choisissez toutes les images à inclure dans l'analyse par lots.
  6. Effectuer l'analyse en sélectionnant l'option "Exécuter". Comme pour l'analyse de l'ensemble de la formation, cette étape nécessitera une quantité de temps variable, en fonction des paramètres particuliers et le nombre d'images incluses dans l'analyse.
  7. Une fois terminé, passer à l'onglet «Revue / Fusionner". Le répertoire de lot par défaut dans le répertoire d'exportation de l'analyse des lots et peuvent être modifiés si on le souhaite. Sélectionnez "Inclure tous" et sélectionnez "Fusionner" pour créer des feuilles de données avec des données de synthèse pour l'analyse.

8. Analyse des données Exporté

  1. Ouvrez les tables exportées dans le logiciel d'analyse de données et de supprimer ou masquer des colonnes de données qui ne sont pas pertinents à l'analyse, tels que les valeurs minimales et maximales pour chaque composant. Les données primaires utilisées dans l'analyse est dans la moyenne densité optique cOLONNE pour chaque composant.
  2. Critique exporté des cartes de segmentation et des images brutes afin de déterminer quels échantillons ou noyaux TMA doivent être exclus de l'analyse. Les valeurs de pourcentage de tissus aident à déterminer si un échantillon doit être inclus ou non, avec une coupure arbitraire de <5% utilisée le plus souvent pour les critères d'exclusion.
  3. Supprimer les données ou les lignes contenant des échantillons non pertinents à exclure de l'analyse des données.
  4. Utiliser les données de quantification des protéines pour étudier les changements dans l' état ​​de la maladie ou la relation avec les caractéristiques clinico-pathologiques de la maladie 12,18-21.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Sur la figure 1, la formation est effectuée sur des tissus de la prostate à des images de segments dans l' épithélium et du stroma des parties, ainsi que le compartiment non tissulaire. En utilisant le marqueur membranaire E-cadhérine épithéliale, la segmentation des cellules a été réalisée pour séparer le noyau, cytoplasme, et les parties de membrane, illustré à la figure 2.

Dans une expé...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

L'utilisation d' une immunohistochimie traditionnelle pour l' évaluation de l' expression des protéines est limitée par des méthodes subjectives, semi-quantitative de l' analyse 22,23. plates-formes de Advance ont été créés pour l'analyse à haut débit de l'expression des biomarqueurs et de la localisation. segmentation détaillée des deux tissus et compartiments subcellulaires permet aux utilisateurs d'étudier l'expression des biomarqueurs, la localisation et la co-localisat...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient l'Université du Wisconsin Initiatives de recherche translationnelle dans le laboratoire de pathologie, en partie soutenu par le Département UW de pathologie et de médecine de laboratoire et UWCCC subvention P30 CA014520, pour l'utilisation de ses installations et ses services.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
XyleneFisher ChemicalX3F1GALCote NFPA : Santé &ndash ; 2, Incendie &ndash ; 3 , Réactivité &ndash ; 0
Alcool éthylique-200 proofFisher Scientific4355223Cote NFPA : Santé &ndash ; 0, Feu &ndash ; 3 , Réactivité &ndash ; 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Feu &ndash ; 0 , Réactivité &ndash ; 0
Tris Hydroxyméthyl aminométhane HClFisher ScientificBP153-1Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Feu &ndash ; 0 , Réactivité &ndash ; 0
Tween 20Chem-Impex1512Cote NFPA : Santé &ndash ; 0, Feu &ndash ; 1 , Réactivité &ndash ; 0
Saline tamponnée au phosphateFisher ScientificBP2944-100Cote NFPA : Santé &ndash ; 1, Feu &ndash ; 0 , Réactivité &ndash ; 0
PeroxidazedBiocare MedicalPX968Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Peut provoquer une irritation de la peau et des lésions oculaires.
Récepteur d’œstrogène alphaThermo Fisher Scientific-LabvisionRM9101Non classé comme dangereux
Récepteur aux androgènesSCBTsc-816Non classé comme dangereux
CD147BiodesignP87535MNon classé comme dangereux
E-cadhérineDakoM3612Non classé comme dangereux
Renoir Red Andibody DiluantBiocare PD904Il est spécialement conçu pour fonctionner avec des anticorps à base de Tris
.Biocare MedicalModel DC2002Prenez des précautions normales lors de l’utilisation d’un autocuiseur
Stylo barrière-Immuno Edge  ;Vector LabsH-4000
Kit de dénaturation-Étape d’élutionBiocare MedicalDNS001HNon classé comme dangereux
Mach 2 Chèvre anti-Lapin HRP PolymèreBiocareRHRP520Non classé comme dangereux
Mach 2 Chèvre anti-Lapin AP PolymèreBiocare MedicalRALP525Non classé comme dangereux
Mach 2 Chèvre Anti-Souris HRP PolymèreBiocare MedicalM3M530Non classé comme dangereux
Bétazoïde DAB Chromogène KitBiocare MedicalBDB20041. On sait que le DAB est suspecté d’être cancérogène.
2. N’exposez pas les composants DAB à une forte lumière ou à la lumière directe du soleil.
3. Portez un équipement et des vêtements de protection individuelle appropriés.
4. Le DAB peut provoquer une sensibilisation de la peau. Evitez tout contact avec la peau et les yeux.
5. Respectez tous les environnements fédéraux, étatiques et locaux concernant l’élimination
Warp Red Chromogen KitBiocare MedicalWR806Corrosive. Acide pouvant provoquer une irritation de la peau ou des lésions oculaires.
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807Nocif en cas d’ingestion
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807Liquide inflammable. Tenir à l’abri de la chaleur, des flammes et des étincelles. Nocif par ingestion ou absorption. Évitez tout contact avec la peau ou les yeux et évitez l’inhalation.
Hématoxylinpour chat Biocare MedicalCATHEViolet   ; solution   ; avec   ; a   ; Doux   ; acétique   ; acide   ; (vinaigre)   ; odeur.   ; Mai   ; be
  ; irritant   ; à   ; peau   ; ou   ; yeux.   ; Éviter   ; Contacter   ; avec   ; peau   ; et   ; yeux.   ; Éviter   ; ingestion.
Support de montage XYLRichard Allen8312-4Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Incendie &ndash ; 3 , Réactivité &ndash ; 0
1,5 Lamelles de protection FisherBrand22266858Bords tranchants
Incubation (humidité)ChambreobsolèteobsolètePlusieurs fournisseurs disponibles
Four à convectionStabil- ThermC-4008-Q
Contexte Réactif de blocage du punisseurBiocare MedicalBP974Ce produit n’est pas classé comme dangereux.
Logiciel inFormPerkinElmerCLS135781Logiciel d’imagerie multispectrale primaire utilisé dans les manuscrits
Logiciel NuancePerkinElmerNuance EXLogiciel utilisé pour la création de bibliothèques spectrales dans les manuscrits
Vectra Microscope et scanner de lamesPerkinElmerVECTRAScanner de lames et microscope automatisés pour l’obtention de cubes d’image IM3
médical

Références

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42(2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102(2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Immunohistochimie multiplexéeQuantification de l'expression protéiqueAnalyse de la colocalisation protéiqueAlgorithme de segmentation tissulaireCréation de bibliothèque spectraleMéthodes de détection des chromogènesAcquisition d'images automatiséeAnalyse des compartiments subcellulairesTissus d'étude des biomarqueurs
Quantification de l'expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.