Quantification de l'expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

Summary

L’immunohistochimie est une technique de laboratoire puissante pour évaluer la localisation et l’expression des protéines dans les tissus. Les méthodes semi-automatisées actuelles de quantification introduisent de la subjectivité et créent souvent des résultats irreproductibles. Nous décrivons ici des méthodes d’immunohistochimie multiplexée et de quantification objective de l’expression et de la co-localisation des protéines à l’aide de l’imagerie multispectrale.

Abstract

L’immunohistochimie est une technique de détection clinique et de recherche couramment utilisée pour étudier l’expression et la localisation des protéines dans les tissus. De nombreux systèmes semi-quantitatifs ont été développés pour marquer l’expression à l’aide de l’immunohistochimie, mais la subjectivité inhérente limite la reproductibilité et la précision des résultats. De plus, l’étude de biomarqueurs se chevauchant spatialement tels que les facteurs de transcription nucléaire est difficile avec les techniques actuelles d’immunohistochimie. Nous avons développé et optimisé un système d’investigation simultanée de plusieurs protéines en utilisant des méthodes à haut débit d’immunohistochimie multiplexée et d’imagerie multispectrale. L’immunohistochimie multiplexée est réalisée par application séquentielle d’anticorps primaires avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort ou à la phosphatase alcaline. Différents chromogènes sont utilisés pour détecter chaque protéine d’intérêt. Les lames colorées sont chargées dans un scanner de lames automatisé et un protocole est créé pour l’acquisition automatisée d’images. Une bibliothèque spectrale est créée en colorant un ensemble de lames avec un seul chromogène sur chacune. Un sous-ensemble d’images colorées représentatives est importé dans un logiciel d’imagerie multispectrale et un algorithme permettant de distinguer le type de tissu est créé en définissant des compartiments tissulaires sur les images. Les compartiments subcellulaires sont segmentés à l’aide d’une contre-coloration à l’hématoxyline et en ajustant l’algorithme intrinsèque. Le seuillage est appliqué pour déterminer la positivité et la co-localisation des protéines. L’algorithme final est ensuite appliqué à l’ensemble des tissus. Les données qui en résultent permettent à l’utilisateur d’évaluer l’expression des protéines en fonction du type de tissu (par exemple, épithélium ou stroma) et du compartiment subcellulaire (noyau, cytoplasme ou membrane plasmique). L’analyse de co-localisation permet d’étudier les types de cellules doublement positives, doublement négatives et simples positives. La combinaison de l’imagerie multispectrale avec l’immunohistochimie multiplexée et l’acquisition automatisée d’images est une méthode objective et à haut débit pour l’étude des biomarqueurs dans les tissus.

Introduction

Immunohistochimie (IHC) est une technique de laboratoire standard pour la détection de la protéine dans le tissu, et IHC est encore largement utilisé dans la recherche et la pathologie de diagnostic. L'évaluation de la coloration IHC est souvent semi-quantitative, l'introduction d'un biais potentiel dans l'interprétation des résultats. De nombreuses approches semi-quantitatives ont été développés qui incorporent à la fois l' intensité de la coloration et de la portée de coloration dans le diagnostic final de ^1-4. D' autres systèmes comprennent l' intensité de notation et localisation subcellulaire afin de mieux localiser l....

Protocol

NOTE: Le protocole décrit ici coloration et analyse d'un microréseau tissulaire (TMA), décrit précédemment ^12,17,18. La section TMA 4 um d'épaisseur a été obtenu à partir d'un bloc de paraffine à l'aide d'un microtome standard.

NOTE: Une bibliothèque spectrale pour les 4 chromogènes et de contraste devrait être créé pour l'image de quantification. Pour ce faire, le protocole optimisé pour chaque anticorps individuel doit être exécuté avec un anticorps par diapositive, moins la contre-coloration finale. Un cinquième lame doit être colorée avec l'hématoxyline pour générer les 5 images nécessaires pour créer la bibliothèque spectrale.

Results

Sur la figure 1, la formation est effectuée sur des tissus de la prostate à des images de segments dans l' épithélium et du stroma des parties, ainsi que le compartiment non tissulaire. En utilisant le marqueur membranaire E-cadhérine épithéliale, la segmentation des cellules a été réalisée pour séparer le noyau, cytoplasme, et les parties de membrane, illustré à la figure 2.

Dans une expérien.......

Discussion

L'utilisation d' une immunohistochimie traditionnelle pour l' évaluation de l' expression des protéines est limitée par des méthodes subjectives, semi-quantitative de l' analyse ^22,23. plates-formes de Advance ont été créés pour l'analyse à haut débit de l'expression des biomarqueurs et de la localisation. segmentation détaillée des deux tissus et compartiments subcellulaires permet aux utilisateurs d'étudier l'expression des biomarqueurs, la localisation et la co-localisat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3F1GAL	Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Incendie &ndash ; 3 , Réactivité &ndash ; 0
Alcool éthylique-200 proof	Fisher Scientific	4355223	Cote NFPA : Santé &ndash ; 0, Feu &ndash ; 3 , Réactivité &ndash ; 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Feu &ndash ; 0 , Réactivité &ndash ; 0
Tris Hydroxyméthyl aminométhane HCl	Fisher Scientific	BP153-1	Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Feu &ndash ; 0 , Réactivité &ndash ; 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	Cote NFPA : Santé &ndash ; 0, Feu &ndash ; 1 , Réactivité &ndash ; 0
Saline tamponnée au phosphate	Fisher Scientific	BP2944-100	Cote NFPA : Santé &ndash ; 1, Feu &ndash ; 0 , Réactivité &ndash ; 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Peut provoquer une irritation de la peau et des lésions oculaires.
Récepteur d’œstrogène alpha	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	Non classé comme dangereux
Récepteur aux androgènes	SCBT	sc-816	Non classé comme dangereux
CD147	Biodesign	P87535M	Non classé comme dangereux
E-cadhérine	Dako	M3612	Non classé comme dangereux
Renoir Red Andibody Diluant	Biocare	PD904	Il est spécialement conçu pour fonctionner avec des anticorps à base de Tris
.	Biocare Medical	Model DC2002	Prenez des précautions normales lors de l’utilisation d’un autocuiseur
Stylo barrière-Immuno Edge  ;	Vector Labs	H-4000
Kit de dénaturation-Étape d’élution	Biocare Medical	DNS001H	Non classé comme dangereux
Mach 2 Chèvre anti-Lapin HRP Polymère	Biocare	RHRP520	Non classé comme dangereux
Mach 2 Chèvre anti-Lapin AP Polymère	Biocare Medical	RALP525	Non classé comme dangereux
Mach 2 Chèvre Anti-Souris HRP Polymère	Biocare Medical	M3M530	Non classé comme dangereux
Bétazoïde DAB Chromogène Kit	Biocare Medical	BDB2004	1. On sait que le DAB est suspecté d’être cancérogène. 2. N’exposez pas les composants DAB à une forte lumière ou à la lumière directe du soleil. 3. Portez un équipement et des vêtements de protection individuelle appropriés. 4. Le DAB peut provoquer une sensibilisation de la peau. Evitez tout contact avec la peau et les yeux. 5. Respectez tous les environnements fédéraux, étatiques et locaux concernant l’élimination
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	Corrosive. Acide pouvant provoquer une irritation de la peau ou des lésions oculaires.
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	Nocif en cas d’ingestion
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	Liquide inflammable. Tenir à l’abri de la chaleur, des flammes et des étincelles. Nocif par ingestion ou absorption. Évitez tout contact avec la peau ou les yeux et évitez l’inhalation.
Hématoxylin	pour chat Biocare Medical	CATHE	Violet   ; solution   ; avec   ; a   ; Doux   ; acétique   ; acide   ; (vinaigre)   ; odeur.   ; Mai   ; be   ; irritant   ; à   ; peau   ; ou   ; yeux.   ; Éviter   ; Contacter   ; avec   ; peau   ; et   ; yeux.   ; Éviter   ; ingestion.
Support de montage XYL	Richard Allen	8312-4	Cote NFPA : Santé &ndash ; 2, Incendie &ndash ; 3 , Réactivité &ndash ; 0
1,5 Lamelles de protection Fisher	Brand	22266858	Bords tranchants
Incubation (humidité)Chambre	obsolète	obsolète	Plusieurs fournisseurs disponibles
Four à convection	Stabil- Therm	C-4008-Q
Contexte Réactif de blocage du punisseur	Biocare Medical	BP974	Ce produit n’est pas classé comme dangereux.
Logiciel inForm	PerkinElmer	CLS135781	Logiciel d’imagerie multispectrale primaire utilisé dans les manuscrits
Logiciel Nuance	PerkinElmer	Nuance EX	Logiciel utilisé pour la création de bibliothèques spectrales dans les manuscrits
Vectra Microscope et scanner de lames	PerkinElmer	VECTRA	Scanner de lames et microscope automatisés pour l’obtention de cubes d’image IM3