Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l'ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Summary

Utilisation de l'assemblage de l'ADN, de multiples vecteurs de CRISPR peuvent être construits en parallèle dans une réaction de clonage unique, ce qui rend la construction d'un grand nombre de vecteurs CRISPR une tâche simple. Tomate racines chevelues sont un excellent modèle pour valider des vecteurs CRISPR et de générer des matériaux mutantes.

Abstract

Les mutations ciblées de l’ADN générées par des vecteurs dotés de la technologie CRISPR/Cas9 se sont avérées utiles pour les études de génomique fonctionnelle. Bien que la plupart des stratégies de clonage soient simples à réaliser, elles utilisent généralement plusieurs étapes et peuvent prendre plusieurs jours pour générer les constructions finales. La méthode présentée ici est basée sur l’assemblage de l’ADN et peut produire des vecteurs CRISPR entièrement fonctionnels en une seule réaction de clonage. La construction vectorielle peut également être regroupée, ce qui augmente encore l’efficacité et l’utilité du processus. Une modification de la méthode est utilisée pour créer des vecteurs CRISPR avec plusieurs cibles génétiques. Les vecteurs CRISPR sont ensuite transformés en racines poilues de tomate pour générer des matériaux transgéniques avec des modifications ciblées de l’ADN. Les racines poilues sont un système utile pour tester la fonctionnalité des vecteurs, car elles sont techniquement simples à générer et se prêtent à une production à grande échelle. Les méthodes présentées ici auront une large application car elles peuvent être utilisées pour générer une variété de vecteurs CRISPR et être utilisées dans un large éventail d’espèces végétales.

Introduction

La capacité de générer des modifications d'ADN ciblées avec CRISPR / cas9 a un grand potentiel pour les études de génomique fonctionnelle. Il y a deux composantes du système CRISPR / cas9; la nucléase cas9, provenant de Staphylococcus pyogenes et d'environ 100 nt ARN guide (ARNg) molécule qui dirige cas9 vers le site d'ADN cible (s) ^1. Reconnaissance cible est conférée par la première ~ 20 nt de l'gARN, ce qui permet une production à haut débit de vecteurs de ciblage ^2,3. La plupart des organismes qui peuvent être conçus, ont déjà été avec CRISPR technologie / cas9 ^4,5.

Dans les pl....

Protocol

1. Guide ARN Conception et Vector Construction

1. Identifier les séquences cibles pour des gènes d'intérêt. Il existe une variété de programmes cibles d'enquête CRISPR en ligne appropriés pour cette étape ^13,14.
   NOTE: Ici , nous utilisons le GG motif GN ₂₀ cible, mais d' autres modèles peuvent être adaptés en fonction du système d'application ou vecteur utilisé.
2. Conception 60-mer oligos gARN pour inclure la partie GN ₁₉ des motifs cibles flanquées 5 'et 3' des séquences 20-nt qui sont nécessaires pour l' assemblage d'ADN. Le dernier motif 60-mer est: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-....

Results

construction de vecteur de CRISPR avec l'assemblage d'ADN génère généralement des dizaines à des centaines de clones indépendants. Colony dépistage par PCR identifie facilement clones corrects et peut distinguer entre les plasmides avec et sans inserts (figure 2A) qui est utile pour le dépannage. En règle générale, tous les clones contiennent un insert et un utilisateur peut choisir de sauter les étapes de criblage des colonies tout à fait. Digests de diagnostic .......

Discussion

Étant donné que l’assemblage de l’ADN est utilisé pour recombiner toutes les séquences d’ADN qui se chevauchent, cette méthode de clonage peut être appliquée à n’importe quelle construction de vecteur CRISPR. La plupart des schémas de clonage CRISPR utilisent soit la synthèse génique de l’ARNg, soit les enzymes de restriction de type IIS^17,18, soit la PCR¹⁹ d’extension de chevauchement. Chacune de ces techniques présente des avantages et des inconvénients inhérents, mais elles nécessitent généraleme.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder® ; (Mélange d’assemblage d’ADN HiFi)	New England Biolabs	E5520
p201N :Cas9	Addgene	59175	Le plasmide p201H :Cas9 (59176) est également compatible avec les chevauchements et les enzymes signalés.
pUC gRNA Shuttle	Addgene	47024
SwaI	New England Biolabs	R0604S
SpeI	New England Biolabs	R0133S
Purification propre et concentrateur-5 colonnes	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	New England Biolabs	B7202S
NEB CutSmart (tampon 4)	New England Biolabs	B7204S
Tampon NEB 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column (préparation des plasmides)	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF® ;	New England Biolabs	R3195S
StyI-HF® ;	New England Biolabs	R3500S
MS Sels + Gamborg Vitamins	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel&trade ; (gomme gellane)	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 Boites	Sigma Aldrich	V8505
Micropore&trade ; ruban chirurgical	3M	1535-0
Timentin® ; (Ticarcilline/Acide clavulanique)	Divers	0029-6571-26
Apprêts 5' → ; 3'SwaI_MtU6F
;	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R  ;   ;	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ÉchafaudageF  ;	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R  ;	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	Ne peut pas être utilisé pour le séquençage de Sanger car il existe un deuxième site de liaison sur le plasmide
UNS1_Scaffold R  ;	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F  ;   ;	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R  ;
séquences en gras indiquent des chevauchements de 20 nt nt avec p201N :Cas9 linéarisé.