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Article de méthode

Transfert de gènes dans l'organe de poulet Auditory par

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⸱

DOI :

10.3791/53864

⸱

17 avril 2016

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

Dans cet article

Résumé

L’organe auditif médie l’audition. Nous présentons ici une méthode modifiée de micro-électroporation in ovo optimisée pour l’étude de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices auditives dans l’organe auditif du poulet en développement.

Résumé

Embryons de poulet sont des systèmes modèles idéaux pour l' étude du développement embryonnaire manipulations de la fonction des gènes peuvent être effectuées avec une relative facilité in ovo. L'organe sensoriel auditif de l'oreille interne est essentiel pour notre capacité à entendre. Il abrite un épithélium hautement spécialisé sensorielle qui se compose de cellules ciliées mécano-transduction (CAH) et entourant gliales comme des cellules de soutien (SC). En dépit des différences structurelles dans les organes auditifs, les mécanismes moléculaires qui régulent le développement de l'organe auditif sont évolutivement conservées entre mammifères et aves Dans électroporation ovo est en grande partie limitée aux premiers stades de E1 -. E3. En raison du développement tardif relatif de l'organe auditif à E5, les manipulations de l'organe auditif par électroporation ovo passé E3 sont difficiles en raison du développement avancé de l'embryon de poulet aux stades ultérieurs. La méthode présentée ici est une méthode de transfert de gène transitoire pour le ciblage de gènes d'intérêt àétape E4 - E4.5 dans l'organe sensoriel auditif de poulet en développement par l' intermédiaire d' in ovo micro-électroporation. Cette méthode est applicable à intensité forte et perte de fonctions avec le plasmide classique des vecteurs d'expression à base d' ADN et peut être combiné avec dans un essai de prolifération cellulaire in ovo en y ajoutant EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) pour l'ensemble de l' embryon au le temps de l'électroporation. L'utilisation de la protéine fluorescente verte ou rouge (GFP ou RFP) plasmides d'expression permet à l'expérimentateur de déterminer rapidement si le succès électroporation ciblé la partie auditive de l'oreille interne en développement. Dans cette méthode papier, des exemples représentatifs des spécimens de GFP électroporation sont illustrés; les embryons ont été récoltées 18-96 heures après l' électroporation et le ciblage de la GFP dans la région pro-sensorielle de l'organe auditif a été confirmée par hybridation d' ARN in situ. Le document de la méthode fournit également un protocole optimisé pour l'utilisation de la thymidine analogique EdU pour analyser des cellules prolifration; un exemple d'un essai de prolifération cellulaire sur la base EdU qui combine l'immuno-marquage et cliquer sur le EdU chimie est fourni.

Introduction

En dépit des différences dans la morphologie et la structuration cellulaire entre le mammifère et l' organe sensoriel auditif aviaire, les facteurs moléculaires et les voies responsables du développement de HC sensorielle sont pensés pour être évolutivement conservée 1-3. La papille basilaire, qui abrite le HCS auditifs et leurs SCs environnantes, se développe comme un outpocketing du otocyste de l'oreille interne. Au début d'une piscine de progéniteurs HC et SC est spécifié dans le / otique domaine compétente tasse neuronal-sensorielle placode otique (NSD). Les données cartographiques destin montrent que les lignées de neurones sensoriels et sont liés et découlent de la NSD située dans la région antéro-ventrale de la coupelle ou otique otocyste chez les souris et les poulets 4,5. Tout d'abord, les neuroblastes délaminage de la NSD pour donner naissance à des neurones du ganglion auditif-vestibulaire, qui a finalement divisé en ganglion auditive et vestibulaire. Ces neurones innervent les CAH sensorielles de l'oreille interne et des noyaux du tronc cérébral. Les cellules ièmeà rester dans le NSD sont pensés pour donner lieu à divers patchs sensoriels, y compris l'organe sensoriel auditif, composé des CAH sensorielles mécano-transduction et leurs SCs associés.

Dans les deux le poussin et murin, progéniteur sensorielle sortie du cycle cellulaire organe auditif et la différenciation HC se produisent dans des gradients opposés. Dans poussin, la sortie du cycle cellulaire progéniteur auditif commence autour ~ E5 et progresse depuis la base jusqu'au sommet, et du centre vers la périphérie 6. Un jour plus tard, la différenciation HC commence au sommet et avance vers la base 7. L' étude du développement de l'oreille interne chez le poulet présente de nombreux avantages techniques des mécanismes fonctionnels peuvent être étudiés avec une relative facilité in ovo , par opposition à la manipulation d' embryons in utero dans d' autres systèmes modèles, ce qui nécessite des chirurgies complexes. La méthode décrite ici utilise en micro-électroporation ovo pour cibler des gènes d'intérêt dans le Basila présomptifr zone papille antéro-ventral dans la vésicule otique spécifiquement à E4.

Électroporation in ovo est une technique qui est bien établie et couramment utilisé 8-14. Le principe de la technique d'électroporation est basée sur le fait que les nucléotides (par exemple, ADN plasmidique, l' ADN synthétique, l' ARN ou des oligonucléotides) sont chargées négativement. L'ADN est injecté dans le tissu d'intérêt. Lorsqu'un courant électrique est placé à travers le tissu, le courant transitoire ouvre les pores dans les parois cellulaires et permet l'absorption de l'ADN, sous forme de flux de l'ADN chargé négativement vers l'électrode positive (anode). Pour des expériences de gain de fonction, les gènes d'intérêt sont généralement sous-clonés dans des plasmides d'expression qui contiennent des cassettes d'expression appropriés pour la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente rouge (RFP). Pour la perte de fonction des expériences dominantes des constructions à base de plasmide négatif répresseurs ou ARNi ou constructions morpholino sont commonly utilisé 15,16. Pour inhiber microARN (miARN) miARN fonction d' assemblage d'épongé, qui sont généralement à base de plasmide, peut être utilisé 17. La méthode décrite ici permet d'enquêter sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent la prolifération et la différenciation dans l'organe auditif, comme dans la méthode micro-électroporation ovo peut être facilement combiné avec dans le dosage de prolifération cellulaire ovo en ajoutant EdU à l'ensemble de l' embryon.

L'électroporation et l'addition de EdU est effectuée à E4 dans la vésicule otique, qui est un jour avant le début de la sortie du cycle cellulaire dans l'organe auditif. L'analyse de l'organe auditif est généralement effectuée 18-96 heures après électroporation à E5 (début de sortie du cycle cellulaire progéniteur sensorielle), E6 (début de la différenciation HC) et E7 (lors de la différenciation HC); et plus tard jusqu'à ~ E9 (fin de la différenciation des HC). Cette méthode d'électroporation de transfert de gènes est transitoire d'une durée approximative ~ 4 jours, because les gènes d'intérêt ne pas intégrer dans le génome, mais la méthode est applicable pour une utilisation avec le plasmide approprié des vecteurs d'expression à base d' ADN, qui ont la capacité d'intégrer dans le génome, comme le transfert de gène Tol2 médiée 11. Avec cette méthode de GFP robuste ou une expression RFP dure ~ 4 jours dans la cochlée, après quoi les signaux pointent fanent, mais fournissent une fenêtre de temps suffisant pour étudier le développement complexe de l'organe auditif. Cette in ovo méthode de transfert de gènes est nouveau et permet de cibler spécifiquement l'organe auditif présomptif à E4, qui est optimal pour les enquêtes qui mettent l' accent sur ​​le développement de HC dans l'organe auditif. Il est un bon ajout à d' autres méthodes, qui électroporation à des stades de développement beaucoup plus jeunes ou 11,12 par rapport à l'utilisation de cultures in vitro d'explants de papilles basilaire 18.

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Protocole

Les œufs et les embryons non éclos sont soignés et traités de façon éthique et humainement. Tous les protocoles pour l'utilisation d'embryons non éclos ont été approuvés par le soin des animaux et l'utilisation Comité à la Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Les œufs et la préparation de constructions d'expression

  1. Des œufs:
    1. Incuber 3 - 4 douzaine oeufs fécondés de poulet (Gallus gallus) à plat sur ​​leurs côtés à 37 ° C.
      1. Après 24 heures d'incubation, tirez 3 cc de l'albumine avec une seringue de l'extrémité ronde arrière de l'œuf et sceller le trou avec du ruban adhésif transparent. Cela crée une chambre d'air entre l'embryon et la coquille, ce qui permet la facilité d'accès à l'embryon sans l'embryon coller à la coque lors de la coupe de la fenêtre d'accès au - dessus de l'œuf 19.
      2. A 117 heures de temps d'incubation, le stade des embryons en fonction de Hamburger et Hamilton 20 stades de développementà E4 (HH24-25) (voir la figure 1D).
  2. Expression Construit:
    1. Préparer l'ADN plasmidique en utilisant des réactifs et le protocole fourni par le fabricant d'un kit de préparation disponible dans le commerce. Lors de l'étape finale de la préparation, éluer l'ADN dans 500 ul de TE (Tris-EDTA), le tampon fourni dans le kit dans un tube de 1,5 ml.
    2. Éthanol précipite l'ADN à concentrer en ajoutant 50 ul de 3 M d'acétate de sodium et 1 ml d'éthanol à 100% dans le tube. Placer le tube à -20 ° CO / N.
    3. Centrifuger le tube pendant 30 min à 14000 rpm à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher à l'air le culot pendant 10 min à température ambiante. Dissoudre le culot dans un tampon TE 15 pi, ce qui devrait conduire à une concentration de ~ 4 pg / pl.
      REMARQUE: Les constructions d'expression de contrôle utilisés ici sont PMES-IRES-GFP 10 qui est entraînée par un promoteur β-actine de poulet ou pCI-H2B-IRES-DP 10 qui est entraînée par le promoteur CMV.

2. Poulet En Ovo Micro-électroporation et In Ovo Cell Proliferation Assay

  1. Dans Ovo Micro-injection d'expression Construct et Micro-électroporation:
    1. Tirez sur les tubes capillaires de verre en fines aiguilles à l'aide d'un extracteur micro-pipette avec les paramètres optimisés suivants pour un 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Chauffage Filament: Pression = 500, Chaleur = 600 ° C, Pull = 64, vitesse = 105, et le temps = 150 msec (voir le tableau 1).
    2. Mettre en place la gauche et les étapes micro-manipulateur droitier flanquant le microscope (voir la figure 1A). Le micro-manipulateur Adroit tient l'aiguille capillaire en verre et le micro-manipulateur Gauche maintient les électrodes (figure 1A).
    3. Préparer l'aiguille capillaire en verre finement tiré pour la micro-injection par découpagela pointe de l'aiguille avec une pince tout en travaillant sous le microscope.
    4. Remplissez l'aiguille manuellement par la main en utilisant le micro-manipulateur avec 2,5 ul d'ADN plasmidique teintées avec 0,1% Fast Green tout en travaillant sous le microscope.
    5. Placez l'oeuf couché sur le côté dans un dispositif de retenue moule / oeuf (voir la figure 1A). Couper une fenêtre ronde au - dessus de l'œuf à l' aide de ciseaux 19 (figure 1A).
    6. Tout en travaillant sous le microscope, ouvrir avec précaution les deux membranes recouvrant l'embryon en utilisant une pince.
    7. Tout en travaillant sous le microscope, livrer environ ~ 0,5 ul d'ADN plasmidique à la bonne lumière des vésicules otiques par micro-injection manuellement à l'aide de la main droite en utilisant le micro-manipulateur et par micro-électroporation.
      1. Pour ce faire, micro-injecter les bonnes lumière des vésicules otiques avec l'ADN avec le bouton droit de la main micro-manipulateur (figure 1B-D) , tandis que dans le même temps en utilisant le holdin de la main gauchega forcep pour stabiliser la tête de l'embryon, parce que la tête de l'embryon plonge à l'étape E4. Ne pas micro-injection passé la lumière des vésicules otiques, parce que cela va endommager la vésicule otique.
      2. Immédiatement après la micro-injection, tout en travaillant sous le microscope, utilisez le micro-manipulateur à gauche pour placer le positif (anode) 2 mm électrode de platine antéro-ventrale à la vésicule otique droite et l'électrode négative de 2 mm (cathode) en parallèle 1 mm d' intervalle (voir la figure 1 C). Livrer 4 impulsions à 12 V avec 100 msec et 200 msec espacement. La vésicule otique gauche sert un témoin non traité interne.
        REMARQUE: Nettoyez les électrodes entre électroporations avec un tampon de coton-tige trempé dans du PBS 1x.
  2. En Ovo la prolifération des cellules de dosage:
    1. Immédiatement après l'électroporation ajouter 50 pl de 0,25 mg / ml dans PBS 1x EdU en abaissant manuellement la solution EdU 50 ul sur touteembryon in ovo à l' aide d' une pipette. Sceller les oeufs avec du ruban adhésif et de revenir à l'incubateur pour les 18 - 96 h.
    2. Retirez délicatement la bande et vérifier les embryons pour la GFP fluorescente ou signal de DP au sein de la vésicule otique après 18-24 h en utilisant un microscope à fluorescence standard (voir Figure 1 EE '). Si le signal fluorescent est présent, à ce stade , la récolte des embryons pour des analyses ou reboucher avec du ruban adhésif et le retourner à l'incubateur pour la récolte et des analyses à des stades ultérieurs (voir la figure 1 FP '').
      NOTE: L' expression du signal de GFP avec la construction PMEs-IRES-GFP est évident 6-7 heures après électroporation 10.

Récolte 3. Embryo et traitement des tissus pour l' ARN hybridation in situ et immunohistochimie

  1. Récolter les embryons en utilisant une pince. Rincer l'embryon dans 1x PBS froid. Retirez les têtes des embryons, en coupant la tête par son colen utilisant une pince, et placer les têtes dans 4% de paraformaldehyde O / N à 4 ° C. Piquer le cerveau en utilisant une pince pour permettre la pénétration du paraformaldéhyde 4% dans la tête.
  2. Déshydrater les têtes de saccharose à 30% (en 1x PBS) O / N à 4 ° C.
  3. Monter les têtes dans un milieu cryoprotecteur par congélation rapide dans une bouillie de glace sèche et méthylbutane (2-Methylbutane). Alternativement, rapide geler les têtes dans un milieu cryoprotecteur avec de l'azote liquide. Stocker les têtes montées à -80 ° C.
  4. Cryosection les têtes en 12 um coupes de tissus épais et de collecter toutes les coupes de tissus contenant l'oreille-interne sur des lames de verre de microscope superfrosted.
  5. Effectuer un ARN étalon hybridation in situ et immunohistochimie comme décrit précédemment 4,21 et analyser EdU pour la prolifération des cellules selon le protocole fourni par le fabricant du kit.
    REMARQUE: les cellules de cheveux peuvent être identifiés à l'aide de lapin polyclonaux α-MyosinVIIa (MYO7A) untibody (1: 1000, Proteus Biosciences) et un anticorps secondaire marqué par fluorescence (1: 250, chèvre anti-lapin AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Captage et traitement des images

  1. Prenez des photos avec des équipements d'imagerie numérique. Résultats image immunohistochimie avec un microscope et les résultats de l'in situ à l' aide d' un microscope grand champ standard (allant de 5x à 40x de grossissement) fluorescent standard.
  2. Traiter les images en utilisant un logiciel de traitement d'image.

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Résultats

Dans cet ADN méthode papier plasmidique constitué de la protéine fluorescente verte (GFP) des cassettes d'expression ont été ciblés dans le poulet en développement papille basilaire (BP) avec des paramètres optimisés de 12 V et 4 impulsions avec 100 durée d'impulsion msec et des intervalles de 200 ms, ce qui donne un ~ 50% le taux et l'efficacité du plasmide ADN-ciblage dans le BP survie des embryons. L' imagerie de fluorescence l' expression de GFP natif dans le déve...

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Discussion

Le procédé décrit ici de micro-électroporation in ovo est optimisé pour le transfert de gène dans l'organe auditif développement. Il est compatible avec les plasmides vecteurs d'expression à base d'ADN utilisés habituellement pour manipuler la fonction du gène / expression. Le moment de l'électroporation à E4 est optimal pour les enquêtes qui mettent l'accent sur le développement de HC dans l'organe auditif. Les étapes les plus critiques sont micro-injecter l'ADN dans la lumière de l...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Doris K. Wu pour les plasmides d'expression et de sondes in situ, le Centre de l' Université Johns Hopkins pour Sensory installation d'imagerie de la biologie et le Centre d'audience et de l' équilibre. Ce travail a été soutenu par NIDCD Grant T32 DC000023 à LE

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Stérile 1x PBS pH 7.4gibco10010-023
Fast Green FCF PoudreSigmaF7252-5G
EdU PoudreInvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Kit d’imagerieInvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  ;BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Kit de câbleBTX Harvard Apparatus45-0216
Droitier & Micromanipulateurs pour gauchersWorld Precision Instruments Inc.M3301R et M3301L
Deux étages de dispositif de maintien magnétique de 12 mm avec poteaux verticaux de 7 poucesWorld Precision Instruments Inc.métallique M10
12 x 24 poucesWorld Precision Instruments Inc.5479
Ciseaux pour oeufs 12 cm de long courbés, lames extrafines 12 mm ; Ciseaux à ressortWorld Precision Instruments Inc.  ;14120
Micropippette Extracteur pour aiguilles de tractionSutter Instrument Co.P-97
2.5x2.5 mm Boîte Platine Filament ChauffantSutter Instrument Co.
Tubes capillaires en verre/Aiguilles/Sans fibre/Borosil 1 mmFHC27-30-0
Seringue en verre Hamilton 100 &mu ; lHamilton80601 Modèle 710LT
Huile minérale (lourde) pour seringue en verre HamiltonFisher ScientificO122-1
Tube en polyéthylène pour connecter la seringue en verre et les aiguilles capillaires en verre / Non toxiqueBecton Dickinson and Company (BD)427420 Seringues jetables Intramedic Clay Adams Brand
3 ccBecton Dickinson and Company (BD)309657
Aiguilles jetables de calibre 21Becton Dickinson and Company (BD)305122
Une paire d’électrodes en platine de 2 mmBulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
Porte-électrodesBulldog Bio. / NepageneCUY580
Une paire de pinces fines Dumont numéro 5Fine Science Tools (FST)
Ruban invisible au fini mat pour sceller les œufsOffice Depot520-928
Fisher Scientific23-400-101Embouts filtrants stériles
Plaque de base en acier Coton-tige

Références

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050(2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871(2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).

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