Receptor Protocole autoradiographie pour la visualisation Localisée de l'angiotensine II Receptors

Summary

Nous présentons ici un protocole pour décrire la localisation des récepteurs de l’angiotensine II de type 1 dans le cerveau du rat par autoradiographie quantitative, densitométrique et in vitro des récepteurs à l’aide d’un analogue de l’angiotensine II marqué à l’iode-125.

Abstract

Ce protocole décrit les profils de liaison aux récepteurs de l'angiotensine II (Ang II) dans le cerveau de rat en utilisant un radioligand spécifique pour les récepteurs de l'angiotensine II pour effectuer la cartographie des récepteurs autoradiographique.

Les échantillons de tissus sont prélevés et conservés à -80 ° C. Un cryostat est utilisé pour la section coronale du tissu (cerveau) et dégel monter les sections sur des lames chargées. Les coupes de tissus montées coulissantes sont incubées dans ¹²⁵ I-IS-Ang II de l' Ang II radiomarquer des récepteurs. Coulisseaux adjacents sont séparés en deux ensembles: "liaison non spécifique" (PSN) en présence d'un récepteur de concentration saturante de non-radiomarquée Ang II, ou un type AT ₁ du récepteur angiotensine II (AT ₁ R) , antagoniste sélectif des récepteurs de l' angiotensine II , et «liaison totale» sans AT ₁ R antagoniste. Une concentration saturante d'AT ₂ sous - type de récepteur angiotensine II (AT ₂ R) antagoniste (de PD123319 10 uM) est également présent dans le incubatisur le tampon pour limiter ¹²⁵ I-SI-Ang liaison à l'AT ₁ R sous - type II. Pendant 30 minutes de pré-incubation à ~ 22 ° C, les lames NSP sont exposées à 10 uM PD123319 et losartan, tandis que «liaison totale» lames sont exposées à 10 uM PD123319. Les lames sont ensuite incubés avec ¹²⁵ I-SI-Ang II en présence du PD123319 pour ' la liaison totale », et PD123319 et losartan pour NSP dans le tampon d'essai, suivi de plusieurs« lavages »dans un tampon, et de l' eau pour éliminer le sel et non spécifiquement lié radioligand. Les lames sont séchées à l'aide d'un sèche-soufflage, puis exposés à un film d'autoradiographie en utilisant un film spécialisé et d'une cassette. Le film est développé et les images sont numérisées dans un ordinateur pour la densitométrie visuelle et quantitative en utilisant un système d'imagerie propriétaire et une feuille de calcul. Un ensemble supplémentaire de diapositives sont thionine-colorées pour les comparaisons histologiques.

L'avantage d'utiliser une autoradiographie du récepteur est la capacité à visualiserAng II récepteurs in situ, au sein d' une section d'un échantillon de tissu et anatomiquement identifier la région du tissu en le comparant à une coupe histologique adjacente de référence.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires continue d'être la principale cause de décès et d' invalidité aux Etats-Unis, causant plus de 30% des décès aux États - Unis en 2011 ^1. Les statistiques les plus récentes de l'American Heart Association indique que plus d'une personne sur trois a un ou plusieurs types de maladies cardiovasculaires. la recherche cardiovasculaire continue à faire des progrès contre la compréhension de cette maladie, mais que les générations commencent vieillit, il est impératif de poursuivre ces efforts. Le système rénine-angiotensine (SRA) joue un rôle central dans la régulation du système cardio - vasculaire principalement par la promotion de l' athérosclérose, l' inflammation, la vasoconstriction systémique et l' activation du système nerveux sympathique (Figure 1) ^2-8.

RAS est un système hormonal qui est activé lorsque les cellules juxtaglomérulaires du rein sécrètent la rénine dans le sang en réponse à la diminution de la pression sanguine, une augmentation sympatla stimulation hetic ou diminution du flux de sodium par la macula densa. Métabolise rénine angiotensinogène (synthétisé dans le foie) pour former de l'angiotensine I (Ang I). Ang I est ensuite métabolisé par l'enzyme de conversion (ACE), un ectoenzyme sur le côté luminale des cellules endothéliales vasculaires, principalement dans les poumons et les reins, pour former l'angiotensine II (Ang II), le principal peptide effecteur du RAS. Ang II est capable d'activer deux sous-types de récepteurs; le récepteur de type 1 (AT ₁ R) et le récepteur de type 2 (AT ₂ R), les deux qui régulent le système cardio - vasculaire, maintenir l' homéostasie hydrique et électrolytique et sont maintenant considérés pour affecter la fonction cognitive et la maladie neurodégénérative traite ^8,9. A, RAS spécifique du cerveau local est rapporté pour synthétiser indépendamment Ang II. Dans le cerveau, l'angiotensinogène protéine précurseur est synthétisée dans les astrocytes ¹⁰ converti en angiotensine I par la rénine d' une enzyme analogue ^3, éventuellement prorénine lié au récepteur de la prorénine^11, et par la suite convertie en angiotensine II par l' enzyme de conversion de l' angiotensine , qui est abondamment exprimé sur la surface extracellulaire de neurones dans le cerveau ^12. Ce intrabrain généré Ang II est l'agoniste pour le cerveau AT ₁ et AT ₂ récepteurs qui sont isolés à partir du sang transmis par Ang II.

Alors que l'AT ₁ R joue un rôle physiologique important, il est mieux connu pour ses effets physiopathologiques dans tout le corps, affectant principalement le système cardio - vasculaire et les reins (figure 2). Lorsque Ang II se lie à l'AT ₁ R, il provoque une vasoconstriction; augmentation de la résistance à la circulation sanguine et d'élever la pression artérielle. Elle favorise également la synthèse et la sécrétion d'aldostérone et la vasopressine, conduisant à une augmentation de sodium et la rétention d'eau. Ces effets peuvent également induire des lésions cérébrales ischémiques et les troubles cognitifs et est liée à la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, et Diabetes, ainsi que d' être récemment identifié à affecter l' apprentissage et de la mémoire ^13-15. Il y a une boucle de rétroaction dans le RAS en ce que R ₁ sur les cellules juxtaglomérulaires du rein inhibe la sécrétion de rénine. Fait intéressant, AT ₂ R généralement contre-régule l'action d'AT ₁ R, ce qui provoque la vasodilatation, la croissance des neurites, la régénération axonale, anti-prolifération et cerebroprotection parmi beaucoup d' autres ^16-20. AT R ₂ a également été identifié comme une cible pour l' anti-hypertension et , plus récemment, des médicaments anticancéreux ^21. Détermination de la localisation et la densité des récepteurs Ang II dans les différents tissus et comment ils sont touchés par divers traitements et états pathologiques en utilisant quantitative autoradiographie des récepteurs densitométrique va aider à découvrir le rôle du RAS joue dans des maladies spécifiques.

Récepteur autoradiographie a été utilisé pendant plus de 30 ans comme une méthode efficace pour indiquer la présence de l'angiotensine II récepteurs et d' autres composants de la RAS dans le cerveau et d' autres tissus du rat, souris, cochon de Guinée, le chien et l' homme sous une variété de conditions expérimentales ^22-34. L'importance de la localisation des récepteurs Ang II dans le cerveau est que l' on peut appliquer neuroanatomie fonctionnelle aux actions de Ang II dans le cerveau, par exemple, la présence d'AT ₁ R dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) suggère une fonction d'Ang II dans le cerveau pour stimuler la vasopressine, l'ocytocine ou de l'hormone de libération de la corticotropine (CRH) de presse, ou l'activation du système nerveux sympathique. Ainsi, les médicaments qui bloquent l'AT ₁ R pourraient diminuer certains de ces effets PVN médiées associés avec plus de l' activité des RAS du cerveau. Les travaux en cours suggèrent que l'utilisation d'AT ₁ R antagonistes peut diminuer Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD) la libération induite par la CRH et améliorer les symptômes de stress post - traumatique (Hurt et al., Soumis pour publication). Le PVN, subfornicalorgane (SFO), et l'amygdale sont connus pour réguler l'homéostasie, l'appétit / soif, le sommeil, la mémoire, les réactions émotionnelles, et sont les zones cibles de cette étude de démonstration. Ces régions ont été examinées par la collecte des coupes coronales d'un cerveau sur des lames de microscope, et le traitement des sections avec des inhibiteurs spécifiques avec un radioligand spécifique des récepteurs Ang II. Dans cette étude, tous les matériaux et les réactifs ainsi que les fournisseurs suggérés sont répertoriés, l' iode-125 a été utilisé pour radiomarquer un antagoniste de l' angiotensine II du récepteur, la sarcosine ^1, l' isoleucine ⁸ Ang II (SI Ang II), qui a été ensuite purifié comme mono ^125I -SI Ang II en utilisant des méthodes HPLC comme décrit précédemment ^35. L'utilisation de cette activité radioligand spécifique élevée permet la visualisation des zones de faible densité, modérée et élevée du récepteur après exposition des sections radiomarqués à un film x-ray. En calibrant le film avec les normes de pâte du cerveau contenant des quantités connues d'iode-125, le montant spécifiquedu récepteur Ang II de liaison dans une zone peut être quantifiée. Dans des études expérimentales, le récepteur de liaison de l'angiotensine II dans le cerveau des sujets expérimentaux peut être comparée à celle dans les cerveaux de sujets témoins. Cela peut indiquer si les actions de Ang II sont modifiées en réponse à une maladie génétique, anomalie phénotypique, l'état de la maladie ou un traitement médicamenteux. Cette connaissance peut alors être appliquée sur le développement de thérapies pour traiter des maladies associées à une dérégulation de la RAS. Des techniques alternatives qui permettent d' identifier les sites de liaison au récepteur, mais avec une résolution anatomique réduite, sont des dosages qui utilisent des préparations de membranes de tissu provenant d'homogénats de tissus, qui sont mises en incubation avec le radioligand sur une plage de concentrations afin d' évaluer l' affinité de liaison de radioligand comme la constante de dissociation (K _D lient ) et une capacité de liaison maximale (B _max) du tissu d'intérêt.

Le protocole décrit ici peut être décomposé en 5 co majeuremponents: Préparation de coupes de tissus pour des récepteurs autoradiographie; Receptor autoradiographie; Exposition du film et le développement; Histologie; et densitométrique Analyse d'image.

Protocol

Toutes les procédures animales réalisées pour cette étude ont été approuvés par le soin et l' utilisation Commission institutionnelle animale de l' Université Nova Southeastern en accord avec le Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire, 8 ^e édition (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).

1. Sections de tissus Préparation des récepteurs autoradiographie

1. Après le sacrifice, les tissus du cerveau frais de récolte, et envelopper dans du papier d'aluminium et placer dans un congélateur à -20 ° C le plus rapidement possible. Pour maintenir la forme correcte, placer le cerveau dans un moule du cerveau qui simule l'intérieur du crâne, envelopper dans du papier d'aluminium et placer dans un - 20 ° C congélateur. Au bout de 30 min, placer les tissus dans un sac de stockage de congélation et passer à un C congélateur -80 ° pour le stockage à long terme.
   1. Obtenir l'échantillon de tissus congelés frais d'intérêt de la décongélation -80 ° C congélateur, et le transfert à un cryostat fixé à un minimum de -10 ° C et un maximum de -18 ° C, pour éviter.
   2. Placer l'échantillon sur le tissu de montage avec un glycol et milieu d'enrobage à base de résine, que l'incorporation d'une petite partie de l'échantillon dans le milieu. Pour le cerveau, le cerveau est monté verticalement pour permettre sectionner dans le plan coronal.
2. Placez le tissu de montage sur le microtome dans le cryostat et serrer fermement en place. Veiller à la gauche et le côté droit du cerveau sont les mêmes coordonnées antéro-postéro, et que l'axe dorso-ventral est atlas du cerveau perpendiculaire couramment utilisés.
3. Commencer la coupe à l'épaisseur désirée (20 um recommandé) et de dégel monter les sections sur des lames de microscope dans une direction verticale par rapport à une surface supérieure de l'espace dans la glissière. Collecter des sections sur des lames dans des ensembles séquentiels de cinq, à savoir la première série de diapositives sont étiquetés 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 et 1-5 (Figure 3).
4. Après avoir rempli une série de diapositives avec des sections, permettent des diapositives à l'air sec pour un maximum de 1 heure, puis placez le slides dans une boîte en plastique à glissière dans un sac de rangement congélateur auto-obturant, et conserver à -20 ° C.

2. Receptor autoradiographie

ATTENTION: Radioactivité. Utiliser des vêtements de protection pour manipuler la radioactivité. L'élimination est dépendait de l'établissement, et doit suivre les directives à la pourriture correctement (demi-vie de 60 jours) ou d'être repris par une entreprise certifiée.

1. Retirez les "-1" et "-2" diapositives d'intérêt de la -20 ° C congélateur et monter dans les poignées de glissement (Figure 5). Monter les "-1" diapositives ensemble pour le traitement «non spécifique», et les «-2» diapositives pour le traitement «total». Bocaux «non spécifiques» contiendront 10 uM des concentrations finales de PD123319 un AT ₂ R antagoniste, et losartan un AT ₁ R antagoniste, dans un tampon de milieu d'essai (AM5) (tableau 1), le «total» des pots de liaison ne contiendront 10 uM PD123319 dans AM5.
2. Inversez la diapositiveles poignées pour placer les lames dans les pots de Coplin de pré-incubation remplis de 35 à 40 ml d'AM5 et les inhibiteurs respectifs pendant 30 min à température ambiante. Démarrer les ensembles suivants dans leur bain de pré-incubation à des intervalles de 4 min.
3. Transférer immédiatement les lames de la solution d'incubation préalable des expéditeurs de courrier d' incubation de diapositives, contenant 10 ml d'AM5, en plus d' une concentration prédéterminée de ¹²⁵ I-IS-Ang II (calculé sur la figure 4) avec les inhibiteurs respectifs, pendant 60 à 90 min à la chambre température. S'il y a radioligand suffisante, 10 diapositives peuvent être placés (dos à dos) dans les poignées de glissement modifiées et incubées avec ¹²⁵ I-SI-Ang II dans des bocaux Coplin.
4. La place glisse de nouveau dans les poignées de glissement (si nécessaire), blot, et rincer en remuant doucement pendant 1-2 sec dans 400 ml d'eau distillée dans deux récipients séparés.
5. Transférer les lames séquentiellement en quatre jarres de Coplin contenant 35-40 ml de AM5 pendant exactement 1 min chacun (comme illustré sur la figure 4 </ Strong>).
6. Après le dernier rinçage 1 min, agiter doucement les sections pendant 1-2 secondes dans quatre changements d'eau distillée glacée.
7. Séchez les lames avec de l' air frais (Attention: l' air chaud volatilise le composé radioactif) en utilisant quatre sèche-cheveux mis en place sous des angles différents pour 4 min (Figure 5), jusqu'à ce que toutes les sections sont secs, puis placer sur une serviette en papier.
8. Mont glisse avec des tissus vers le haut sur un carton pour l'apposition d'un film radiographique en utilisant du ruban adhésif double face.
9. Mont au moins un, ¹²⁵ calibration Iode lame standard sur chaque carton (Figure 6).
   Nota: Les étalons sont constituées de pâte de cerveau mélangé intimement avec ¹²⁵ d' iode lié à un composé contenant un noyau phénolique, tassé par centrifugation dans une seringue de 1 ml de tuberculine, qui sont cryostat sectionnées à la même épaisseur que les sections de cerveau et de dégel monté sur un microscope diapositives. Alternativement, ¹²⁵ étalons I dansrésine de plastique en coupe à 20 um d'épaisseur peut être obtenue dans le commerce. La résine plastique dans ces normes protège partiellement la pellicule à partir du rayonnement de telle sorte qu'une équivalence tissulaire de ~ 40% doit être pris en compte dans la calibration.

3. Film d'exposition et de développement

1. Passez à une chambre noire avec une sangle-back cassette radiographique et le film d'autoradiographie. Ouvrez la cassette et placez le carton avec coulisse à l' intérieur (figure 6).
   1. Éteignez les lumières et allumez le inactinique. Ouvrez soigneusement la boîte de films X-Ray, retirer un film, et placez le côté brillant du film (avec la bord dentelé sur le coin en bas à droite) sur le dessus des diapositives de la cassette. Refermez soigneusement la cassette, et tordre les barres de verrouillage pour sceller la lumière (figure 6). Exposer les diapositives de plusieurs jours à plusieurs semaines à -20 ° C.
2. Dans la chambre noire, ouvrir la cassette et procéder au développement de films process.
   1. Placer les lames dans les bacs consécutifs; développeur pendant 2 min, de l'eau contenant 5% d'acide acétique glacial pendant 30 s et fixer pendant 5 min. Les films sont les placés dans un bac avec de l'eau courante pendant 20 min, puis placés dans Photoflo pas plus de 10 secondes et accroché.
      Remarque: Le temps d'exposition est déterminée empiriquement et peut impliquer plusieurs films avec différents temps d'exposition: assez longtemps pour obtenir des signaux mesurables à partir des zones à faible liaison, mais pas aussi longtemps que pour saturer le film par des zones à forte liaison. Une fois l'exposition acceptables sont obtenus, puis passez à l'étape suivante.

4. histologie

1. Préparer la tache de la thionine et de réactifs de coloration (Tableau 2, figure 7).
   1. Placer les lames "-3" dans la grille coulissante, et le transfert dans un ordre séquentiel en commençant avec de l'eau déminéralisée pendant 1 min, puis la thionine solution de colorant pendant 10 minutes suivie de trois trempettes dans Deionles eaux lisés, et un lavage de 30 secondes dans de l'eau déminéralisée.
   2. Après l'eau, placez la grille coulissante dans des lavages à l'éthanol comme suit; 50%, 70% et 90% pendant 30 secondes, suivi de deux lavages à l'éthanol à 100% pendant 1 min à chaque fois. Enfin, placer la grille coulissante dans le xylène pendant 3 min, puis les transférer vers une deuxième solution de xylène pendant 5 min.
2. Retirer une diapositive à la fois dans le dernier bain de xylène, et couvrir le bord supérieur de la lame avec une base de résine dans un solvant organique milieu de montage, et placer un 24 mm x 60 mm lamelle sur la lame. Laisser les lames suffisamment sec pour ~ 48 h et ensuite numériser dans l'ordinateur à 2400 dpi en niveaux de gris.

5. densitométrique Analyse d'image

1. Placez le côté brillant du film vers le bas, avec le bord dentelé sur le coin inférieur gauche et numériser à l'aide d'un scanner exclusif capable de transmettre les informations de densité de film sans aucune distorsion dans l'ordinateur du système d'imagerie.
2. Ouvrez le fichier sys d'imagerie propriétairessystème et d' utiliser les barres d'étalonnage pour établir des normes d'étalonnage pour la future analyse densitométrique des images sur le film (figures 9 - 12).
3. zones de mesure de l'intérêt soit par l'établissement d'un modèle ou décrivant de manière empirique les domaines d'intérêt. Les données sont collectées et la séparation basée sur le film, soit le contrôle ou de type sauvage (section), et de la région. Assurez - vous d'inclure la densité (fmol / g), la zone d' analyse, et de la zone cible totale dans les mesures (Figure 9).
   1. Ajuster les barres de la zone de balayage en assurant que la région d'intérêt se situe entre les paramètres de mettre en évidence (figure 10).
   2. Exporter des données dans une feuille de calcul (tableau 4). Multiplier les temps de densité de la zone cible totale, puis diviser par la zone de numérisation afin d'obtenir la valeur de la liaison de cette zone spécifique. Une fois que cela est fait pour toutes les valeurs mesurées, le substrat non spécifique établie à partir totale pour obtenir le p de liaison spécifiqueressentiment. Les moyennes peuvent également être réalisées pour ces valeurs.

Results

La vue d' ensemble de la voie métabolique du système rénine-angiotensine est représenté sur la figure 1 et la mise au point directe sur les sous - types de récepteurs de l' angiotensine II (AT ₁ R et AT ₂ R) est décrite dans la figure 2. La figure 3 montre le transfert de cerveau coronale sections sur des lames de microscope, qui sont ensuite à travers une procédure de autoradiographie de récepteur en utilisant une ...

Discussion

Le protocole décrit identifie la visualisation de «total» et «non spécifique» de liaison du radioligand dans des sections adjacentes de coupes coronales d'un cerveau de rongeur précédemment récolté et stocké à -80 ° C, et peut être facilement applicable à pratiquement tous les tissus qui a anatomiquement résolu substructures qui affichent des montants différentiels des récepteurs ou des sites de liaison de radioligands. Les procédures décrites dans le protocole sont simples et l'analyse est essentielle pour inte...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 ml Béchers en plastique	Fisher	02-591-30
24 mm x 60 mm Lamelles	Fisher	22-050-25
Film d’imagerie d’autoradiographie 24 mm x 30 cm	Carestream-Biomax MR Film	891-2560
Bacitracine (de Bacillus licheniformis)	Sigma	B-0125
Feuille de carton 8 x 11	Crescent Illustration Board #201	201
Coplin Jars	Fisher Scientific	E94
Sèche-cheveux professionnels	Conair	Modèle SD6X
Tubes de culture jetables	Fisher	14-961-26
EDTA (Sel disodique, dihydraté)	USB Corporation	15-699
Éthanol	Fisher	16-100-210  ;
Substitut du Formulary pour le D-19 Developer	Photographers Formulary, Inc.  ;	01-0036
Acide acétique glacial	Fisher	A38 SI-212
Histoprep/OCT	Fisher	SH75-125D
Fixateur de film	Kodak	5160320
Photo flo	Kodak	1464502
Losartan	Fisher/Tocris	37-985-0
MCID&trade ; Core 7.0	MCID	N/A
NaCl	Fisher	S271
Peel-A-Way Poignées coulissantes	VWR	48440-003
Permount	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
Lames chargées de qualité supérieure, lames	microscope Premiere	9308W
125I Ligands	Perkin Elmer	NEX- 248
125SI-Ang II  ;	Université George Washington	Radioiodé par le Dr Speth
Slide Mailers	Fisher Scientific	HS15986
Phosphate dibasique de sodium anhydre (Na2PO4)	Fisher	RDCS0750500
Acétate de sodium (anhydre)	Fisher	BP333-500
Thionine  ;	Fisher	T409-25
Casette à rayons X (10 x 12)	Spectronics Corporation	Quatre
carrés Xylène	Fisher  ;	X3P-1GAL