Article de méthode

Un bioessai simple pour l'évaluation des facteurs de croissance endothélial vasculaire

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DOI :

10.3791/53867

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15 mars 2016

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1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un test biologique simple, basée sur des cellules pour la détection, la quantification et le suivi de l'activité des membres de la famille du facteur de croissance endothélial vasculaire des ligands. L'essai utilise des récepteurs chimères exprimés dans une lignée cellulaire dépendant du facteur de fournir une évaluation semi-quantitative ou quantitative de la liaison au récepteur et la réticulation par le ligand.

Résumé

L'analyse des tyrosine kinases des récepteurs et leurs ligands impliqués dans l'interaction de la biologie vasculaire est souvent difficile en raison de l'expression constitutive de la famille des récepteurs apparentés, une large gamme de ligands associés et de la difficulté de traiter des cultures primaires de cellules endotheliales spécialisées. Nous décrivons ici un essai biologique pour la détection de ligands du facteur de croissance vasculaire endothélial récepteur-2 (VEGFR-2), un transducteur de signaux clés qui favorisent l'angiogenèse et la lymphangiogenèse. Un ADNc codant pour une fusion de la région extracellulaire (liaison de ligand) de VEGFR-2 avec les régions transmembranaires et cytoplasmiques du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR) est exprimée dans la lignée cellulaire dépendante du facteur de Ba / F3. Cette lignée cellulaire se développe en présence d'interleukine-3 (IL-3) et le retrait de ce facteur entraîne la mort des cellules dans les 24 heures. L'expression de la / EpoR fusion du récepteur VEGFR-2 fournit un autre mécanisme pour favoriser la survie et potentially prolifération de cellules Ba / F3 transfectées de façon stable en présence d'un ligand capable de se lier et de réticulation de la partie extracellulaire de la protéine de fusion ( par exemple, celui qui peut réticuler la région extracellulaire du VEGFR-2). Le test peut être réalisé de deux façons: une approche semi-quantitative dans laquelle de petits volumes de ligand et les cellules permettent un résultat rapide en 24 heures, et une approche quantitative impliquant des marqueurs de substitution d'un certain nombre de cellules viables. L'essai est relativement facile à réaliser, est très sensible à VEGFR-2 connus et peuvent accueillir des ligands inhibiteurs extracellulaires de VEGFR-2 de signalisation tels que des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur ou des ligands et des pièges de ligands solubles.

Introduction

La famille de facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF), les facteurs de croissance des protéines sécrétées et leurs congénères des récepteurs de surface cellulaire est un groupe important et diversifié de ligands solubles et des récepteurs de la membrane-embedded, respectivement cette fonction dans la transduction des signaux à travers les membranes cellulaires. Ils fonctionnent principalement dans les cellules endothéliales , mais également dans des cellules d'origine épithéliale et ceux du 1,2- du système immunitaire. Les voies de signalisation engagées par les récepteurs activés par des ligands VEGF (VEGFR) sont essentiels dans des pathologies majeures telles que la dégénérescence et le cancer maculaire liée à l'âge, et les thérapeutiques qui leur sont destinés sont en utilisation clinique fréquente (par exemple, le bevacizumab anticorps monoclonal qui cible VEGF-A) 3,4.

L'une des complexités de la famille de VEGF est la diversité des ligands solubles présents dans la nature (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, les protéines de VEGF codées par le orf de famille des virus parapox et venin de serpent VEGF, ainsi que d'autres inhibiteurisoformes du VEGF-A) 2.

Ces ligands interagissent avec les trois membres de la famille tyrosine kinase du récepteur, à savoir VEGFR-1, VEGFR-2 et VEGFR-3. Ces récepteurs sont variablement exprimés sur différents types de cellules , mais sont souvent co-exprimés sur la surface des cellules endothéliales qui tapissent les vaisseaux sanguins et lymphatiques de toutes tailles 5. VEGFR-2 peut se lier à des ligands de mammifère VEGF-A 6, le VEGF-C et VEGF-7 8,9 D ainsi que le virus orf VEGF 10 et 11 de venin de serpent VEGF. VEGFR-2 joue un rôle majeur dans l'angiogenèse (la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants) dans le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, le cancer et les maladies oculaires conduite. Dans ces contextes, les ligands tels que le VEGF-A, -C et -D se lient et activent le récepteur sur les cellules endothéliales vasculaires sanguines 12-15. Sur les cellules endothéliales lymphatiques, VEGFR-2 joue un rôle dans la lymphangiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques 16. VEGFR2 peut également favoriser la dilatation et de l' expansion des grandes artères et des vaisseaux lymphatiques dans les tissus et les maladies 17 sains. Une compréhension complète de VEGFR-2: interactions ligand est donc important pour le développement d'inhibiteurs pour une utilisation dans le traitement de maladies dépendantes de l' angiogenèse 18. Alors que la plupart des isoformes du VEGF-A se lient à VEGFR-2, le clivage protéolytique de VEGF-C et VEGF-D est nécessaire pour libérer un fragment constitué par le domaine VEGF-homologie qui présente la liaison à VEGFR-2 19,20 haute affinité.

Nous avons mis au point un test biologique pour surveiller les ligands de VEGFR-2 qui est conçu pour contourner la nécessité pour les cellules endothéliales primaires, qui sont techniquement difficiles à passage, coûteux à l' achat et de la culture (nécessitant moyen spécialisé) 21 et d' exprimer plusieurs VEGFR et co - associé 22 récepteurs. Hétérodimérisation de VEGFR-2 avec d'autres récepteurs du VEGF ou co-récepteurs peut provoquer la complexité indésirable lorsque l'on cherche à goujoninteractions y binaires récepteur-ligand, en évaluant l' activité attribuable à un récepteur spécifique, ou évaluant l'effet des réactifs inhibiteurs. 23. L'essai biologique conserve la mobilité du récepteur concerné dans la membrane cellulaire et permet d'évaluer la capacité d'un ligand à se lier et à réticuler la région extracellulaire de VEGFR-2.

L'essai biologique repose sur la création d'un récepteur chimère dans lequel la région extracellulaire d'un récepteur de VEGF (dans ce cas, VEGFR-2) est fusionnée à l'extrémité régions transmembranaires et intracellulaires du récepteur de l'érythropoïétine (EpoR), un membre de la famille des récepteurs de cytokines 8,24. Cette protéine de fusion est ensuite exprimée dans la lignée cellulaire pro-B dépendant du facteur Ba / F3, sur lequel la stimulation avec un ligand capable de se lier et de réticulation du domaine extracellulaire du récepteur entraîne l'activation de la région effectrice cytoplasmique, qui est capable de transduire un signal de survie via Janus kinases (JAK) pour promouvoir la cellulela survie et / ou la prolifération. En revanche, l'expression de pleine longueur de VEGFR-2 dans le même type de cellules et la stimulation avec le ligand, ne favorise pas la survie et la prolifération cellulaire, ce qui indique que les effecteurs de signalisation proximale de la voie de VEGFR-2 ne sont pas disponibles dans ce type de cellule.

Nous avons utilisé le test dans une variété de contextes pour explorer la liaison de nouveaux VEGFR-2 ligands 10,19,20,24-29. En combinaison avec un essai / F3 VEGFR-3-EpoR-Ba, nous avons comparé les activités relatives du VEGF-C et les facteurs de croissance VEGF-D pour la liaison et la réticulation de VEGFR-2 et VEGFR-3 30. L'essai a été utilisé pour caractériser l'activité d' inhibition de la neutralisation des anticorps monoclonaux contre le VEGFR-2 ou VEGF-D, soluble dans VEGFR-2 et le piège peptidomimétiques ciblant la famille VEGF 31. L'essai a également été utilisé pour montrer la capacité de VEGF à partir de différentes souches de virus orf de lier et de cross-link VEGFR-2 avant le test dans les cellules endothéliales primaires 10,26. L'essai est particulièrement utile pour le criblage rapide de mutants de VEGF qui peuvent être rapidement évaluées pour l' activité avant qu'ils ne soient introduits dans les dosages de cellules endothéliales plus laborieuse lorsque les protocoles 25 ou l' évaluation de la croissance de purification 27 facteurs.

L'essai, nous décrivons est facile à réaliser, et la version semi-quantitative permet des déterminations rapides qui sont parfois nécessaires lors de la surveillance de la production ou la purification des facteurs de croissance, des anticorps ou des domaines de récepteurs solubles pour d'autres expériences. La facilité d'utilisation de l'essai, il est un complément idéal à d'autres études et plus complètes réalisées avec des cellules endothéliales primaires dérivées de vaisseaux sanguins ou lymphatiques à partir de tissus spécifiques ou systèmes d'organes.

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Protocole

Moyenne Source de l'IL-3 et préparation de WEHI-3D-conditionné

Remarque: La lignée cellulaire de la leucémie myéloïde de la souris WEHI-3D ​​est mis en culture pour produire un milieu conditionné contenant l'IL-3.

  1. La culture des cellules WEHI-3D ​​en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 1% de supplément de glutamine de longue durée, 50 pg / ml de gentamicine. Inoculer 5 × 10 6 cellules en phase de croissance logarithmique dans 50 ml de milieu frais de culture dans un T175 cm 3 flacon de culture tissulaire et à croître pendant environ 7 jours ou jusqu'à ce que les cellules aient passé leur phase logarithmique de croissance d'environ 24 - 48 h (éviter la mort cellulaire excessive dans la culture). milieu conditionné est susceptible d'être stocké pendant plusieurs années à -20 ° C, de sorte que des lots de 200 - 500 ml peuvent être produits à un moment donné.
  2. Transvaser du fluide et des cellules provenant des flacons et centrifugation à 1000 x g pendant 15 min pour éliminer les cellules et les débris cellulaires. Enlever la partie supérieure de 90% de Supernatant. Filtrer à travers une unité de filtration de 0,22 pm.
  3. moyen aliquote WEHI-3D ​​conditionné (CM) dans 1 ml, 50 ml et 200 ml volumes de stockage à -20 ° C ou -70 ° C. De plus petites quantités aliquotes sont utiles pour la préparation de l'essai, les volumes intermédiaires pour la préparation du milieu de culture pour le passage des lignées cellulaires dépendantes de facteurs, et des volumes plus importants pour le stockage à long terme. IL-3 est relativement stable à 4 ° C milieu de sorte décongelée peut être stocké pendant quelques semaines si elle est utilisée dans des conditions stériles.
  4. En variante, en utilisant la souris recombinante d'IL-3 à des concentrations de 50 ng / ml dilués dans du milieu de culture, après avoir été filtré à travers une unité de filtration de 0,22 pm.

2. Culture et évaluation de VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 et contrôle Ba / F3 lignées cellulaires

  1. les cellules Ba / F3 de contrôle de la culture dans le DMEM, 10% FBS, 50 ng / ml de gentamicine ou de la pénicilline / streptomycine supplément, 1% stabilisé L-glutamine et 10% WEHI-3D-CM. cellules Passage à 1:15 dilutions environ tous les trois jours à partir de cellulesde plus en plus en phase log.
  2. La culture des cellules VEGFR2 EpoR-Ba / F3 dans du DMEM, 10% de FBS, 50 pg / ml de gentamycine, 1% stabilisé L-glutamine et 10% WEHI-3D-CM et 1 mg / ml de G418. cellules Passage à 1:15 dilutions de cellules en croissance en phase logarithmique. Voir 24 pour plus de détails sur la construction et l' expression du récepteur chimère.
  3. le contrôle de la récolte Ba / F3 ou cellules / F3 VEGFR2-EpoR-Ba à partir de cultures mi phase logarithmique. pipeter doucement pour éliminer les cellules non adhérentes à partir du fond du flacon. Laver trois fois la tonicité de la souris une solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,3 (PBS) (10 ml, centrifuger à 750 x g pendant 5 minutes pour récupérer culot cellulaire) afin d' éliminer du milieu contenant IL-3.
  4. Laver les cellules une fois avec du DMEM et des additifs, sans WEHI-3D-CM ou recombinante d' IL-3, puis remises en suspension dans ce milieu à une concentration de 7,4 x 10 4 cellules / ml (soit 1.000 cellules par 13,5 ul, 10 000 cellules par 135 pi tel que déterminé par comptage en utilisant un hémocytomètre) pourutiliser dans les versions semi-quantitatives ou quantitatives du dosage respectivement.
  5. Évaluer les cellules pour la viabilité de bleu Trypan exclusion (ATTENTION). Mélanger Trypan Bleu dans du PBS (0,4%) 1: 1 avec la population de cellules et compter un minimum de 100 cellules sur un hémocytomètre. Les cellules qui prennent le colorant sont considérés comme morts ou mourants. Viabilité supérieure à 98% est nécessaire pour effectuer le dosage.

3. Dosage semi-quantitatif

  1. Ajouter des cellules lavées (1.000 cellules) contenues dans 13,5 ul de milieu IL-3 déficient dans les puits d'une plaque de microtitration 72 puits à température ambiante. Prendre soin de mélanger la suspension de cellules pendant aliquotage pour assurer sédimentation des cellules par gravité ne concentration cellulaire de polarisation. Utilisez un P20 automatisé pipette bien calibré, et des conseils autoclavés.
  2. Ajouter des échantillons et les groupes témoins aux puits à un volume de 10% (1,5 ul, ce qui rend un volume final de 15 ul contenant 1000 cellules par puits) à l'aide d'une pipette P20 calibrée ou, de préférence, P2 pipette. Prenez care pour garantir que les échantillons soient compatibles avec les conditions de culture des cellules Ba / F3 en termes de pH, de sel et d'autres substances potentiellement cytotoxiques / cytostatiques. Lorsque cela est possible, utiliser un milieu compatible ou un tampon (par exemple, DMEM ou PBS, respectivement) ou dilué dans un tel milieu ou tampon. La trituration avec la même astuce va assurer le mélange.
  3. Pour les échantillons témoins, y compris: (i) le milieu seul, ne contenant pas d'IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM ajouté à un milieu seul à 10% volume final; et / ou (iii) le VEGF-A diluée à 100 ng / ml dans du milieu seul, sans addition d'IL-3.
  4. Remplissez tous les puits non utilisés de la plaque de micropuits avec de l'eau stérile, PBS ou moyenne et placer la plaque dans un conteneur humidifié (avec de l'eau imbibé du papier de soie) permettant les échanges gazeux. Incuber les cellules dans les récipients dans une atmosphère humidifiée de 10% de CO 2. Ce test peut être confortablement installé dans 3 h par une seule personne, si des échantillons d'essai et les composants des médias sont disponibles.
  5. Évaluer les plaques généralement après 16 heures deincubation à laquelle la discrimination de temps entre les échantillons positifs et négatifs est évidente. Voir Figure 3 pour des exemples de la façon dont les cellules apparaissent dans la culture. Analyser les plaques en utilisant un inversé à contraste de phase microscope standard à 40-100 × grossissement.
    Remarque: Les puits contenant des facteurs de croissance favorables telles que l'IL-3 ou du VEGF-A contient des cellules qui apparaissent rondes et translucides. Puits sans facteurs de croissance favorables ou avec le milieu seul aura une diminution du nombre de cellules rondes, ainsi que des cellules mortes ou mourantes et de débris cellulaires (par exemple, la figure 3C). L'évaluation de l'essai à 24-48 heures après l'incubation est l'optimum pour la sensibilité.

4. Quantitative bioessai

  1. Ajouter des cellules lavées (10.000 cellules dans 135 pi) dans IL-3-deficient moyen des puits d'une plaque à 96 puits de microtitration standard à RT. Prenez soin de mélanger la suspension cellulaire pendant aliquotage pour assurer décantation cellulaire par gravité n'a pas d'incidence CEconcentration II.
  2. Ajouter des échantillons et les groupes témoins aux puits à un volume de 10% (15 ul) à l'aide d'une pipette calibrée (P20). Veillez à ce que les échantillons sont compatibles avec les conditions de culture des cellules Ba / F3 en termes de pH, de sel ou d'autres substances potentiellement cytotoxiques / cytostatiques. Lorsque cela est possible, utiliser un milieu compatible ou un tampon (par exemple., DMEM ou PBS) ou dilué dans un tel milieu ou tampon. Stériliser par filtration à l'aide d'un faible volume d'acétate de cellulose unité de filtre à tube centrifuge pores de 0,22 pm.
  3. Laisser incuber le mélange de cellules, les facteurs de croissance et / ou inhibiteur d' agents dans une atmosphère humidifiée de 10% de CO2 pendant 48 heures. Effectuer le test dans un conteneur humidifié qui a du papier de soie imbibé d'eau et permet d'échange de gaz. A la fin de la période d'incubation, on évalue l'essai avec l'une des méthodes alternatives listées ci-dessous, qui sont des marqueurs de substitution du nombre de cellules viables dans le puits.
  4. Alternative # 1: 3 H-thymidine Incorporation
    Remarque: Cette quantification est conçu pour le format de plaque à 96 puits.
    1. Après incubation des plaques d'essai pendant 48 heures à 37 ° C (volume de 150 ul par puits), ajouter 3 H-thymidine dans un volume de 50 pi de milieu d'essai (Ba / F3 milieu de culture sans IL-3 / WEHI-3D ​​CM) par puits à une concentration de 20 pCi / ml, donnant une dose finale de 1 pCi par puits.
    2. Incuber les plaques pendant 4 heures à 37 ° C avant la récolte des cellules en utilisant un récolteur de cellules. Extraire des échantillons individuels en plaçant les filtres de scintillation et de quantifier avec un compteur à scintillation liquide.
  5. Alternative # 2: bioluminescence Détection de Cellular ATP
    Remarque: Cette approche utilise un réactif de contrôle de l'ATP qui, lorsqu'il est combiné avec le lysat cellulaire peut générer un signal de bioluminescence qui reflète les cellules viables dans la population.
    1. lyser les cellules afin d'extraire l'ATP et l'utilisation d'un réactif de surveillance de l'ATP pour produire unle signal luminescent selon les instructions du fabricant. Lire la luminescence en utilisant un luminomètre compatible avec un format de plaque à 96 puits.
  6. Alternative # 3: Réduction enzymatique d'un colorant indicateur par des cellules viables
    Remarque: des analyses basées résazurine montrent une bonne corrélation avec la viabilité cellulaire.
    1. Combiner des cellules cultivées avec le colorant à base de résazurine et de quantifier les essais en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence selon les instructions du fabricant.

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Résultats

Dans cette section, nous montrons les résultats d'une expérience démontrant les caractéristiques essentielles d'un bioessai VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (voir la figure 1 pour les principes de l'essai). D' autres études publiées démontrent des applications plus larges de l'essai pour d' autres VEGFR-2 ligands, molécules de VEGF mutantes et des anticorps monoclonaux inhibiteurs 8,10,19,24-30.

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Discussion

L'essai décrit ici repose sur l'utilisation de cellules de grande viabilité, qui dépendent des facteurs de croissance. Les cellules doivent donc être soigneusement cultivées pour assurer qu'ils sont le facteur de charge, et de conserver l'expression du récepteur chimérique. Veiller à ce que le milieu est fraîchement préparé et non stocké pendant une période excessivement longue et que WEHI-CM 3D est très actif est important. Les cellules doivent être soigneusement lavés à partir de IL-3 dans un milieu co...

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Déclarations de divulgation

Steven A. Stacker et Marc M. Achen sont actionnaires de Circadian Technologies Ltd., une société de développement thérapeutique en ciblant la famille de VEGF de facteurs de croissance.

Remerciements

SAS et MGA sont soutenus par des subventions de projet, une subvention de programme et des bourses de recherche du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie (NHMRC), et par des fonds du programme de soutien à l’infrastructure opérationnelle fournis par le gouvernement de Victoria, Australie. MMH bénéficie du soutien d’une subvention de la Fondation Peter MacCallum.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Trypan BlueSigma-AldrichT8154dans du PBS est utilisée 1:1 avec des suspensions cellulaires pour mesurer les cellules viables. Risque pouvant causer le cancer
G418 Sulfate (Geneticin)Invivogenant-gn-5Agent pour la sélection des cellules eucaryotes transfectées. Danger - peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires.
3H-ThymidinePerkinElmerNET-027Ce nucléoside radioactif est incorporé dans l’ADN chromosomique pendant la mitose. Hazard-radiation
Vialight Plus KitLonzaLT07-221Détection bioluminescente de l’ATP cellulaire pour quantifier la viabilité, à l’aide du réactif de surveillance de l’ATP
Prestoblue Réactif de viabilité cellulaireInvitrogenA13261Indicateur de viabilité cellulaire basé sur la résazurine. Devient de couleur rouge dans l’environnement réducteur de la cellule
Nunc Minitray avec Nunclon Delta Surface (72 puits)Thermo Scientific136528Petite plaque de microtitrage
96 puits Plaque de culture tissulaireFalcon, Corning Inc.
DMEM (1X)Gibco11965-92
GlutaMAX (100X)Gibco35050-061
Sérum fœtalbovin Gibco  ; 10099-141
Récolteuse de cellulesTomtec Life SciencesMoissonneuse Tomtec, 96 Mach 3M Récolteur de cellules
Compteur à scintillation liquideLKB Wallac1205LKB Wallac 1205 Betaplate Compteur à scintillation
UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177Blanc 96 puits Barex Microplaque avec filtre GF/B de 1 µ ; m pore
gentamicineGibco, Life Technologies15750-060
Pénicilline/streptomycineGibco, Life Technologies15140-122
0,22 um poreCostar, Corning Inc.8160Les filtres à tube de centrifugation ont une valeur de 0,22 & micro ; unité de filtration à membrane CA à pores dans un 500 & micro ; Tube de microcentrifugation en polypropylène d’une capacité L.
Lecteur de fluorescenceBioTekBioTek Synergy 4 Lecteur de microplaques hybrides  ;
La solution à 0,4 % de 353072 cellulose unité de filtre à tube centrifuge

Références

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Mots-clés

Facteur de croissance endoth lial vasculaireliaison du ligand au VEGFR 2lign e cellulaire Ba F3essai de retrait d IL 3mesure de la viabilit cellulaireexclusion au bleu trypancomptage cellulaire au h macytom treincubation en chambre humidifi eanalyse en microscopie contraste de phasequantification d un marqueur substitut

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