Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d'insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

Summary

Ici, une nouvelle méthode qui permet de convertir les fibroblastes de la peau adulte en cellules sécrétant de l’insuline est présentée. Cette technique est basée sur la conversion épigénétique, n’implique pas l’utilisation de vecteurs rétroviraux ni l’acquisition d’un état pluripotent stable. Il est donc très prometteur pour les applications de la médecine translationnelle.

Abstract

La médecine régénérative nécessite de nouvelles cellules entièrement fonctionnelles qui sont livrées aux patients afin de réparer les tissus dégénérés ou endommagés. Lorsque de telles cellules ne sont pas facilement disponibles, elles peuvent être obtenues en utilisant différentes approches qui incluent, parmi les nombreuses suivantes, la reprogrammation et la transdifférenciation, avec des avantages et des limites spécifiques aux différentes techniques. Ici, une nouvelle stratégie pour la conversion d’un fibroblaste adulte mature en une cellule sécrétant de l’insuline, arbitrairement désignée comme cellules converties épigénétiques (EpiCC), est décrite. La méthode a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes contrôlant la régulation épigénétique du destin et de la différenciation cellulaires. En particulier, la première étape utilise un modificateur épigénétique, à savoir la 5-aza-cytidine, pour conduire les cellules adultes dans un état « hautement permissif ». Il profite ensuite de cette fenêtre brève et réversible de plasticité épigénétique, pour réadresser les cellules vers une lignée différente. L’approche est appelée « conversion cellulaire épigénétique ». Il s’agit d’un moyen simple et robuste d’obtenir un commutateur inter-lignage cellulaire efficace, contrôlé et stable. Étant donné que le protocole n’implique l’utilisation d’aucune transfection de gènes, qu’il est exempt de vecteurs viraux et qu’il n’implique pas d’état pluripotent stable, il est très prometteur pour les applications de médecine translationnelle.

Introduction

Un objectif fondamental de la médecine régénérative est la génération de nouvelles cellules, fonctionnels qui peuvent être utilisés pour réparer ou remplacer endommagé, dégénéré tissus. Refaire cellules adultes facilement disponibles dans de nouveaux, en les convertissant d'un type de cellule à une autre, est une approche particulièrement attrayante, surtout lorsque la population de cellules requises ne sont pas abondants ou difficiles d'accès. Cependant, les cellules adultes sont remarquablement stables. Ils acquièrent leur état ​​différencié à travers une restriction progressive de leurs options et, une fois qu'ils atteignent la spécialisation terminale....

Protocol

Remarque: Toutes les procédures décrites ci-après doivent être effectuées sous hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Assurez-vous que toutes les procédures de culture sont effectués sur les stades thermostatiques et les cellules sont maintenues à 37 ° C tout au long de leur traitement.

1. Peau Fibroblast Isolation

1. Préparer Culture Solution Dish Coating
   1. Dissoudre 0,1 g de gélatine de porc dans 100 ml d'eau (concentration finale 0,1%). Stériliser solution avec autoclave.
   2. Ajouter 1,5 ml de stérile à 0,1% de gélatine porcine à 35 mm des boîtes de Pétri. Attendre 2 heures pour enrober, de les maintenir à la températ....

Results

Mise en place de la culture primaire à partir de biopsies de peau
Des biopsies cutanées ont été découpées en petits morceaux et placés dans des boîtes pré-revêtues de gélatine. Au bout de 6 jours, les fibroblastes commencent à croître à partir de fragments de tissus et ont formé une monocouche de cellules (figure 1A). Les cellules ont montré une forme typique allongée et, comme prévu, affichent une immuno-positivité uniforme pour le fibroblaste spécifique marqueur v.......

Discussion

La présente manuscrit décrit un procédé qui permet la conversion des fibroblastes de peau humaine dans des cellules productrices d'insuline, par une exposition transitoire et de courte durée à 5-aza-CR, suivi d'un protocole d'induction spécifique d'un tissu. Cette approche permet un passage du mésoderme aux cellules de l' endoderme liées, sans l'expression forcée de facteurs de transcription ou de microARN , ni l'acquisition d'un état ​​pluripotent stable, qui rend les cellules plus insta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D5652	PBS ; pour le lavage cellulaire et la préparation de solutions
Solution antibiotique antimycosique	Sigma	A5955	Composant du fibroblaste, de l’HP et du milieu pancréatique
100 mm Boîte de Pétri	Sarstedt	83.3902	Pour l’isolement des fibroblastes
Gélatine porcine	Sigma	G1890	Pour l’enrobage de la vaisselle
Eau	Sigma	W3500	Pour la préparation de la solution
Boîtes de Pétri 35 mm	Sarstedt	83.39	Pour l’isolement des fibroblastes
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	41966052	Pour la culture de fibroblastes
fœtal	Bovin Life Technologies	10500064	FBS ; Composant des fibroblastes et des supports HP
Solution de L-glutamine	Sigma	G7513	Composant des médias des fibroblastes, des HP et du pancréas
Solution de trypsine-EDTA	Sigma	T3924	Pour la dissociation des fibroblastes
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS	Hycor Biomedical	87144	Comptage cellulaire
5-Azacytidine	Sigma	A2385	5-aza-CR, pour l’augmentation des cellules plasticité dans les fibroblastes
Ham Ham’s F-10 Nutrient Mix	Life Technologies	31550031	Pour HP medium
DMEM, low glucose, pyruvate	Life Technologies	31885023	Pour HP medium
KnockOut Serum Replacement Life	Technologies	10828028	Composant de HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life	Technologies	11140035	Composant du milieu basal HP et pancréatique
2-Mercaptoethanol	Sigma	M7522	Composant du milieu basal HP et pancréatique
Guanosine	Sigma	G6264	Mélange de nucléosides composant du milieu HP
Adénosine	Sigma	A4036	Composant du mélange de nucléosides composant du milieu HP
Cytidine	Sigma	C4654	Composant du mélange de nucléosides du milieu HP
Uridine	Sigma	U3003	Composant de mélange de nucléosides de HP medium
Thymidine	Sigma	T1895	Composant de mélange de nucléosides de HP medium
Millex-GS 0,22 µ ; m	Millipore	SLGS033SB	Pour la stérilisation de la solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Life	Technologies	PHG0261	bFGF ; Composant de HP et du milieu basal pancréatique
Albumine sérique bovine	Sigma	A3311	BSA ; Composant du milieu basal pancréatique
DMEM/F-12	Life Technologies	11320074	Pour le milieu basal pancréatique
Supplément B-27 moins de vitamine A Life	Technologies	12587010	Composant du milieu pancréatique
N-2 Supplement	Life Technologies	17502048	Composant du milieu basal pancréatique
Activine A Recombinant Human	Protein Life Technologies	PHG9014	Pour le milieu pancréatique
Acide rétinoïque	Sigma	R2625	Pour le milieu pancréatique
Diméthyl sulfoxyde Sigma	D2650	DMSO ; pour la préparation de l’acide rétinoïque
Insuline-Transferrin-Selenium	Life Technologies	41400045	ITS ; pour le milieu final pancréatique
Anticorps anti-Vimentine  ;	Abcam	ab8069	Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:100
4&prime ;,6-Diamidino-2-phénylindole dichlorhydrate	Sigma	32670	DAPI. Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail  ; 1 et micro ; g/ml
5-Methylcytidine	Eurogentec	MMS-900P-B	Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:500
Anticorps anti-peptide C  ;	Abcam	ab14181	Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:100
Anticorps anti-PDX1  ;	Abcam	ab47267	Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:500
Mercodia Insuline ELISA	Mercodia	10-1113-10	Pour la détection de la libération d’insuline