Article de méthode

Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d'insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

DOI :

10.3791/53880

⸱

18 mars 2016

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1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

Dans cet article

Résumé

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Ici, une nouvelle méthode qui permet de convertir les fibroblastes de la peau adulte en cellules sécrétant de l’insuline est présentée. Cette technique est basée sur la conversion épigénétique, n’implique pas l’utilisation de vecteurs rétroviraux ni l’acquisition d’un état pluripotent stable. Il est donc très prometteur pour les applications de la médecine translationnelle.

Résumé

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La médecine régénérative nécessite de nouvelles cellules entièrement fonctionnelles qui sont livrées aux patients afin de réparer les tissus dégénérés ou endommagés. Lorsque de telles cellules ne sont pas facilement disponibles, elles peuvent être obtenues en utilisant différentes approches qui incluent, parmi les nombreuses suivantes, la reprogrammation et la transdifférenciation, avec des avantages et des limites spécifiques aux différentes techniques. Ici, une nouvelle stratégie pour la conversion d’un fibroblaste adulte mature en une cellule sécrétant de l’insuline, arbitrairement désignée comme cellules converties épigénétiques (EpiCC), est décrite. La méthode a été développée, basée sur la compréhension croissante des mécanismes contrôlant la régulation épigénétique du destin et de la différenciation cellulaires. En particulier, la première étape utilise un modificateur épigénétique, à savoir la 5-aza-cytidine, pour conduire les cellules adultes dans un état « hautement permissif ». Il profite ensuite de cette fenêtre brève et réversible de plasticité épigénétique, pour réadresser les cellules vers une lignée différente. L’approche est appelée « conversion cellulaire épigénétique ». Il s’agit d’un moyen simple et robuste d’obtenir un commutateur inter-lignage cellulaire efficace, contrôlé et stable. Étant donné que le protocole n’implique l’utilisation d’aucune transfection de gènes, qu’il est exempt de vecteurs viraux et qu’il n’implique pas d’état pluripotent stable, il est très prometteur pour les applications de médecine translationnelle.

Introduction

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Un objectif fondamental de la médecine régénérative est la génération de nouvelles cellules, fonctionnels qui peuvent être utilisés pour réparer ou remplacer endommagé, dégénéré tissus. Refaire cellules adultes facilement disponibles dans de nouveaux, en les convertissant d'un type de cellule à une autre, est une approche particulièrement attrayante, surtout lorsque la population de cellules requises ne sont pas abondants ou difficiles d'accès. Cependant, les cellules adultes sont remarquablement stables. Ils acquièrent leur état ​​différencié à travers une restriction progressive de leurs options et, une fois qu'ils atteignent la spécialisation terminale mature, ils conservent de manière stable , il 1.

Dans les dernières années , un certain nombre de protocoles ont été développés, qui permettent la reprogrammation de la pluripotence d'une cellule somatique (iPS) obtenue par l'expression forcée d'un ensemble de facteurs de transcription 2,3. Alternativement, la conversion de cellules peut être obtenue par transdifférenciation lignée directe, l' introduction d' un seul 4 ou une combinaison de facteurs de transcription 5-7. Cette stratégie ne concerne pas le passage par un état ​​de différenciée mais nécessite une forte expression de facteurs de transcription spécifiques 8.

Nous avons récemment développé un protocole de conversion basé sur la brève exposition des cellules adultes aux propriétés de déméthylation de la cytidine analogique 5-azacytidine (5-aza-CR), un inhibiteur de l'ADN méthyltransférase bien caractérisé. L'étape de déméthylation est immédiatement suivie par un protocole de différenciation spécifique 11/09 qui permet d'obtenir le phénotype de terminal requis. Ce procédé est capable de transformer des cellules matures différenciées en cellules d'une lignée différente et présente l'avantage considérable d'éviter à la fois l'utilisation de vecteurs viraux et la transfection de facteurs de transcription exogènes. L'acquisition d'un état pluripotent stable, et une sensibilité accrue liée à la cellule d'instabilité est également évitée.

Le protocole détaillé qui permet la conversion des fibroblastes adultes de peau humaine en cellules sécrétrices d'insuline entièrement fonctionnel est présenté ici. Toutefois, il convient de noter que la technique a été appliquée à différents types de cellules et a donné des résultats positifs, lorsque les cellules d'adressage vers différentes voies de différenciation. En outre, la conversion épigénétique a été utilisé avec succès dans l'espèce humaine et porcine 9-13, ainsi que chez le chien (manuscrit soumis) , suggérant une grande efficacité et la robustesse de l'approche.

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Protocole

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Remarque: Toutes les procédures décrites ci-après doivent être effectuées sous hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Assurez-vous que toutes les procédures de culture sont effectués sur les stades thermostatiques et les cellules sont maintenues à 37 ° C tout au long de leur traitement.

1. Peau Fibroblast Isolation

  1. Préparer Culture Solution Dish Coating
    1. Dissoudre 0,1 g de gélatine de porc dans 100 ml d'eau (concentration finale 0,1%). Stériliser solution avec autoclave.
    2. Ajouter 1,5 ml de stérile à 0,1% de gélatine porcine à 35 mm des boîtes de Pétri. Attendre 2 heures pour enrober, de les maintenir à la température ambiante.
      Nota: Les biopsies de peau humaines sont recueillies par excision sous anesthésie locale d'une zone avasculaire de la face antérieure de l'avant-bras et stockés dans un tampon phosphate salin de Dulbecco (PBS) additionné de 2% d'une solution antimycosique antibiotique à 4 ° C avant utilisation.
  2. biopsies Laver avec de nouvelles PBS additionné de 2% Antibisolution antimycosique otique.
  3. La place des biopsies dans un plat de 100 mm de Pétri et coupées en environ 2 mm 3 fragments avec scalpels stériles.
  4. Retirer la solution revêtement en excès immédiatement avant le placage des fragments.
  5. Placez 5-6 fragments de peau dans le plat pré-enduit de 35 mm de Pétri.
  6. Préparer un milieu de culture de fibroblaste: 77% de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) riche en glucose, 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de solution de L-glutamine et 2% d'une solution antibiotique antimycotique.
  7. Ajouter une goutte de milieu sur chaque fragment fibroblaste (habituellement 100 ul par fragment) et les cultiver à 37 ° C dans 5% de CO2.
  8. Après 24 h, ajouter 500 pi de milieu de culture de fibroblastes sur les fragments pour les garder humide à 37 ° C dans 5% de CO 2.
  9. Changer le support avec une pipette au moins une fois toutes les 48 heures.
  10. Après 6 jours d'incubation, éliminer les fragments de tissus soigneusement et jetez-les.
    Remarque: Après 6 jours, fibroblastes commencent à se développer à partir de fragments de tissus et commencent à former une monocouche cellulaire.
  11. Actualiser la moyenne, ajouter 2 ml de milieu de culture de fibroblastes et de continuer la culture monocouche de cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.

2. Fibroblast Culture

  1. Des fibroblastes de culture à 37 ° C dans 5% de CO 2 jusqu'à 80% de confluence
  2. Pour les passages, Aspirer le milieu de culture de fibroblastes à partir des boîtes de culture tissulaire. Laver les cellules trois fois avec 4 ml de PBS supplémenté avec 1% de solution antibiotique antimycotique.
  3. Ajouter une couche mince (10% du volume du milieu de culture) de solution de trypsine-EDTA (0,5 g / l de trypsine porcine et 0,2 g / L d'EDTA) et on incube à 37 ° C jusqu'à la monocouche cellulaire commence à se détacher de la partie inférieure du tissu boîte de culture et les cellules se dissocient.
  4. Diluer la suspension cellulaire avec 9 parties de milieu de culture de fibroblaste pour neutraliser l'action de la trypsine. La centrifugation est pas nécessaire.
  5. cellules en plaques dans de nouvelles boîtes de culture (avecen gélatine) et la culture à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Gardez le rapport de passage entre 1: 2 et 1: 4, en fonction du taux de croissance.
  6. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, le passage entre eux (habituellement deux fois par semaine).

3. Fibroblast Placage pour la conversion épigénétique

  1. Ajouter 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gélatine porcine (comme décrit dans la préparation 1.1) dans des boîtes de culture cellulaire. Attendre 2 heures pour enrober.
  2. On élimine la solution de revêtement en excès de 10 à 30 minutes avant le placage des fibroblastes.
  3. Éliminer le milieu de culture des fibroblastes à partir de boîtes de culture. Laver les cellules trois fois avec du PBS additionné de 1% solution antifongique antibiotique.
  4. Ajouter une couche mince (10% du volume du milieu de culture) de solution de trypsine-EDTA (0,5 g / l de trypsine porcine et 0,2 g / L d'EDTA) et on incube à 37 ° C jusqu'à la monocouche cellulaire commence à se détacher de la partie inférieure du tissu boîte de culture et les cellules se dissocient.
  5. Diluer la suspension cellulaire avec 9 parties de fibroblMilieu de culture ast pour neutraliser l'action de la trypsine.
  6. Nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope à température ambiante. Calculer le volume requis de milieu de culture de fibroblaste pour remettre en suspension les cellules, pour obtenir une concentration cellulaire de 7,8 x 10 4 fibroblastes / cm2. Cela dépendra du type particulier de chambre utilisée.
    Cellules / pl = Nombre moyen de cellules par petite grille x 90 (facteur de multiplication) x dilution
  7. Centrifuger la suspension de cellules à 150 g pendant 5 min à température ambiante. Éliminer les cellules surnageant et remettre le volume précédemment calculé de milieu de culture de fibroblastes.
  8. Cellules de plaques sur 0,1% de gélatine plats et la culture les pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur pré-revêtues.

4. Augmenter la plasticité cellulaire Utilisation du De-méthylation Agent 5-aza-CR

  1. jour 0
    1. Préparer 5-aza-CR solution mère en dissolvant 2,44 mg de 5-aza-CR dans 10 ml de DMEM haute medi de glucoseum. Stériliser par filtration. Préparer 5-aza-CR actions immédiatement avant l'utilisation.
    2. Diluer 1 pl de 5-aza-CR solution mère dans 1 ml de milieu de culture de fibroblastes (concentration finale de 1 uM).
    3. Pour augmenter la plasticité des cellules, 24 heures après l' étalement des cellules (sous - position 3.8), éliminer le milieu de culture à partir de fibroblastes ensemencés et ajouter 1 uM 5-aza-CR solution mère et de la culture pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
  2. jour 1
    1. Préparer pluripotentes humaines (HP) du milieu frais comme décrit dans le tableau 1.
    2. Après incubation avec 1 pM de 5-aza-CR, éliminer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS pour veiller à ce que 5-aza-CR est rincé.
    3. Incuber 5-aza-CR fibroblastes traités avec du milieu HP pendant 3 h (période de récupération) à 37 ° C dans 5% de CO 2.
    4. Après la période de récupération, éliminer le milieu, laver trois fois avec PBS.
    5. Pour surveiller l'efficacité du traitement-CR 5-aza, vérifier dans cette étape fou la présence de changements morphologiques (détaillée dans la section des résultats). Les cellules perdent la morphologie allongée typique de fibroblastes et d'acquérir une forme ronde ou ovale, devenant de plus petite taille, avec des noyaux agrandis.
    6. Procéder à la différenciation pancréatique.

5. Pancreatic Protocole Différenciation

  1. Jours 1-6
    1. Préparer Pancreatic Basal Medium , comme décrit dans le tableau 2.
    2. Préparer activine Une solution mère: dissoudre 5 pg d'activine Une protéine humaine recombinante dans 166,6 pi d'eau stérile.
    3. Culture 5-aza-CR fibroblastes traités dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium, additionné de 1 pl / ml activine Une solution mère (voir 5.1.2) pendant 6 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Changer le milieu tous les jours.
  2. Jours 7-8
    1. Préparer rétinoïque solution mère d'acide en ajoutant 16,6 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 50 mg de aci rétinoïqueré.
    2. Cellules de culture dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium supplémenté avec 1 pl / ml activine Une solution mère (voir 5.1.2) et / ml de solution mère d' acide rétinoïque 1 pl (voir 5.2.1) pendant 2 jours à 37 ° C à 5% de CO 2. Changer le milieu tous les jours.
  3. Jours 9-36
    1. Cellules de culture dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium supplémenté avec 1% (v / v) Insulin-transferrine-Sélénium (ITS), 2% (v / v) B27 et 0,1% (v / v) recombinant FGF humain de base (bFGF) solution mère (voir le tableau 1) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Changer le support quotidien pour les 15 premiers jours.
    2. A partir du jour 16 avant, rafraîchir milieu tous les deux jours, sous un microscope, étant donné que les cellules formant des agrégats peut se détacher de la partie inférieure de la boîte de culture.

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Résultats

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Mise en place de la culture primaire à partir de biopsies de peau
Des biopsies cutanées ont été découpées en petits morceaux et placés dans des boîtes pré-revêtues de gélatine. Au bout de 6 jours, les fibroblastes commencent à croître à partir de fragments de tissus et ont formé une monocouche de cellules (figure 1A). Les cellules ont montré une forme typique allongée et, comme prévu, affichent une immuno-positivité uniforme pour le fibroblaste spécifique marqueur v...

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Discussion

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La présente manuscrit décrit un procédé qui permet la conversion des fibroblastes de peau humaine dans des cellules productrices d'insuline, par une exposition transitoire et de courte durée à 5-aza-CR, suivi d'un protocole d'induction spécifique d'un tissu. Cette approche permet un passage du mésoderme aux cellules de l' endoderme liées, sans l'expression forcée de facteurs de transcription ou de microARN , ni l'acquisition d'un état ​​pluripotent stable, qui rend les cellules plus insta...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent avoir aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et la Fondation européenne pour l'étude du diabète (EFSD). GP est soutenu par une bourse post-doc de l'Université de Milan. Les auteurs sont membres de l'Action COST FA1201 Epiconcept: Epigénétique et périconceptionnelle environnement et l'action COST partage BM1308 avance sur les grands modèles animaux (SALAAM). TALB est membre du COST Action CM1406 épigénétique Chemical Biology (EPICHEM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigmaD5652PBS ; pour le lavage cellulaire et la préparation de solutions
Solution antibiotique antimycosiqueSigmaA5955Composant du fibroblaste, de l’HP et du milieu pancréatique
100 mm Boîte de PétriSarstedt83.3902Pour l’isolement des fibroblastes
Gélatine porcineSigmaG1890Pour l’enrobage de la vaisselle
EauSigmaW3500Pour la préparation de la solution
Boîtes de Pétri 35 mmSarstedt83.39Pour l’isolement des fibroblastes
DMEM, high glucose, pyruvateLife Technologies41966052Pour la culture de fibroblastes
fœtalBovin Life Technologies10500064FBS ; Composant des fibroblastes et des supports HP
Solution de L-glutamineSigmaG7513Composant des médias des fibroblastes, des HP et du pancréas
Solution de trypsine-EDTASigmaT3924Pour la dissociation des fibroblastes
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDSHycor Biomedical87144Comptage cellulaire
5-AzacytidineSigmaA23855-aza-CR, pour l’augmentation des cellules plasticité dans les fibroblastes
Ham Ham’s F-10 Nutrient MixLife Technologies31550031Pour HP medium
DMEM, low glucose, pyruvateLife Technologies31885023Pour HP medium
KnockOut Serum Replacement LifeTechnologies10828028Composant de HP medium
MEM Non-Essential Amino Acids Solution LifeTechnologies11140035Composant du milieu basal HP et pancréatique
2-MercaptoethanolSigmaM7522Composant du milieu basal HP et pancréatique
GuanosineSigmaG6264Mélange de nucléosides composant du milieu HP
AdénosineSigmaA4036Composant du mélange de nucléosides composant du milieu HP
CytidineSigmaC4654Composant du mélange de nucléosides du milieu HP
UridineSigmaU3003Composant de mélange de nucléosides de HP medium
ThymidineSigmaT1895Composant de mélange de nucléosides de HP medium
Millex-GS 0,22 µ ; mMilliporeSLGS033SBPour la stérilisation de la solution
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein LifeTechnologiesPHG0261bFGF ; Composant de HP et du milieu basal pancréatique
Albumine sérique bovineSigmaA3311BSA ; Composant du milieu basal pancréatique
DMEM/F-12Life Technologies11320074Pour le milieu basal pancréatique
Supplément B-27 moins de vitamine A LifeTechnologies12587010Composant du milieu pancréatique
N-2 SupplementLife Technologies17502048Composant du milieu basal pancréatique
Activine A Recombinant HumanProtein Life TechnologiesPHG9014Pour le milieu pancréatique
Acide rétinoïqueSigmaR2625Pour le milieu pancréatique
Diméthyl sulfoxyde SigmaD2650DMSO ; pour la préparation de l’acide rétinoïque
Insuline-Transferrin-SeleniumLife Technologies41400045ITS ; pour le milieu final pancréatique
Anticorps anti-Vimentine  ;Abcamab8069Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:100
4&prime ;,6-Diamidino-2-phénylindole dichlorhydrateSigma32670DAPI. Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail  ; 1 et micro ; g/ml
5-MethylcytidineEurogentecMMS-900P-BPour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:500
Anticorps anti-peptide C  ;Abcamab14181Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:100
Anticorps anti-PDX1  ;Abcamab47267Pour l’analyse immunocytochimique. Dilution de travail 1:500
Mercodia Insuline ELISAMercodia10-1113-10Pour la détection de la libération d’insuline
Sérum

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Traitement la 5 aza cytidineDiff renciation pancr atiqueInduction l acide r tino queSuppl mentation en activine AMilieu ITS B27 BFGSCo localisation de PDX1 et CPEPLib ration d insuline stimul e par le glucose

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