Article de méthode

Extracellulaires enregistrement de l'activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

DOI :

10.3791/53914

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21 mai 2016

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1Auditory Neuroscience Laboratory, Institute of Neuroscience of Castilla y León, University of Salamanca, 2Neural Systems Laboratory, Institute for Systems Research, University of Maryland, 3Medical Research Council Institute of Hearing Research, 4Department of Cell Biology and Pathology, Faculty of Medicine, University of Salamanca

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons des méthodes de construction d’électrodes pour enregistrer simultanément l’activité neuronale extracellulaire et libérer plusieurs substances neuroactives au voisinage des sites d’enregistrement chez les souris éveillées. Cette technique permet l’analyse détaillée des entrées synaptiques locales présumées vers le neurone d’intérêt.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les différences dans l'activité des neurotransmetteurs et neuromodulateurs, et par conséquent différentes réponses neuronales, peut être trouvée entre les animaux anesthésiés et éveillés. Par conséquent, des méthodes permettant la manipulation des systèmes synaptiques chez les animaux éveillés sont nécessaires afin de déterminer la contribution des entrées synaptiques pour le traitement neuronal affecté par les anesthésiques. Ici, nous présentons une méthodologie pour la construction d'électrodes pour enregistrer simultanément l'activité neuronale extracellulaire et libèrent des substances neuroactives multiples au voisinage des sites d'enregistrement des souris éveillées. En combinant ces méthodes, nous avons effectué des injections de microiontophoretic gabazine pour bloquer sélectivement les récepteurs GABA A dans les neurones de colliculus inférieur des souris frontales retenue. Gabazine modifié avec succès des propriétés de réponse neuronaux tels que la zone de réponse en fréquence et adaptation spécifique stimulus. Ainsi, nous démontrons que nos méthodes sont appropriées pour recording activité d'une seule unité, et pour disséquer le rôle des récepteurs spécifiques de neurotransmetteurs dans le traitement auditif.

La principale limitation de la procédure décrite est le temps d'enregistrement relativement courte (~ 3 h), ce qui est déterminé par le niveau d'accoutumance de l'animal à des sessions d'enregistrement. D'autre part, plusieurs sessions d'enregistrement peuvent être réalisées dans le même animal. L'avantage de cette technique par rapport à d'autres procédures expérimentales utilisées pour manipuler le niveau de neurotransmission ou neuromodulation (par exemple sous forme d'injections systémiques ou l'utilisation de modèles optogénétiques), est que l'effet du médicament est confinée aux entrées synaptiques locales au neurone cible. En outre, l'usage, la fabrication d'électrodes permet un réglage de paramètres spécifiques en fonction de la structure neuronale et le type de neurone d'intérêt (telles que la résistance de pointe pour améliorer le rapport signal sur bruit des enregistrements).

Introduction

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L'interaction de l' excitation neuronale et l' inhibition est fondamentale pour le traitement de l' information sensorielle 1. Il est également connu que l' anesthésie a un fort impact sur ​​la dynamique de l' activation corticale et la structure temporelle des entrées synaptiques 2,3. Par exemple, il a été observé que les anesthésiques modifient la durée des réponses visuelles évoquées dans les neurones corticaux 3,4. En outre, le rapport entre excitateurs et entrées synaptiques inhibitrices est différent chez les animaux anesthésiés et éveillés 4,5, modifiant à la fois évoqués et les taux d'activité spontanée 6,7. En mesurant les conductances synaptiques, Haider et ses collègues 4 ont trouvé que l' inhibition appariés excitation en amplitude sous anesthésie alors que pendant l' éveil, l' inhibition était plus forte que l' excitation. Ces résultats incitent le développement de procédures expérimentales pour étudier l'impact des entrées synaptiques spécifiques sur le traitement sensoriel chez les animaux éveillés.

L'éjection contrôlée de substances neuroactifs chargées en appliquant de petites injections de courant (de l'ordre de nA) a été largement utilisée pour étudier la contribution des entrées synaptiques et le rôle des récepteurs cellulaires putatifs dans le traitement sensoriel 8-13 . Cette technique, connue sous le nom microiontophorèse, permet l'application de médicaments dans le voisinage du neurone enregistré, ce qui contribue à un effet rapide et confiné. Cette procédure est plus approprié pour étudier les effets locaux des substances neuroactives, par rapport à l'effet généralisée provoquée par d'autres manipulations expérimentales telles que les injections systémiques, microdialyse ou l'utilisation de techniques optogénétiques. Habituellement, une configuration d'électrode ferroutage 14,15 est utilisé pour enregistrer simultanément le neurone cible et de livrer les substances neuroactifs d'intérêt. Il se compose d'une électrode d'enregistrement fixé à une pipette de multibarrel qui transporte les substances neuroactives. Modifications de l'oprocédure riginal décrite par Havey et Caspary 14 ont été mis en œuvre. Par exemple, une électrode en tungstène, au lieu d'un verre, peut être utilisé pour enregistrer l'activité neuronale 16. Méthodes publiées précédemment pour la fabrication d'électrodes de tungstène 17,18 comportent trois étapes générales: gravure électrolytique de pointes de fil de tungstène, l' isolation en verre, et l' ajustement de l'exposition de pointe pour répondre aux exigences d'enregistrement.

Un champ intéressant et émergente en neurosciences auditive est l'étude de l' adaptation spécifique à stimulus (SSA 19). SSA est une diminution spécifique de la réponse neurale aux sons répétitifs qui ne généralisent pas à d'autres sons rarement présentés. L'importance de l' ASS réside dans son rôle potentiel comme un mécanisme neuronal de détection de déviation sous - jacente dans le cerveau auditif, ainsi que d' une éventuelle corrélation neuronale pour la composante non - concordance de la négativité tardive du potentiel évoqué auditif 20,21. SSA occurs de l'IC jusqu'au cortex auditif 19,22-24. GABA A l' inhibition médiée a été démontrée à agir en tant que mécanisme de contrôle de gain sur SSA 7,16,25, qui a également été montré pour être affectés par l' anesthésie 26. Ici , nous présentons un protocole qui combine les méthodes décrites précédemment pour l' enregistrement de l'activité d'une seule unité de neurones de circuits intégrés avant et pendant l'application d'un antagoniste sélectif des récepteurs ai GABA A chez des souris éveillées. Tout d'abord, nous décrivons la fabrication d'électrodes ferroutage et à côté, les méthodes chirurgicales et d'enregistrement. Pour tester l'efficacité de libération du médicament, nous avons comparé le champ récepteur ainsi que le niveau de SSA des neurones IC avant et pendant l'éjection de microiontophoretic gabazine.

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Protocole

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Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées à l'Université de Salamanque avec l'approbation, et en utilisant des méthodes conformes aux normes de l'Université de Animal Care Committee Salamanca, ainsi que les normes de l'Union européenne (directive 2010/63 / UE) l'utilisation des animaux dans la recherche en neurosciences.

1. Tungsten Electrodes

Remarque: La fabrication des électrodes en tungstène est basé sur la technique originale décrite dans Merrill et Ainsworth et 27 Ainsworth et al 28 , et réalisée à l' aide de la configuration du poste de travail décrit dans Bullock et al 17...

  1. Pour enregistrer une seule unité l'activité extracellulaire de neurones IC, utiliser des électrodes avec une impédance de 1,5 pointe - 2,5 MQ. Ici, les étapes impliquées dans la fabrication des électrodes de tungstène sont décrits brièvement, car une description détaillée se trouve dans les références mentionnées ci-dessus.
  2. Placez des fils de tungstène dans un alignement sur mesureoutil (figure 1A) pour aider les couper à la longueur désirée. L'outil d'alignement se compose de 30 aiguilles (25 G) collées en parallèle à 2 mm intervalles, avec un arrêt à une extrémité pour limiter la longueur des fils à ~ 40 mm. Fixez soigneusement les extrémités libres des fils avec du ruban adhésif, et couper le reste du fil avec des ciseaux forts.
  3. Tirez doucement sur la bande afin d'éliminer les fils de tungstène à partir de l'outil d'alignement, en veillant à ce que tous les fils restent attachés à la bande. Rouler la bande sur une broche en laiton poli (figure 1B, C), tenant les fils fermement contre la broche donc il y a une bonne connexion électrique.
  4. Connectez la broche à un moteur de 5 tours dans le poste de travail, et plongez les pointes de fil en saillie dans une solution de gravure (KNO 2, 90 g par 80 ml). Angle de l'axe de broche 45 ° par rapport à la surface de la solution de gravure. Immerger les pointes des fils de telle sorte que ~ 1/3 des fils contacter la solution.
  5. ImmErse une électrode à tige de carbone dans le bain d'attaque chimique pour fermer le circuit. Utilisez un ressort tresse de cuivre pinceau pour appliquer l'alimentation de gravure à l'arbre de broche tandis que la broche tourne. Régler le courant qui est passé à travers les électrodes et la solution d'attaque chimique à 250 mA. Arrêtez la pointe de gravure lorsque le courant tombe à 200 mA. Les pointes des fils seront gravés dans des points très fins.
  6. Passer un fil aiguisé à travers une flamme pour enlever tout résidu de graisse et de l'adhésif. Placer le fil (extrémité franche en premier) dans un capillaire en verre au borosilicate (1,5 mm de diamètre extérieur, 0,86 mm DI) avec son extrémité inférieure bloquée par la pâte à modeler. Fixer la pipette verticalement en haut et en bas. Tirez la pipette en utilisant un serpentin de chauffage (diamètre de 5 mm, profondeur de 5 mm) et un piston suspendu. Comme le fil est tiré vers le bas par le poids du piston, le verre fondu forme une couche très fine autour d'elle.
  7. Retirez le verre recouvrant la pointe à l'extrémité pointue de l'électrode à l'aide d'un cordon fondu de sodiumtétraborate. Pour former le bourrelet, mélanger le tétraborate de sodium (~ 0,25 g) avec une petite quantité d'eau (~ 0,5 ml) lentement et le placer sur un élément chauffant, jusqu'à ce qu'il fonde dans un bourrelet ~ 2 mm de diamètre. La température de l'élément chauffant est contrôlé par un potentiomètre. Placez le talon et l'élément chauffant sur un bras manipulateur fixé à la table, et le déplacer jusqu'à ce que le bourrelet est concentré sous le microscope à faible grossissement.
  8. Fixez le fil de verre recouvert d'une lame et le placer sous le microscope. Déplacez le curseur avec les boutons de la scène jusqu'à ce que la pointe et le tétraborate perles sont en discussion. Chauffer le cordon jusqu'à ce qu'il fonde légèrement, et insérez la pointe du fil ~ 10 - 15 um. Tourner le potentiomètre de chauffage hors tension. Comme le bourrelet se refroidit, il se contracte et enlever le verre de la pointe de l'électrode, exposant le tungstène sous-jacente. L'électrode de tungstène est prêt à l'emploi.

Fabrication 2. Multibarrel verre Pipette

  1. Protéger les extrémités des multiplescapillaires en verre de canon (cinq barils en H-configuration) avec gaine thermo-rétractable, afin de permettre une meilleure adhérence aux pinces de traction et de prévenir la rupture, et placez un dans l'extracteur vertical.
  2. Pour obtenir des longueurs de ~ 15 mm de pointe, réglez l'extracteur sur les paramètres suivants: Heat: 84, force magnétique Sub: 49, force magnétique principal: 38. Peaufinez ces paramètres en fonction de la configuration particulière, ainsi que après avoir changé la élément chauffant.
  3. Tirez le capillaire pour obtenir deux pipettes avec les conseils occlus. Monter une pipette sur une lame en utilisant la pâte à modeler et de briser la pointe de la pipette sous le microscope jusqu'à ce que le diamètre extérieur est de ~ 20 - 30 um, en utilisant des ciseaux ou des pinces fines, ou le côté plat d'un scalpel. Si le bord cassé est trop rugueux, l'affiner en utilisant la technique du tétraborate de perles décrit dans l'étape 1.7.
  4. Placer une électrode en tungstène (de section 1), dans un support réalisé avec une aiguille de 20 G à l'extrémité d'un axe 3 Micropositionneur miniature monté sur le cerf de microscopee. En utilisant des pinces, pliez la fin de l'électrode 5 à - 10 °, ~ 30 mm de la pointe.
  5. Sous le microscope, aligner soigneusement l'électrode en tungstène sur la pointe de multibarrel. Une fois aligné, abaisser l'électrode jusqu'à ce qu'il contacte le multibarrel, montage dans la rainure entre les deux barils supérieurs. Faites glisser la pointe de l'électrode jusqu'à ce qu'il dépasse ~ 15-20 um loin de la pointe de l'multibarrel. Rendre l'angle entre l'électrode et la multibarrel aussi faible que possible pour obtenir une meilleure adhérence et un ensemble plus mince.
  6. Appliquer une petite goutte de lumière curable adhésif ~ 5 mm des conseils. Faites attention la colle ne parvient pas à la pointe pour éviter de bloquer les canaux de multibarrel.
  7. Cure de la colle à l'aide d'une lampe LED lumière bleue. Répétez la colle application / durcissement si nécessaire, pour une meilleure adhérence.
  8. Déplacer la platine du microscope doucement jusqu'à ce que l'extrémité de l'électrode en tungstène est libéré de son support. Retirez le ferroutage ensemble de la diapositive.
  9. Enveloppez ee section centrale de l'électrode piggy-back dans une courte longueur de thermorétractable tube et appliquer rapidement le durcissement époxy approprié pour le verre pour sécuriser davantage l'électrode en tungstène à l'multibarrel.

3. Médicaments pour microiontophorèse

Remarque: Les médicaments utilisés pour microiontophorèse doivent avoir une charge électrique lorsqu'il est dissous dans l'eau. Vérifiez la littérature pour voir si le médicament d'intérêt est approprié pour cette procédure. Ici, la procédure de gabazine, un antagoniste du récepteur GABA A, est décrit.

  1. Filtrer l'eau distillée en utilisant un filtre à seringue de 0,2 um pour stériliser l'eau et ne contenant pas d'obtenir des solutés. Préparer ~ 1000 ul de 20 mM gabazine utilisant cette eau distillée.
  2. Ajuster le pH de la dilution à 4 avec 0,2 um filtrée NaOH en utilisant une électrode de pH à pointe fine.
  3. Stockez 100 - 200 aliquotes à -20 ºC. Décongeler le jour de l'enregistrement. Ce jour-là, avant que l'animal est retenired, remplir les fûts (3 - 5 ul) de l'électrode de multibarrel avec les médicaments, à l'aide d'une microseringue de 100 pi munie d'une aiguille en matière plastique souple.

4. Chirurgie et Headpost Implantation

  1. Effectuer des expériences dans deux souris mâles CBA / J (Mus musculus) avec des poids de 27 et 30 g. Suivez les procédures chirurgicales et d' enregistrement de Bryant et ses collègues 29, Portfors et collaborateurs 30-32, et Duque et Malmierca 26.
  2. Dans les jours avant la chirurgie, la manipulation des animaux et les accoutumer à la chambre d'enregistrement en leur permettant d'explorer librement. Effectuer 3 séances par jour, chacune durant au moins 30 min. De cette façon, les animaux sera plus calme et confortable pendant les enregistrements.
  3. Anesthésier la souris en utilisant un mélange de kétamine (50 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) injecté par voie intramusculaire. Avec cette dose l'animal est profondément anesthésié pendant environ 1 h. Donner des doses supplémentaires d'un third de la dose initiale si nécessaire.
  4. Placez l'animal sur une couverture de chauffage réglé pour maintenir une température de 38 ± 1 ° C et de stabiliser la tête de l'animal dans un cadre stéréotaxique en utilisant deux barres d'oreilles et une barre de morsure. Veillez à ne pas percer la membrane tympanique avec les barres d'oreilles.
  5. Protéger les yeux en appliquant une goutte de gel ophtalmique.
  6. Rasez le cuir chevelu à l'aide de ciseaux et d'appliquer povidone-iode pour désinfecter la peau.
  7. L'utilisation d'un scalpel, faire une incision le long de la ligne médiane pour exposer le crâne et se rétracter le périoste couvrant le pariétal et la partie la plus rostrale des os occipital.
  8. Collez un headpost léger duralumin (poids ~ 0,65 g, longueur 30 mm, la figure 2A) avec une ronde et une base plate (5 mm de diamètre) sur le crâne. Collez un fil d'argent au milieu de la headpost laissant ses extrémités libres. Le fil d'argent sera utilisée comme l'électrode de référence pour l'enregistrement électrophysiologique.
  9. Appliquer une fine couche de light adhésif durcissable sur le crâne et la base du headpost. Attendre 10 secondes et placez le headpost sur la zone rostrale des os pariétaux, le long de la ligne médiane.
  10. Pour une force d'adhérence efficace, photopolymériser l'adhésif en utilisant une source de lumière bleue pendant 20 s.
  11. Percer trois trous autour et derrière la base du headpost en utilisant une perceuse électrique et un petit foret.
  12. Placez deux vis de la montre (~ 2 mm de longueur) dans les trous percés pour servir de points de contact supplémentaires entre le crâne et le headstage. Les vis nécessitent 1½ tours pour obtenir un ajustement serré. Testez les vis avec une pince pour vous assurer qu'ils ne sont pas desserrés.
  13. Insérez l'extrémité du fil de terre d'argent dans le troisième trou en vous assurant qu'il contacte la dure-mère. Appliquer une petite goutte d'eau cyanoacrylate résistant à la colle pour lier le fil au crâne.
  14. Appliquer composite photopolymérisable pour renforcer la liaison du headpost avec le crâne. Couvrir la base du headpost, la partie basse du fil d'argent,et les vis, en faisant attention de ne pas étendre derrière lambda, pour permettre l'accès pendant l'enregistrement. Cure en utilisant une source de lumière bleue.
  15. Rentrez le muscle à l'arrière du cou près de son insertion sur le crâne. En utilisant un petit trépan (2,35 mm de diamètre), percer une fenêtre ronde juste en dessous de lambda suture et latérale de la ligne médiane, pour exposer le colliculus inférieur (IC). Quand les frontières sont lâches, tirer vers le haut de l'os de couverture avec des pincettes fines. Si le saignement se produit, rincer avec une solution saline stérile à froid pour l'arrêter.
  16. Faire un petit (~ 1 mm de large et 1 mm de hauteur ~) mur autour de la fenêtre avec composite et lumière guérir.
  17. Couvrir le crâne exposé et musculaire avec une pommade antibiotique. Ensuite, mouiller la surface exposée de la CI avec une solution saline stérile et recouvrir avec de la gelée de pétrole, le remplissage du puits généré après avoir fait le mur autour de la fenêtre d'enregistrement.
  18. Injecter par voie sous- cutanée buprénorphine (0,03 mg / kg, après dilution 1:10 dans une solution saline stérile) comme analgésique.
  19. Gardez l'animal sur til chauffer une couverture jusqu'à ce qu'il se réveille et le retourner à sa cage de logement pour récupérer de la chirurgie pendant trois jours avant les sessions d'enregistrement. animaux maison individuel cage de logement rat's pour empêcher compagnons de cage nettoyer la gelée et la headpost touchent le couvercle métallique-grille. Mettre un peu d'enrichissement dans la cage lorsque l'animal est unique logé. Aussi, changer tous les jours de la sciure de bois pour prévenir l'infection et soigneusement vérifier que l'animal récupère correctement et ne montre aucun signe d'inconfort. Vérifiez également si la gelée de pétrole est sur la fenêtre d'enregistrement protégeant le cerveau exposé.

5. électrophysiologique Enregistrement et microiontophorèse

  1. Après la récupération, donner le temps de l'animal à acclimater à l'environnement d'enregistrement et ayant son siège retenu. Acclimate l'animal en fixant le headpost au support alors que la souris est assis sur un coussin en mousse restrainer-mesure sculpté à sa taille corporelle (figure 2B). Cette volonté limelle les mouvements de la souris et contribuera à son calme.
  2. Commencez avec 10 sessions min et augmenter progressivement la durée jusqu'à 120 min. Au cours de la session, récompenser les animaux avec des liquides sucrés (lait concentré, dilué dans de l' eau 30:70) à des intervalles donnés 33. Plus tard, au cours de la session d'enregistrement, donner la même récompense au début et à la fin de la session ou alors qu'aucun neurone est isolé.
  3. Si l'animal est très excité avant l'enregistrement, injecter le acépromazine doux sédatif (2 mg / kg, intrapéritonéale). Selon le système neuronal d'intérêt, le sédatif peut affecter vos résultats.
  4. Laissez l'animal explorer librement la chambre d'enregistrement pendant 5 - 10 min.
  5. Placez le corps de l'animal dans le restrainer rembourrée de mousse sur mesure (figure 2B).
  6. Fixer le headpost à un support fixé au cadre stéréotaxique (figure 2C). Ceci est un bon moment pour donner à l'animal une récompense liquide.
  7. Cover le corps de l'animal avec une couverture de coton et vaguement le fixer à l'aide d'un demi-cylindre en plastique et du ruban adhésif.
  8. Retirez la gelée de pétrole à partir de la fenêtre d'enregistrement et rincer à l'eau chaude salée stérile.
  9. activité neuronale enregistrement et l'application iontophorétique de gabazine.
    1. Placer l'électrode de multibarrel sur son support, commandée par un micromoteur et attaché à un micromanipulateur.
    2. Connecter les fils pour l'enregistrement, en utilisant de petites pinces crocodile. Connecter la borne positive à l'extrémité de l'électrode en tungstène et la borne de masse sur le fil d'argent en contact avec la dure-mère.
    3. Placer un fil d'argent non revêtue à l'intérieur de chaque cylindre, de sorte que l'un des contacts d'extrémité de la solution et l'autre extrémité est accessible. Branchez les extrémités du dispositif de microiontophorèse, en suivant les instructions du fabricant.
    4. Déplacer l'électrode de multibarrel jusqu'à ce que les contacts de pointe, la surface du cerveau. Appliquer une solution saline stérile chaude pour éviter le dessèchement des ee tissu cérébral. À ce moment appliquer un courant de rétention (-10 nA pour gabazine, consultez la documentation pour le médicament en particulier) pour éviter les fuites de la drogue à partir de la pointe du cylindre tout en recherchant une activité unitaire.
    5. Utiliser des techniques standard pour isoler seul neurone activité extracellulaire. Obtenir la zone de réponse en fréquence (FRA) du neurone, soit la combinaison de fréquences et d' intensités capables d'évoquer une réponse , car le neurone est sensible à ces sons 34-36.
    6. Choisissez deux fréquences (f1 et f2) qui évoquent une cadence de tir similaire et le motif. Présenter chacune de ces fréquences stimulus rare et répétitif sous le paradigme oddball.
      Note: En bref, dans le paradigme oddball, une fréquence (f1) est présenté comme le stimulus répétitif avec une probabilité d'occurrence élevée, tandis que la seconde (f2) est le stimulus déviant se produisent rarement, entrecoupés au hasard parmi ceux répétitifs. Dans une deuxième séquence excentrique, le rapportprobabilités des deux stimuli sont inversés. Détails du paradigme de stimulation ont été décrites précédemment 22,37.
    7. Relâchez le gabazine en déplaçant le courant à des valeurs positives (10 - 20 nA). Obtenir à nouveau la FRA et répéter le paradigme oddball sous l'application de gabazine. Maintenir l'éjection jusqu'à ce qu'un effet visible dans la cadence de tir est observé; il faut généralement 5 à 20 minutes, en fonction du médicament particulier, de sa concentration et l'intensité du courant d'éjection. Répéter le protocole d'enregistrement pour obtenir les valeurs sous l'effet du médicament.
    8. Arrêtez l'injection en retournant le courant à des valeurs de rétention. Attendez que l'effet de la drogue pour se laver en surveillant que la FRA ou de la réponse au paradigme oddball retourne aux valeurs témoins.
      Remarque: Les sessions d'enregistrement peuvent durer 2 - 3 heures par jour, et devrait être terminée plus tôt si l'animal présente des signes d'inconfort ou de difficulté. Donnez liquide de récompense et de couvrir le ch d'enregistrementambre avec de la vaseline.

Analyse 6. Données

  1. Mesurer la FRA avant et pendant l'injection de gabazine ainsi que le niveau de l'Afrique subsaharienne.
  2. Quantifier la force de la réponse SSA par l'indice commun SSA (CSI) et l'indice SSA fréquence spécifique (SI) comme décrit précédemment 19,22,23,38,39. L'ICS et SI correspondent à la différence normalisée entre la réponse neuronale au stimulus rare et la réponse à l'une répétitive. Les valeurs CSI et SI positives indiquent la réponse neurale (pointes par stimulus) était plus élevé à rare que de tons répétitifs.
  3. Comparer les données de l'état de la commande et de la drogue éjection.

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Résultats

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Nous avons enregistré l'activité d'une seule unité de 4 neurones bien isolées de l'IC. Le rapport signal à bruit typiques obtenues lors des enregistrements extracellulaires chez les souris éveillés sont représentés sur la figure 3B. La figure 4A montre la zone de réponse en fréquence (FRA) de chaque neurone avant et pendant le blocage du récepteur GABA A gabazine avec les récepteurs. Un incrément dans la force de réaction (pics / d...

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Discussion

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La microiontophorèse des substances neuroactifs chez les animaux éveillés est une technique puissante pour sonder et de disséquer le rôle des entrées synaptiques spécifiques sur l'activité des neurones isolés 40,41. Plus important encore, cette procédure permet de déterminer l'impact des neurotransmetteurs et neuromodulateurs sur les circuits neuronaux sans l'interférence potentielle des anesthésiques. Ici, nous démontrons que l'application de gabazine dans le IC de souris éveillée robuste cha...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce projet a été financé par le MINECO accorde BFU201343608-P et PSI2013-49348-EXP, et la subvention SA343U14 JCYL au financement MSM et MRC noyau pour ARP. YAA a tenu une CONACyT (216106) et une bourse septembre

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fil de tungstèneHarvard Apparatus LTD33-00990,005 pouces x 3 pouces
Capillaire en verre borosilicaté  ;Harvard Apparatus LTD30-0053Paroi standard en borosilicate sans filament, 1,5 mm de diamètre extérieur, 0,86 mm de diamètre intérieur, 100 mm de long
Capillaires en verre multibarils  ;World Precision Instruments5B120F-4  ;Capillaire à 5 cylindres, 4 pouces de long, 1,2 mm de diamètre extérieur, avec filament
DiaplusDiaDent2001-2101Adhésif photopolymérisable, utilisé pour fixer l’électrode de tungstène à la pipette multi-barils en verre
G-BondGC Corporation2277Adhésif photopolymérisable, utilisé pour fixer le poteau de tête au crâne de l’animal
CharismaHeraeus Kulzer66000087Composite photopolymérisable, utilisé pour renforcer la liaison du pivot de tête avec le crâne
Araldit CristalÉpoxy Ceysà 2 composants, utilisé pour sécuriser davantage la fixation de l’électrode de tungstène à la pipette multi-barils en verre
Couverture chauffanteCibertecRTC1
Cadre stéréotaxiqueNarishigeSR-6NModifié pour souris
Dispositif microiontophorétiqueHarvard Apparatus LTDNeurophore BH-2Y compris les pompes d’ionophorèse IP-2 (une pour chaque canal d’administration de médicament) et un module d’équilibre
Extracteur de pipette en verre multibarilNarishigeModèle PE-21
Lampe LEDTechnofluxCV-2155 W, 430-485 nm
MicroFilWorld Precision InstrumentsMF34G-5Aiguille en plastique flexible, 34 AWG
ImalgeneMerialKétamine, 100 mg/mL
RompunBayerXylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531SigmaS106Préparer ~ 1000µ ; l de 20 mM de gabazine dans de l’eau distillée et ajuster le pH à 4

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Effects and mechanisms of wakefulness on local cortical networks. Neuron. 69 (6), 1061-1068 (2011).
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