Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Résumé

La plupart des infections bactériennes produisent un biofilm. En raison de leur environnement, les bactéries associées au biofilm sont souvent phénotypiquement résistantes aux médicaments. Les nouvelles molécules antibactériennes qui tuent les bactéries dans les biofilms sont donc une priorité élevée. Nous établissons un test pour dépister rapidement les composés antimicrobiens efficaces pour éradiquer les biofilms.

Résumé

La plupart des bactéries pathogènes sont capables de former des biofilms pendant l’infection, mais en raison de la difficulté de manipuler et d’évaluer les biofilms, la grande majorité des travaux de laboratoire sont effectués avec des cellules planctoniques. Ici, nous décrivons un test de biofilm sur plaque cheville tel qu’il a été réalisé avec Staphylococcus aureus. Les biofilms bactériens sont cultivés sur des chevilles fixées à un couvercle de plaque de microtitration de 96 puits, lavés par immersion douce dans un tampon et placés dans une plaque de provocation médicamenteuse. Après l’incubation subséquente, ils sont à nouveau lavés et déplacés vers une plaque de récupération finale, dans laquelle le colorant fluorescent resazurin sert d’indicateur de viabilité. Ce test offre une facilité d’utilisation, une fiabilité et une reproductibilité considérablement accrues, ainsi qu’une multitude de données lorsqu’il est effectué sous forme de lecture cinétique. De plus, ce test peut être adapté à une approche de criblage de médicaments à moyen débit par laquelle une lecture fluorescente du point final est prise à la place, offrant ainsi une voie pour les efforts de découverte de médicaments.

Introduction

Microbes pathogènes peuvent former des biofilms in vivo conduisant à des infections chroniques non actifs ^1. L' infection par le biofilm associé est un facteur de risque grave de procédures médicales qui impliquent l' implantation d'objets étrangers (par exemple, le remplacement des os artificiels, des implants mammaires) ou l'installation des tubes trachéaux ou cathéters urinaires ^2. Dans ces contextes, le traitement anti-infectieux est presque toujours nécessaire que les infections à base de biofilm sont rarement effacés sur leur propre, même chez les personnes immunocompétentes. Staphylococcus aureus est l' un des agents pathogènes les plus fréquemment observés impliqués dans les complications liées à biofilm qui se produisent lors de l'utilisation de dispositifs médicaux invasifs ^3.

Malheureusement, la nature même de biofilms comme une barrière protectrice qui les rend plus résistantes au traitement que les cellules planctoniques ^1,4, et l' évaluation de l' efficacité clinique prédit est un élément essentiel à la fois initialele développement de médicaments, ainsi que la surveillance de la résistance aux médicaments. Il est de plus en plus reconnu que les conditions de laboratoire, axées sur les cultures planctoniques, peuvent ne pas représenter fidèlement la maladie dans le monde réel ^5. Aggravant encore le problème, la réplication des phénotypes biofilm est difficile, et les modèles de biofilm existants sont fastidieux et souffrent de haute inter et intra-essai variabilité ^6. Ainsi, de nombreux chercheurs, par nécessité, par défaut aux dosages cellulaires planctoniques de sensibilité aux médicaments, ce qui pourrait négliger un aspect important de la virulence bactérienne et la maladie.

Nous décrivons ici le protocole de dosage de bactéries, en particulier S. aureus, dans les biofilms pré-cultivés en utilisant une base de ^7,8 à 96 puits de système de biofilm. Bien que le protocole pour la formation de biofilm et de défi suit essentiellement la recommandation du fabricant, nous présentons une méthodologie riche en information alternative pour quantifier la viabilité du bioFilm après la provocation. En bref, les bactéries sont mises en culture dans la plaque de cheville, où les biofilms se forment sur les pions en saillie fixés au couvercle de la plaque. Après la formation du biofilm, les ergots sont légèrement trempées dans le puits d'une plaque fraîche rempli avec du PBS pour éliminer les cellules planctoniques. Le peg-couvercle, avec biofilms attachés, est transféré à une nouvelle plaque de défi, contenant diverses concentrations d'antibiotiques à doser. Après une seconde incubation, les couvercles sont de nouveau retirées, lavées et transférées à une plaque de recouvrement contenant un colorant résazurine, où ils sont soumis à une incubation finale. la conversion résazurine peut être enregistré cinétiquement ou pris comme une lecture du point final après une période de récupération définie. Cette méthode de quantification de la viabilité des biofilms à base de colorant diffère considérablement des UFC (unités formant colonies) fastidieuses méthodologie basée-count décrit dans le protocole original ^7. OD ₆₀₀ mesures de la plaque de défi de la drogue et la résazurine cinétique de conversion servent de viabilité de lectureouts de planctoniques et biofilm cellules, respectivement, offrant une information riche et techniquement simple test rapide, fiable, pour la survie de biofilm.

Protocole

1. biofilm Initiation

1. Cultiver une culture de biofilm organisme produisant dans un milieu riche en nutriments. Inoculer Staphylococcus aureus souche Newman dans 10 ml de milieu Mueller-Hinton à partir d' un stock de glycérol. Effectuer tous les travaux impliquant la manipulation de S. aureus avec des gants et dans une enceinte de biosécurité.
2. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C sur un agitateur rotatif (100-200 rpm).
3. Déterminer la DO ₆₀₀ de la culture en utilisant un spectrophotomètre et d' une cuvette standard (longueur de trajet: 1 cm).
4. Calculer le volume (V) de la culture nécessaire pour préparer 20 ml d'inoculum avec OD _{600 (inoculum)} de 0,1 à chelexed médias Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) ⁹ en utilisant la formule: [V = 20 ml * 0,1 / OD _{600 (culture )]}
   Remarque: La référence 9 fournit des détails sur la préparation cRPMI.
   1. Ajouter le volume calculé de culture (ci-dessus) dans un tube de centrifugeuse et un culot de cellules par centrifugation pendant 1 min à 10 000 x g. Pour prepare biofilm inoculum, aspirer le milieu de culture et remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml passé cRPMI.
5. Verser inoculum dans un réservoir de 25 ml.
6. Retirez délicatement le couvercle d'une plaque de cheville 96 puits stérile en le tirant vers le haut.
   Remarque: Il faut prendre soin de ne pas contaminer les chevilles qui pendent du couvercle. Le couvercle peut être placé à l'envers sur une surface propre au sein d'une enceinte de sécurité biologique.
7. En utilisant une pipette multi-canal de 200 pi, ajouter 125 inoculum ul à chaque puits de lignes A à G de la plaque inférieure.
8. Remplissez moyen cRPMI 125 ul stérile dans chaque puits de la rangée H comme un contrôle de stérilité.
9. Prenez le peg-couvercle et le maintenir au-dessus du fond de la plaque avec les chevilles vers le bas. Alignez soigneusement les piquets individuels avec leurs puits respectifs. Éviter tout contact physique entre la plaque et les chevilles. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle vers le bas. Évitez les désalignements comme réajustements effectués après les chevilles ont touché la plaque de fond peut contcontrôles de stérilité aminer dans la rangée H.
10. Sceller le couvercle à la plaque avec un film de paraffine pour éviter l'évaporation et le placer dans un sac en plastique refermable, scellant hermétiquement. Gardez le volume d'air dans le sac aussi bas que possible pour minimiser l'évaporation.
11. Incuber sans agitation à 37 ° C pendant 48 heures dans un incubateur à CO ₂ de 5%.
    Note: 48 h de croissance a été optimale pour S. aureus, mais varieront en fonction de l'organisme utilisé.
    Remarque: Bien que l' incubation statique est un bon point de départ pour optimiser le dosage, en secouant doucement à 150 rpm sur un agitateur de microplaques est une variante possible qui peut améliorer la formation de biofilm de certains S. aureus.

2. Préparation de la plaque biofilm Défi

1. Le jour du défi de biofilm prendre une plaque de 96 puits fraîche et ajouter 100 pi de cRPMI, équilibrées à la température ambiante, à chaque puits de lignes B à H. Pour éviter des résultats incohérents, utiliser une plaque de 96 puits qui peut contenir 200 pides supports lorsque les pions sont à l'intérieur, et comporte des puits ayant des dimensions identiques à celles de la plaque biofilm d'initiation.
2. Diluer jusqu'à 4 composés testés séparément dans 1,0 ml de cRPMI à 2 x la concentration finale désirée, afin de tenir compte de la dilution finale dans l'étape 2.7.
   Note: Un bon point de départ est 8 fois supérieure à la concentration inhibitrice des cellules planctoniques.
3. Ajouter 200 pi de composé 1 dans le puits A1 à A3, le composé 2 dans les puits A4 à A6, composé 3 dans les puits A7 à A9 et composé 4 dans les puits A10 à A12.
4. En série diluer les composés d'essai à l'aide d'une pipette multicanaux et transférer 100 pi de la ligne A à la ligne B et mélanger.
5. De cette manière, continuer à transférer 100 ul puits à puits. Mélanger après chaque transfert et arrêter la ligne F.
6. Après le mélange, expulser 100 pi de la ligne F dans un conteneur de déchets. Ne pas transférer tout liquide aux lignes G et H.
7. Ajouter 100 ul de cRPMI à chaque puits de la plaque à l'aide d'une pipette multicanaux pouramener le volume à 200 ul. Voir la Figure 1 pour mise en page finale de la plaque.

3. biofilm Défi

1. Ajouter 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) à une plaque de 96 puits stérile fraîche qui comporte des puits ayant des dimensions identiques à celles de la plaque biofilm d'initiation.
2. Retirez le sac en plastique et un film de paraffine de incubé plaque biofilm d'initiation.
3. Soulevez le couvercle vers le haut. Éviter tout contact entre les piquets et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Gardez partie inférieure pour la suite OD ₆₀₀ analyse (voir 3.8).
4. Rincez les cellules planctoniques en plaçant le peg-couvercle sur la plaque contenant du PBS (de l'étape 3.1). Immerger chevilles pendant 5 secondes, sortir de la PBS, et submergez une fois de plus, en faisant attention de ne pas frapper les chevilles contre les côtés du puits.
5. Placez le peg-couvercle rincés dans la plaque de défi. Évitez tout contact inutile entre les piquets et plaque de fond, car cela endommagerait le biofilm conduisant àdes résultats incohérents.
6. plaque d'étanchéité avec un film de paraffine et placer dans un sac en plastique refermable comme décrit à l'étape 1.10.
7. Incuber la plaque sans agitation pendant 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5%.
8. Prendre en bas de la plaque biofilm d'initiation de 3,3. Resuspendre les bactéries dans chaque puits à l' aide d' une pipette multicanaux et mesurer la DO ₆₀₀ avec un lecteur de microplaque approprié pour confirmer la croissance se produisant dans tous les puits , mais les contrôles de stérilité dans la rangée H.

4. biofilm Détermination

1. Utiliser un lecteur de plaque muni d'une chambre d'incubation et capable d'effectuer des mesures de fluorescence pour détecter la cinétique de conversion résazurine. Mettre en place une cinétique mesure de fluorescence 24 heures en utilisant une excitation de 530 nm et 590 nm émission.
2. Réglez la température de la chambre à 37 ° C et la plaque ont lu toutes les 20 min. Configurer le lecteur de plaque à mesurer à partir du fond de la plaque selon le constructeur instructions.
3. Préparer la plaque de lavage en ajoutant 200 pi de PBS avec une pipette multicanaux à une plaque de 96 puits stérile.
4. Préparer le milieu de récupération de biofilm par addition de 400 ul de 0,8 mg / ml de résazurine solution mère à 20 ml de milieu cRPMI à une concentration finale de 16 pg / ml de résazurine.
   Note: résazurine est un irritant connu de la peau. Utilisez un sarrau de laboratoire, des lunettes de protection et des gants lors de la manipulation. CRPMI que les médias de récupération de biofilm a été utilisé car il fournit le signal de fond le plus bas, mais il peut être remplacé par les médias Mueller Hinton, le cas échéant.
5. Ajouter 150 ul de milieu de récupération de biofilm avec une pipette multicanaux à chaque puits d'une plaque à 96 puits fraîche.
6. Transfert de plaque de défi de l'incubateur dans une enceinte de sécurité biologique et retirez soigneusement le sac en plastique et le film d'étanchéité.
7. Retirez le peg-couvercle de la plaque de défi et rincer les cellules planctoniques dans du PBS comme décrit dans 3.4. Gardez le fond de la plaque de défi pour OD ultérieure ₆₀₀ analyse (voir 4.10).
8. Après rinçage, placer la cheville couvercle dans la partie inférieure de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm.
9. Envelopper le côté de la plaque avec un film de paraffine, en faisant attention à ne pas obstruer le fond des puits de périmètre. Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-le sur le lecteur de plaque et de commencer une lecture cinétique sur une période de 24 heures en lançant précédemment fait résazurine protocole cinétique de l'étape 4.1.
10. Pour quantifier la croissance des cellules planctoniques qui peuvent ou peuvent ne pas se produire pendant défi, lisez la DO ₆₀₀ de l'ensemble du fond de la plaque de défi en utilisant un lecteur de plaque micro. Suivez les instructions données à l'étape 3.8.
    Remarque: mélanger soigneusement le contenu de chaque puits comme cellules excrétion hors du biofilm ont tendance à croître dans les touffes au fond du puits. Les bulles dans le puits vont fortement interférer avec OD ₆₀₀ lectures et doivent être évités ou supprimés avant la lecture.

Résultats

Le dosage de la résazurine est suffisamment sensible pour détecter de manière fiable très peu de cellules viables capables de se répliquer dans un milieu exempt de drogue après la provocation. Dans cette méthodologie, nous définissons le biofilm l'éradication de concentration minimale que la plus faible concentration à laquelle aucune conversion de résazurine est vu dans les 24 heures. Le dosage de la résazurine repose sur des molécules oxydantes présentes dans des cellules métaboliq...

Discussion

Ici, nous avons décrit un dosage de biofilm modifié pour déterminer l' activité d'inhibiteurs testés sur S. biofilms aureus mettant l' accent sur ​​l'état métabolique des cellules de biofilm associé. Alors que l'initiation de biofilm décrit et procédures de contestation des recommandations du fabricant principalement simulées, l'utilisation de résazurine colorant pour détecter et quantifier les cellules associées à un biofilm qui survivent un défi inhibiteur 24 h simplifie consi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Suivre les recommandations du fabricant
RPMI-medium	Corning  ;	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chélexé pendant 1 h avec de la résine Chelex 100 puis complété par 10 % de résine non chelexée RPMI-1640
Chelex 100 Bio	Rad	142-2822
MBEC-plaques	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800 µ ; g/ml dans de l’eau DI  ;   ;   ;   ; Filtre stérile
Micro Plate Shakeking Platform  ;	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Lecteur de plaques	Logiciel Biotek
Gen5	Biotek		Enregistrement et analyse de la conversion de la résine
Neocuproine	Sigma	N1501  ;	préparer un stock de 10 mM dans 100 % d’éthanol, stocker à -80 º ; C
Sulfate	de cuivre Acros Organics	7758-99-8	préparer une solution mère de 100 mM dans l’eau, stocker à 4 º ; C
Cu-Neocuproine	Self-Made		Généré en mélangeant des molarités égales de néoculproine et de sulfate de cuivre. Le mélange a été dilué dans un milieu CRPMI jusqu’à la concentration désirée.
Gentamicine	Sigma	G3632-1G