Article de méthode

Procédure pour évaluer l'efficacité de floculants pour l'élimination des particules dispersées dans des extraits de plantes

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DOI :

10.3791/53940

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9 avril 2016

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

Dans cet article

Résumé

La procédure de plan d’expériences présentée ici permet d’évaluer différents floculants en fonction de leur capacité à agréger des particules dispersées dans des extraits de plantes, réduisant ainsi la turbidité et les coûts de traitement en aval.

Résumé

Les plantes sont importantes pour l’homme non seulement parce qu’elles fournissent des produits de base tels que des denrées alimentaires, des aliments pour animaux et des matières premières, mais aussi parce qu’elles peuvent être utilisées comme plateformes de fabrication de produits à valeur ajoutée tels que les produits biopharmaceutiques. Dans les deux cas, il peut être nécessaire de clarifier les extraits liquides de plantes pour éliminer les particules. Une clarification optimale réduit les coûts de filtration et de centrifugation en augmentant la capacité et la longévité. Cela peut être réalisé en introduisant des polymères chargés connus sous le nom de floculants, qui réticulent les particules dispersées pour faciliter la séparation solide-liquide. Il n’existe pas de modèles de floculation mécaniste pour des mélanges complexes tels que les extraits de plantes, c’est pourquoi des modèles empiriques sont utilisés à la place. Ici, une procédure de plan d’expériences est décrite qui permet le criblage rapide de différents floculants, optimisant la clarification des extraits de plantes et réduisant considérablement la turbidité. Les modèles prédictifs qui en résultent permettent d’identifier des conditions de processus robustes et des ensembles de polymères aux propriétés complémentaires, par exemple la floculation efficace dans les extraits à conductivités spécifiques. Les résultats présentés pour les extraits de feuilles de tabac peuvent facilement être adaptés à d’autres espèces ou tissus végétaux et faciliteront ainsi le développement de procédés en aval plus rentables pour les produits de base et les produits pharmaceutiques d’origine végétale.

Introduction

Les plantes sont largement utilisées pour produire des produits alimentaires tels que les jus de fruits, mais ils peuvent aussi être développés comme des plates - formes pour la fabrication de plus forte valeur ajoutée des produits biopharmaceutiques 1-3. Dans les deux cas, le traitement en aval (DSP) commence souvent par l'extraction de liquides à partir de tissus tels que les feuilles ou les fruits, suivie par la clarification des extraits chargés de particules de 4,5. Pour la fabrication de produits biopharmaceutiques, les coûts de DSP peuvent représenter jusqu'à 80% des coûts de production globaux 6,7 et cela reflète en partie la forte charge des particules présentes dans des extraits préparés par des méthodes perturbatrices telles que l' homogénéisation à base de lame 8,9 . Bien que la sélection rationnelle des couches de filtre pour correspondre à la distribution des tailles de particules dans l'extrait peut augmenter la capacité de filtrage et de réduire les coûts 10,11, l'amélioration ne peut jamais dépasser la limite de capacité absolue définie par le nombre de particules qui doivent être retenues parunité de surface de filtre pour obtenir des éclaircissements.

Le plafond peut être levée si moins de particules atteignent la surface des meilleurs filtres dans le train de filtration, et ceci peut être réalisé que si les particules dispersées sont mélangées avec des polymères connus comme agents floculants qui favorisent l' agrégation pour former de grands floculats 12. Ces flocs peuvent être conservés plus en amont par des filtres grossiers et moins coûteux sac, ce qui réduit la charge de particules atteignant la plus fine et les filtres de profondeur plus chers. Les polymères doivent avoir des profils de sécurité adaptés à leurs applications, par exemple pour les produits biopharmaceutiques , ils doivent être conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), et généralement , ils doivent avoir une masse molaire> 100 kDa et peut être soit neutre ou chargé 13. Considérant que floculants neutres agissent généralement par réticulation des particules dispersées provoquant leur agrégation et la formation de flocs avec des diamètres> 1 mm 11, des polymères chargés de neutraliser la charge de dparticules ispersed, réduisant leur solubilité et provoquant ainsi la précipitation 14.

La floculation peut être améliorée en ajustant des paramètres tels que le pH du tampon ou de la conductivité et du type de polymère ou de concentration, en fonction des propriétés de l'extrait 15,16. Pour les extraits de tabac prétraités avec 0,5-5,0 g L -1 polyéthylènimine (PEI), une augmentation de plus de 2 fois la capacité de filtration en profondeur a été rapporté dans un processus à l' échelle pilote 100-L. Le coût de ce polymère est inférieure à 10 € kg -1 de sorte que son introduction dans le processus ont entraîné des économies de coûts d'environ € 6.000 pour les filtres et consommables par lot 16 ou encore plus lorsqu'il est combiné avec base de cellulose filtre aides 17. Même ainsi, les modèles prédictifs sont nécessaires pour évaluer les a priori des avantages économiques de floculants parce que leur inclusion peut nécessiter des étapes de maintien de 15-30 min 16,18, ce qui entraîne des coûts supplémentaires d'investissement pour le stockageles chars. Cependant, il n'y a pas de modèles mécanistes disponibles qui peuvent prédire les résultats de ces expériences en raison de la nature complexe de la floculation. Par conséquent, une expérience de conception de-plus appropriés (DoE) approche 19 a été développé comme décrit dans cet article. Un protocole pour la procédure générale DoE a récemment été publiée 20.

Dispositifs à petite échelle sont maintenant disponibles pour le criblage à haut débit des conditions de floculation 21. Toutefois, ces dispositifs ne peuvent pas simuler de façon réaliste les conditions au cours de la floculation des extraits de plantes, car les dimensions du récipient de réaction (~ 7 mm pour les puits sur une plaque à 96 puits) et les particules ou flocs peuvent être inférieur à un ordre de grandeur d'intervalle. Cela peut affecter le mélange des modèles et donc la puissance prédictive du modèle. En outre, il peut être difficile de réduire les processus impliquant la précipitation en raison de changements non linéaires dans la conduite de mélange et le précipité stabilité 22. Par conséquent, cet article décrit un système de criblage paillasse échelle avec un débit de 50-75 échantillons par jour, ce qui donne des résultats qui sont évolutives à partir du volume de réaction de 20 ml initiale à un processus à l'échelle pilote 100 L 16. Lorsqu'il est combiné avec une approche DoE, ce qui permet aux modèles prédictifs pour être utilisés pour l'optimisation des processus et de la documentation dans le cadre d'un concept de qualité par la conception.

La méthode décrite ci - dessous peut également être adapté aux produits biopharmaceutiques produites dans des procédés à base de culture cellulaire, où les floculants sont également considérés comme un outil de réduction des coûts 23. Il peut également être utilisé pour modéliser la précipitation des protéines cibles à partir d' un extrait brut dans le cadre d'une stratégie de purification, comme l'a démontré pour la β-glucuronidase produite dans le canola, le maïs et le soja 24,25. Une description détaillée des propriétés de floculant peut se trouver ailleurs 16,26 et il est important de veiller à ce que le polymère concentrations sont soit non toxique ou au- dessous des niveaux nocifs dans le produit final 11.

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Protocole

1. Élaborer une stratégie expérimentale adéquate

  1. Identifier les paramètres environnementaux et de processus qui sont pertinentes pour la procédure de floculation à établir ou optimisé, à savoir quels facteurs ont le plus d' effet sur ​​la floculation. En règle générale, il existe plusieurs paramètres pour une approche DoE comme récemment décrit 20 est nécessaire en raison de l'absence de modèles mécanistes.
    1. Sélectionnez les paramètres (facteurs) sur la base de données de la littérature, 12 connaissance préalable et de l' expérience avec le système. Les facteurs typiques comprennent un tampon pH, la conductivité du tampon, le temps d'incubation et de la température ainsi que le type de polymère et la concentration 15,16,27.
    2. Utilisez les mêmes références (voir 1.1) pour définir des plages significatives pour chaque facteur numérique et les niveaux des facteurs catégoriques.
    3. Définir les résultats expérimentaux (réponses) à surveiller et utilisés pour évaluer l'efficacité de la floculation. Selon le système, cepeut être la turbidité du filtrat ou du surnageant, la vitesse de décantation, la taille des agrégats ou la capacité d'un filtre ultérieur 16,23,28-30.
    4. Vérifiez que les tests utilisés pour mesurer les réponses sont quantitatives, robuste et reproductible / reproductible de sorte que les données de haute qualité qui en résultent peuvent être complétées par des expériences réalisées plus tard, ou par un autre opérateur.
  2. Choisissez un type DoE convenant le nombre de facteurs à étudier et le degré de connaissances déjà accumulées sur le système. Utilisez la littérature disponible pour identifier un type de 20 appropriée DoE.
    1. Choisissez un modèle de dépistage s'il y a peu d'informations sur le système de floculation à étudier, un grand nombre de paramètres doit être projeté ou peu est connu sur les plages significatives pour les paramètres. conceptions de dépistage typiques sont les plans factoriels complets et fractionnaires. Inclure des points centraux dans la conception si les paramètres sont censés avoir un impact non linéaire, par exemple Saturation au- dessus d' un certain seuil 19.
    2. Sélectionnez une méthodologie de surface de réponse (RSM), par exemple le centre de conception composite (CCD) 31 ou optimale 32,33, si seulement quelques facteurs avec des gammes bien connues doivent être caractérisés avec précision.
  3. Mettre en place le DoE avec un logiciel approprié, en veillant à un critère de qualité a priori tels que la fraction de l' espace de conception sont remplies 20.

2. Préparer les expériences floculation

figure-protocol-1
Figure 1: échelle du procédé ( à gauche) et à l' échelle de paillasse ( à droite): flux de production extrait floculation usine. Après l'extraction de protéines avec des tampons aqueux, des particules dispersées de débris cellulaires sont regroupées par l'addition de floculants. Les agrégats sont ensuite éliminés par une cascade de sac et la filtration en profondeur et la capacité de ceux-cifiltres ainsi que les turbidités de filtrat peuvent être utilisés directement pour mesurer l'efficacité de la floculation.

  1. Développer un expérimental général de flux de travail (Figure 1).
    1. Utiliser un dispositif d'extraction qui aboutit à la même distribution de taille de particule attendue (ou déjà observé) à l'échelle de l' application finale, par exemple un homogénéiseur spécialisé. Si possible, la conception d' un modèle à échelle réduite de l'extracteur de la manière décrite pour l'homogénéisation de feuilles de tabac 10.
    2. Définir les volumes d'extraction utilisés lors des expériences de floculation (ici 20 ml). Sélectionner un volume qui permet un nombre représentatif de particules soit présente dans le récipient de réaction, par exemple , des expériences de floculation dans aliquotes de 20 ml ont donné des résultats reproductibles et adaptables pour les extraits de tabac contenant environ 7% [w / v] solides 34 et des tailles de particules de ~ 0,5 um à 3 mm ~ 16.
    3. Concevoir toutes les opérations de surveillance et de post-floculation de telle sorte que eey sont représentatifs de l'échelle de l' application finale, par exemple sélectionner des filtres avec le même comportement de rétention de particules que celles utilisées à l'échelle de production.
  2. Cultiver les plantes dont les extraits seront dérivés.
    1. Utilisez la même ligne de plante, ici Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, et les conditions de culture qui seront utilisés lors de la production , comme décrit précédemment 33.
    2. Si d' autres stocks d'alimentation seront traitées, la préparation de ces stocks d'aliments pour animaux afin qu'ils soient représentatifs de l'échelle de l' application finale, par exemple utiliser des tampons authentiques, prendre en compte toutes les étapes de dilution au cours du processus et le bâton du pH et de la conductivité prévue, ici pH 7,5 et conductivité 30 mS cm -1.
  3. Préparer Filtration Utilities, Dispositifs de turbidité-Surveillance et récipients d'échantillonnage.
    1. Couper les matériaux filtrants aux dimensions requises, ici 15 x 15 cm 2, si elles ne sont pas prêts à nousmodules e. Vérifiez que tous les dispositifs de surveillance et d'analyse sont fonctionnels et étiqueter tous les tubes d'échantillons.
    2. Même si ce sont des tâches simples, préparer ces articles à temps pour veiller à ce qu'ils ne seront pas provoquer des interruptions pendant les expériences de floculation réelles. Évitez les retards, car ils peuvent interférer avec les résultats, étant donné que la floculation est un processus dépendant du temps.
  4. Préparer Flocculant Solutions mères. ATTENTION: Porter un équipement de protection individuelle approprié lors de la manipulation des floculants, par exemple des gants. Les matériaux peuvent être dangereuses (étiquettes de danger selon l'Europe UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE comprennent N, Xi ou Xn). Évitez la poussière et consulter les fiches de données de sécurité. Travailler sous une hotte.
    1. Choisissez une concentration de stock pour chaque floculant, ici 80,0 g L -1 pour les deux floculants PEI qui ont été utilisés. Sélectionnez des concentrations aussi élevées que possible pour éviter la dilution des échantillons lors de l'ajout du floculant, ce qui réduirait concentra de particulestion et affectent ainsi l'efficacité floculation.
    2. Compte pour toute pré-dilution qui reflète la formulation du polymère du fabricant, par exemple si le polymère est déjà fourni en solution aqueuse à 50% [p / v] solution. solutions mères floculant de 4-8% [p / v] se sont révélés être le plus approprié à ce jour.
    3. Ayant à l'esprit les points évoqués ci-dessus, assurez-vous que la concentration de floculant ne génère pas une solution très visqueuse qui inhibe pipetage, causant potentiellement des erreurs parce que la concentration de floculant finale ne soit pas réglé correctement.
    4. Utilisez la même concentration en stock pour tous les floculants, si possible, parce que cela va faciliter la mise en place d'un système de pipetage (2,5), réduisant ainsi la probabilité d'erreurs.
    5. Ajuster le pH et la conductivité de chaque solution mère floculant pour correspondre aux conditions des extraits, ici pH 4-10 et 15-55 conductivité mS cm -1. Préparer des actions individuelles pour un seul floculant si mle minerai d'un ensemble de pH et / ou de conductivité conditions est testé pour ce polymère.
    6. Préparer des solutions de floculants fraîchement, pas plus de 48 h avant utilisation. Même si la floculation peut être induite avec des stocks de polymère stockées pendant plus de 4 semaines, l'efficacité peut diminuer en raison de l'hydrolyse du polymère à des valeurs élevées ou faibles pH. Consultez la documentation du fabricant pour plus de détails.
    7. Assurez - vous que les paramètres sélectionnés pour le DoE peuvent être ajustés avec précision pour chaque échantillon au cours de l'expérience, par exemple , assurer qu'il ya des bains de chauffage / refroidissement disponibles pour ajuster les températures d'incubation, ici 4 ° C, 20 ° C et 37 ° C. Si le mélange pendant la floculation fait partie de l'expérience, veiller à ce que le dispositif de mélange est représentatif de l'échelle de l'application finale en termes de paramètres critiques tels que l'entrée d'alimentation.
  5. Convertir le DoE annexe dans un schéma de pipetage.
    1. Convertir les différentes concentrations de floculants pour être tested en volumes de solution de réserve qui seront ajoutés aux échantillons d'extrait: diviser les concentrations de floculants finales par la concentration des stocks et multiplier par le volume d'échantillon utilisé dans les expériences de floculation. Identifier le plus grand volume final résultant, par exemple , si 20 ml d'échantillon est mélangé avec un maximum de 2 ml floculant solution mère ce sera 22 ml.
    2. Calculer les volumes de tampon nécessaire pour maintenir le même volume final dans tous les aliquotes de floculation sur la base du plus grand volume de floculant actions à ajouter, par exemple si 0,75 ml de stock floculant doit être ajouté à un échantillon , puis 1,25 ml de tampon est nécessaire pour maintenir la volume final de l'échantillon de 22 ml (2.5.1).
    3. Résumez les volumes de solution mère floculant pour chaque condition de polymère et la floculation pour calculer les volumes absolus de solution stock qui sont nécessaires pour le DoE.
  6. Récolte des feuilles de tabac et préparer l'extrait.
    1. Retirer les six premiers leafs (ou le plus grand nombre , comme indiqué par les instructions de process) à partir de plants de tabac d'un âge approprié, par exemple l' âge de 6 semaines, et le transfert à un dispositif d'extraction approprié , tel qu'un homogénéisateur ou presse à vis.
    2. Ajouter trois volumes de tampon d'extraction par gramme de biomasse, par exemple 300 ml pour 100 g, et mélanger pendant 8 min.
    3. Préparer des extraits individuels avec les tampons appropriés, si le pH et / ou des conductivités différentes sont testées. Ici, cela implique l' homogénéisation du matériel végétal pour 3 x 30 sec dans un mélangeur ou un pressoir 34.
    4. En variante, la préparation de l'extrait d'une manière qui est représentative du procédé objet de l'enquête.
  7. Aliquoter l'extrait et Ajouter de la mémoire tampon.
    1. Agiter manuellement et soigneusement l'extrait pendant toute la procédure pour garantir que les échantillons sont homogènes avec une répartition uniforme des particules.
    2. Distribuer avec précision l'extrait parmi les tubes de réaction de pré-marqués décante,ici 20 ml dans chaque récipient. Autoportant tubes de 50 ml de simplifier la manipulation et sont idéales pour 20 ml d'échantillons.
    3. Ajouter le volume de chaque tampon d'extraction nécessaire pour maintenir le volume final fixé pour chaque tube de réaction individuelle à l'aide d'une pipette appropriée.

3. floculer les extraits de plantes avec différents polymères

  1. Pipeter le volume requis de solution stock floculant, ici 0,1-2,0 ml, aux échantillons séquentiellement comme indiqué par l'ordre d'exécution aléatoire du DoE. Bien mélanger chaque échantillon immédiatement après l'addition de floculant par une intense agitation pendant manuel précisément 20 sec.
    1. Si nécessaire, ajuster la durée d'agitation pour d'autres stocks d'alimentation pour assurer un mélange complet, mais veiller strictement des temps de mélange uniformes pour tous les échantillons. Gardez à l'esprit que le mélange prolongé peut provoquer la rupture irréversible des flocs et incohérente force appliquée pendant l'agitation peut fausser les résultats de floculation.
  2. Facultatif: Modifiez la procédure décrite ci-dessus pour l'application simultanée de deux ou plusieurs floculants.
    1. Option 1: au lieu d'un seul polymère ajouter un mélange de deux ou plusieurs floculants, ici PEI et le chitosan. Utilisez les combinaisons de floculants définies dans le DoE. Incorporer le rapport et les concentrations absolues des polymères en tant que paramètres individuels lors de la configuration DoE (1.1).
    2. Option 2: ajouter deux ou plusieurs polymères séquentiellement à l'extrait.
      1. Utiliser les concentrations individuelles de polymère, leur type et le temps d'incubation entre chaque addition de l'extrait, en tant que facteurs supplémentaires lors de la configuration du DoE.
      2. Également utiliser cette approche pour tester si l'addition répétée d'un seul polymère peut améliorer la floculation. Utilisez une addition par étapes pour simuler la lente addition d'un floculant, par exemple quatre étapes, chacune ajoutant 0,25 ml 80 g L -1 floculant bouillon à 20 ml de volume de plus de 4 min peut imiter l'addition de floculant avecun débit de 0,25 ml min -1.
      3. Dans tous les cas, d'identifier un nouveau volume d'échantillon final maximal pour cette configuration en ajoutant les volumes maximaux de tous les floculants pour le volume d'échantillon, ici encore 22 ml, et recalculer les volumes requis de solutions et tampons d'achat d'actions floculants pour le réglage du volume si nécessaire.
  3. Incuber les échantillons pour les temps définis dans le DoE, typiquement 3-30 min, pour permettre la formation de floc. Assurez - vous que toutes les autres conditions d'incubation, par exemple la température, sont fixés selon le DoE.
  4. Observer et formation document de floc. Notez les progrès de la formation de floc selon les besoins, par exemple en mm de floc de décantation par minute en mesurant la hauteur des solides décantés. Le cas échéant, de prolonger la floculation pendant une période de temps prolongée par exemple la nuit.
  5. Filtrer l'extrait floculée.
    1. Utiliser les matériaux filtrants préparés précédemment (2.3) afin de clarifier l'extrait floculée après la appropriéele temps d'incubation en décantant les échantillons floculés à travers le matériau filtrant et dans un récipient de réaction ou tube propre.
      1. Ne pas remettre en suspension les flocs réglées avant filtration et appliquer l'extrait avec à un taux de ~ 300 ml min -1 au filtre, correspondant à 3-4 s pour un échantillon de 20 ml.
      2. Confirmer l'exécution de l'étape de filtration , si un autre matériau est utilisé dans les expériences de paillasse par rapport au processus final en termes de rétention de particules, par exemple en mesurant la distribution des tailles de particules dans les deux types d' échantillons 11.
    2. Analyser le filtrat en termes de turbidité et / ou la distribution de la taille des particules en utilisant des dispositifs appropriés nécessaires, par exemple un turbidimètre.
    3. Facultatif: répéter l'analyse après des temps d'incubation prolongée, par exemple 12-24 heures, pour étudier la formation ou reformation de flocs instables.
  6. Analyser les échantillons en termes de PrRéponses de e-défini (1.1.3).
    1. Prélever des échantillons à partir des filtrats et de les analyser pour les paramètres de réponse supplémentaires, par exemple , les concentrations de différentes protéines cibles ou des produits de valeur.
    2. Facultatif: Analyser le rétentat (principalement solides) pour les mêmes paramètres pour fermer le bilan massique du processus. En particulier, de quantifier l'effet de floculants sur la récupération de liquide en comparant les solides de masse restants après que les échantillons sont traités ou non traités avec floculant.
  7. Confirmer la qualité des données et transférer les résultats vers le logiciel DoE.
    1. Rechercher des valeurs extrêmes dans les données de réponse recueillies, par exemple des valeurs anormalement élevées.
    2. Veiller à ce que toutes les données de réponse sont correctement alignées avec leurs conditions expérimentales correspondantes.
    3. Transférer les résultats dans le logiciel DoE et assurez-vous que les ordres d'exécution standard et randomisés ne sont pas mélangés.

4. Évaluerle DoE

  1. Utilisez les outils d'analyse de données intégrées du logiciel DoE pour développer un modèle prédictif comme décrit précédemment 20.
    1. Sélectionnez un mode de transformation de données appropriée si nécessaire pour faciliter la construction modèle, ici log 10. Un rapport supérieur à 10 pour la plus grande la plus petite valeur de réponse par rapport indique qu'une transformation de données peut être requise. Identifier la transformation la plus appropriée à l' aide des outils statistiques appropriés, par exemple un terrain Box-Cox 35.
    2. Choisissez un modèle de base (i) Convient au DoE sélectionné (1.2) et (ii) est d' accord avec les connaissances antérieures sur le système visé par l' enquête sur la base de l'analyse de variance (Anova) Outils du logiciel DoE, par exemple un polynôme de second ordre adapte souvent mieux à l'effet observé du temps d'incubation d'un polynôme de premier ordre.
    3. Retirer les facteurs insignifiants du modèle, par exemple , p> 0,05, ou les interactions des facteurs itérativement en les désactivant, lereby la réduction de la complexité du modèle et en augmentant sa puissance prédictive.
    4. Vérifiez la qualité du modèle en comparant R 2, R 2 ajusté et prédit R 2 ainsi que le tracé de probabilité normale des résidus studentisés, résidus-vs-run, prédit-vs-réelle et Box-Cox 36 parcelles. Toutes les valeurs R 2 doivent être dans une fourchette de 0,2.
    5. Assurez - vous que le modèle final est d' accord avec les hypothèses de base de la physique et de la thermodynamique, par exemple , pas de concentrations négatives sont prédits.
  2. Utilisez le modèle pour prédire les conditions les plus favorables pour le système visé par l'enquête, voici une faible turbidité.
    1. Sélectionnez les réponses les plus importantes et leurs états préférés, par exemple la turbidité minimale. Combinez ces sélections en maximisant une fonction de désirabilité ou des outils similaires, qui sont intégrés dans les caractéristiques de plusieurs logiciels DoE 36.
    2. En fonction de l'application envisagée of le modèle, sélectionnez confirmation fonctionne pour vérifier les conditions optimales et / ou le pouvoir prédictif du modèle en général, par exemple , si les conditions prévus pour être le plus favorable ne faisaient pas partie de la première DoE sélectionnez - les comme des expériences de suivi.

5. Améliorer le modèle et vérifier la puissance prédictive

  1. Affinez l'espace de conception initiale à des conditions de fonctionnement les plus souhaitables, par exemple une faible turbidité dans la gamme 0-1000 unités néphélométriques de turbidité (NTU), basé sur les prédictions du modèle (4.2).
  2. Mettre en place un nouveau DoE dans ces gammes, notamment que les facteurs qui ont été identifiés comme significatifs ou pertinents (4.1.2)).
    NOTE: Un facteur peut être important en termes d'analyse de modèle , mais sans importance pour un processus, à savoir son effet sur ​​une réponse est <1% par rapport à celui d'autres facteurs.
  3. Répétez les étapes 1-5.2 jusqu'à ce que la qualité des prédictions du modèle correspond aux requirements, par exemple l'écart type du modèle , comme indiqué par le logiciel est suffisante pour l'application envisagée. Modifier la stratégie expérimentale si nécessaire pour ces itérations, par exemple utiliser un seul floculant dans le raffinement.
  4. Transfert et confirmer les résultats du modèle à l'échelle vers le bas à l'échelle pilote ou à l'échelle de la production finale.

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Résultats

Floculation de l'extrait de tabac avec différents polymères

Le procédé décrit ci - dessus a été utilisée avec succès pour développer un procédé pour la floculation des extraits de tabac lors de la fabrication d'un anticorps monoclonal (l'anticorps anti - VIH neutralisant 2G12) et une protéine fluorescente (DsRed) (figure 1) 16, et a depuis été transféré à d'autres protéines, y compri...

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Discussion

L'aspect le plus important à considérer lors de la mise en place d' un DoE pour caractériser la floculation des particules est que la conception doit en principe être en mesure de détecter et de décrire les effets prévus ou possibles 36,38, par exemple l'influence du pH, le type de polymère et la concentration de polymère 16. Par conséquent, il est important d'évaluer la fraction de l'espace de conception (FDS) avant de commencer les expériences réelles. Fds est la frac...

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Déclarations de divulgation

L'auteur n'a aucun conflit d'intérêt à divulguer.

Remerciements

Je tiens à remercier le Dr Thomas Rademacher pour avoir fourni les graines de tabac transgéniques et Ibrahim Al Amedi pour la culture des plants de tabac. Je tiens à remercier le Dr Richard M Twyman pour son aide éditoriale et le professeur Rainer Fischer pour les discussions fructueuses. Ce travail a été financé en partie par la subvention avancée du Conseil européen de la recherche ''Future-Pharma'', numéro de proposition 269110, la Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fondation Fraunhofer Future) et les programmes internes Fraunhofer-Gesellschaft sous la subvention n°. Attirer 125-600164.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2100P Turbidimètre portableHach4650000Turbidimètre
2G12 AnticorpsPolymunAB002Anticorps de référence
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01Dispositif SPR
BP-410Furh2632410001Filtre à manches
Catiofast VSHBASF79002360Agent
floculantCentrifugeuse 5415DEppendorf5424 000.410Centrifugeuse
Tube à centrifuger 15 mlLabomedic2017106Tube à
réaction Tube à centrifuger 50 ml AutonomeLabomedic1110504Tube à réaction
ChitosanCarl Roth GmbH5375.1Agent floculant
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEsoftware
Phosphate disodiqueCarl Roth GmbH  ; 4984.3  ;Composant multimédia
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Engrais
Forma -86C CongélateurULT ThermoFisher88400Congélateur
Serren.a.n.a.Pourla culture des plantes
Grodan Cubes de laine de roche 10 x 10 cmGrodan102446Bloc de laine de roche
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Composant de média
K700P 60DPall5302305Couche filtrante en profondeur
KS50P 60DPallB12486Couche filtrante en profondeur
MiraclothLabomedic475855-1RToile filtrante
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-mètre / conductimètre
Osram cool white 36 WOsram4930440Source lumineuse
PhytotronIlka Zelln.a.Pourla culture des plantes
Polymin PBASF79002360Floculant
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110Dispositif d’homogénéisation avec outil à lame personnalisé
Protein ALife technologies10-1006Protéine de liaison aux anticorps
Chlorure de sodiumCarl Roth GmbHP029.2Composant du milieu
Synergy HTBioTekSIAFRTLecteur de plaques de fluorescence
TRISCarl Roth GmbH4855.3Composant multimédia
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Composant multimédia
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Boîtier de filtre
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS mesure de la distribution granulométrique

Références

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