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Article de méthode

Administration intra-trachéale de

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⸱

DOI :

10.3791/53964

⸱

2 mars 2016

 ,  , 
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

Dans cet article

Résumé

Nous démontrons la procédure d’inoculation intra-trachéale d’Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures de souris. Il s’agit d’un outil très utile pour étudier les voies de signalisation qui régulent l’inflammation des voies respiratoires dans des modèles murins.

Résumé

Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour efficacement et livrons directement Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures des souris. Nous démontrons la procédure de préparation H. influenzae inoculum, instillation intra-trachéale de H. influenzae dans le poumon, la collecte du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), l' analyse des cellules immunitaires dans le BALF et l' isolement de l' ARN pour l' analyse différentielle de l' expression génique. Cette procédure peut être utilisée pour étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à une bactérie, un virus ou des champignons. endotrachéale directe instillation est le plus souvent préféré aux procédures d'inhalation par voie nasale ou d'un aérosol, car il fournit plus efficacement l'inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures avec moins d'ambiguïté.

Introduction

L'inflammation est un mécanisme immunitaire fondamental de la défense contre les agents infectieux. Il favorise l'élimination des agents pathogènes et la réparation des tissus endommagés. Il facilite également la récupération à un état ​​de santé normal 1. Cependant, l' inflammation dérégulée conduit souvent à des maladies inflammatoires chroniques 2. Inflammation des voies respiratoires est un facteur déclenchant diverses maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), l' asthme et la fibrose pulmonaire 3.

La non typable (non encapsulé) , Haemophilus influenzae (NTHi) est associée à des maladies inflammatoires pulmonaires supérieures et inférieures à 4,5 chroniques. Ce sont les espèces dominantes isolées des voies respiratoires inférieures des enfants et des adultes avec 4,6,7 chronique de la maladie pulmonaire obstructive. La réponse inflammatoire après l'infection NTHi est caractérisée par la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF et l'IL-1β), et il est médié by mitogène protéine kinase activée (MAPK) et le facteur nucléaire-kB (NF-kB) grâce à des récepteurs Toll-like (TLR) 8.

Des modèles de souris sont des outils très utiles pour l'analyse de la pathologie sous-jacente de la maladie inflammatoire pulmonaire en raison de la disponibilité des différentes lignes de gènes déficients. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour inoculer des bactéries vivantes atténuées et / produits bactériens, y compris l' instillation intranasale et par inhalation sous forme d' aérosol 9,10. Ici, nous démontrons intra-trachéale instillation. Bien qu'ils soient utilisés moins fréquemment, cette approche est plus efficace et hautement reproductible en raison de la livraison directe de l'inoculum pour les voies respiratoires inférieures.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives du Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Institut de recherche Baylor.

1. La culture non-typable Haemophilus influenzae (NTHi) et préparation de l'inoculum

  1. Plaque de NTHi sur une plaque de gélose chocolat et maintenir la plaque à l' envers dans un incubateur à CO2 humidifiée pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. Le jour, après culture des bactéries dans un bouillon d'infusion cerveau-coeur. Ensuite, ajoutez 1 ml de bouillon dans un tube de 1,5 ml stérile.
  2. Centrifuger à 4000 xg pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile 1x. Répétez cette étape une fois.
  3. Transférer 100 pl de solution de remise en suspension dans 900 ul de PBS 1x et mesurer l'absorbance de la culture diluée à 600 nm de longueur d'onde dans un spectrophotomètre.
  4. Déterminer l'unité viabilité et formant des coloniess (CFU) de l'inoculum par culture 1:10 dilutions en série sur des plaques de gélose chocolat et incubation pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Sur la base de la viabilité et le nombre de CFU déterminé à partir de l'étape précédente, ajuster l'inoculum à une concentration finale de 20 x 10 6 UFC / ml.

2. intra-trachéale (it) instillation

  1. Injecter la souris par voie intrapéritonéale (ip) avec 0,1 ml / 10 g de poids corporel de souris avec une / ml de kétamine + 20 mg / ml d'une solution de 150 mg de xylazine. La procédure doit être fait dans le capot avec une source de lumière pour garder la chaleur animale.
  2. Pincer l'espace interdigital de la souris pour vérifier que la souris est correctement anesthésiés.
  3. Placez la souris sur son dos. Rasez la zone ventrale du cou et désinfecter avec de la chlorhexidine et de l'alcool éthylique à 70%.
  4. Soulever la peau de la partie supérieure ventrale du cou à l'aide de rat pince à dents. Une petite incision (0,5 à 1,0 cm) au-dessus du thymus à l'aide d'un scalpelet de disséquer soigneusement le muscle pour exposer la trachée.
    1. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 G, injecter lentement 0,05 ml d'air, suivi de 0,05 ml NTHi obtenus à partir de la section 1 ou une solution saline comme témoin, suivie d'une autre de 0,05 ml d'air. Gardez l'animal vertical pour environ 1 min.
  5. Fermer l'incision avec de la colle chirurgicale. Gardez la souris latéralement en position couchée et chaud pendant environ 10 min.

3. LLBA Collection

  1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale 24 heures après l'infection.
  2. Ouvrez la cavité abdominale de la souris avec des ciseaux anatomiques et couper l'aorte ventrale à saigner. Exposer la partie ventrale du poumon.
  3. Exposer la trachée et l'intubation avec un cathéter de calibre 20. Instiller 0,8 ml de tampon LLBA (1x PBS, 0,1% de dextrose, 10 U / ml d'héparine) et recueillir le lavage par aspiration douce. Répétez cette procédure trois fois.
  4. Compter le nombre total de cellules dans 100 ul de suspension à l'aide d'un LLBA hemocytomètre sous un grossissement 10X avec coloration au bleu Trypan.
  5. Préparer des lames pour la coloration Giemsa modifiée. Aliquote de 100 pi de LLBA dans les puits appropriés de la Cytospin et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Sécher les lames pendant 10 min et tacher les cellules en utilisant Giemsa modifié selon les protocoles du fabricant.
  6. Utiliser les cellules restantes pour une analyse ultérieure, tels que le tri cellulaire activé florescence (FACS), la microscopie confocale, l' expression génique et Western Blot 13/11.

4. histopathologie Préparation

  1. Pour l'analyse histopathologique, infecter des souris avec NTHi comme décrit dans l'étape 2.4. Après 24 heures d'infection, sacrifier les animaux par dislocation cervicale. Couper ouvrir la cavité thoracique anatomiques avec des ciseaux pour exposer les poumons et la trachée, comme mentionné précédemment. Ensuite, insérer le cathéter de calibre 20 dans la trachée.
  2. Remplissez le poumon avec une solution d'agarose chaud 2% préparé dans 4% de formaline. Une fois lapoumons sont complètement gonflés, le lieu de la glace au-dessus des poumons pour solidifier la solution d'agarose.
  3. Puis, enlevez délicatement le bouchon thoracique et le mettre dans une solution à 50 ml de formol à 4% dans PBS 1x jusqu'à ce qu'il soit traité pour (H & E) sections hématoxyline et éosine.

5. FACS coloration des cellules dans le LLBA

  1. Mettre à 1 x 10 5 cellules à partir du fluide de LLBA dans une microplaque de titrage à 96 puits à fond en V.
  2. Laver les cellules avec 300 pi de froid 1x PBS et centrifuger à 4000 g pendant 3 min à 4 ° C.
  3. Colorer les cellules avec une solution de coloration de cellules dans 100 ul de PBS 1x (1: 1000 dilution) et conserver à la température ambiante pendant 15 min.
  4. Laver les cellules avec 300 pi de froid 1x PBS à 4000 xg pendant 3 min à 4 ° C.
  5. Gardez les cellules dans 100 pi de tampon de lavage FACS [tampon de lavage (PBS 1x, 2% de FBS, 1 mM EDTA, azoture de sodium à 0,1%] contenant 1: 100 dilué Fc-Block pendant 15 min à 4 ° C.
  6. Centrifuger les cellules à 4000 g pendant 3 min et jeter supernatant.
  7. cellules Stain avec 100 pi coloration de surface cocktail (dilution 1: 100) dans un tampon de lavage FACS pendant 30 min à 4 ° C.
  8. Laver les cellules trois fois avec 300 pi de tampon de lavage FACS à 4000 xg pendant 3 min à 4 ° C.
  9. Fixer les cellules dans 100 pi de paraformaldehyde à 4% pendant 15 min à température ambiante.
  10. Laver les cellules deux fois avec 300 ul de 1 x PBS à 400 g pendant 3 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 300 pi de tampon de lavage FACS.
  11. Faire des contrôles de coloration unique couleur à l'aide de cytométrie de flux perles.
    1. Ajouter une goutte de perles dans la plaque de microlitre 96 puits à fond en V et laver avec 200 ul PBS 1x.
    2. Ajouter 1 pi d'anticorps de coloration à 100 ul de 1 x PBS et les billes et on incube à température ambiante pendant 5 min.
    3. Lavez perles deux fois avec 300 pi de PBS 1x.
  12. Analyser les contrôles et les cellules individuelles tachée par cytométrie en flux 14.

6. Homogénéisation du tissu pulmonaire pour isoler l'ARN

  1. Après l'infection, prélever un petit morceau de poumon (20-40 mg) et le maintenir dans l'ARN stabilisant réactif à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, le stocker à -80 ° C jusqu'à ce que la prochaine étape.
  2. Laver les tissus pulmonaires dans le froid 1x PBS pour se débarrasser du réactif de stabilisation de l'ARN.
  3. Placer le tissu dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse contenant un tampon de lyse (1 ml de tampon de lyse + 10 ul de β-mercaptoéthanol).
  4. Hacher le tissu en petits morceaux avec des ciseaux pointus et homogénéiser à l'aide d'un fil moteur pellet pilon pendant 20-40 sec.
  5. Gardez le lysat sur la glace pendant 5 min et passez à l'étape 7.1.

7. Isolement de l'ARN du poumon

  1. Centrifuger le lysat à 18000 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage et transférer soigneusement dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  2. Ajouter 1 volume d'éthanol à 70% au lysat. Mélanger immédiatement par pipetage et attendre 2-4 min.
  3. Transférer jusqu'à 700 pi de lysat dans une colonne de centrifugation placédans un tube collecteur de 2 ml.
  4. Centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec et jeter le flux continu.
  5. Ajouter 350 pi de tampon de lavage stringent et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
  6. Ajouter 80 ul DNase I directement à la membrane de la colonne de spin et de le maintenir à la température ambiante pendant 15 min.
  7. Ajouter un tampon de lavage stringent 350 pi à la colonne et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
  8. Ajouter 500 pi de tampon de lavage d'ARN et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
  9. Ajouter 500 pi de tampon de lavage d'ARN et essorage à 9600 xg pendant 2 min. Jeter l'écoulement.
  10. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et centrifuger à 9600 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
  11. Ajouter 30-50 eau libre de RNase-ul directement à la colonne et centrifuger à 9600 xg pendant 1 min. ARN de magasin à -80 ° C.
  12. Effectuer une analyse 14 RNA-seq.

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Résultats

Instillation intra-trachéale a donné lieu à un nombre nettement accru de leucocytes dans le LLBA (figure 1A, panneau de gauche) que l' installation avec une solution saline. L'analyse de comptage différentiel des leucocytes a clairement montré une infiltration accrue de neutrophiles (Figure 1, panneau de droite). L'analyse FACS des cellules dans le BALF a en outre confirmé l'augmentation du nombre de neutrophiles (figure 1B).

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Discussion

Ici, nous décrivons un procédé unique et peu invasive pour inoculer les poumons de souris par un pathogène bactérien du poumon. Nous démontrons que cette procédure peut être utilisée pour étudier la fonction des différents gènes en utilisant des souris qui sont déficientes en gènes des voies de signalisation inflammatoires. Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les réponses inflammatoires à des infections virales et fongiques pulmonaires. Les avantages de cette procédure par rapport aux autres méthod...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Dr Carson Harrod pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également M. Minghui Zeng et les Drs Mahesh Kathania et Prashant Khare pour leurs contributions. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Cancer Society (subvention Research Scholar, 122713-RSG-12-260-01-LIB) et du Sammons Cancer Center (subvention du projet pilote) à K. Venuprasad.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque de gélose au chocolatFisher ScientificCAS50-99-7
Dextrose AnhydreThemo ScientificR01300
HéparineHospira,IncRL-3010
Solution rapide habileSigmaGS500-500ML
Aiguille de seringue 20/26G  ;BD(REF305115/175)
Seringue ImlBDREF 309602
Cathéter 20GABDREF
Ciseaux de dissection, droits, 10 cm de longkentscientificINS600393
Iris Pince à iris dentelée, dentelée, 10cm de longkentscientificINS650915
Pince à épiler #5 Acier inoxydable, 11cm de longkentscientific
10 % FormolFisher ScientificCAS 67-56-1
Agarosepeqlab35-1020
5ml polystyrène tubes à fond rondBDREF 352058
1,5 ml Tubes à centrifugerLight LabsA-7001-R
Reasy Mini  ; kit  ;Qiagen74104
Moteur de pestile à granulés (Homoginiseur de tissus)SigmaZ359971-1EA
Plaques de microtitration à 96 puits Fond en VThermo2605
1X PBSGibco10010-023
OneComp eBeadseBioscience01-1111-42
CD45.2-APCeBioscience17-0454-81Dilution de travail 1:100
Ly-6G-eFlor 450eBioscience48-5931-82Dilution de travail 1:100
BSAHyCloneSH30574.03
Tampon de lyse RBC (10X)Biolegend420301
de coloration aqua fixable en direct/mortInvitrogenL-34957
EDTA (0.5M)lifetechnologies15575-020
CD16/ CD32 FcBlockBD553142
Facs tubes polystyrène tube à fond rondBD352052
FormaldéhydePolyscience4018
381433 INS600095 Kit

Références

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376(2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188(2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446(2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22(2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

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