Étude de la fonction de Coronin A dans la réponse Starvation précoce de<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Par agrégation Assays

Résumé

L’amibe sociale Dictyostelium discoideum subit une transition développementale vers un organisme multicellulaire lorsqu’elle est affamée. La coronine A, une protéine conservée au cours de l’évolution, joue un rôle crucial dans l’initiation du développement. En utilisant des tests d’agrégation comme méthode principale, nous visons à élucider le rôle de la coronine A dans le développement précoce.

Résumé

Dictyostelium discoideum amibes se trouvent dans le sol, se nourrissant de bactéries. Lorsque les sources de nourriture se font rares, ils sécrètent des facteurs de lancer un programme de développement multicellulaire, au cours de laquelle des cellules individuelles chemotax vers les centres d'agrégation ^1-4. Ce processus dépend de la libération de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) ^5. AMPc est produit dans les vagues grâce à l'action concertée de l' adénylate cyclase et phosphodiestérases, et se lie à la protéine G couplée AMPc récepteurs ^6,7. Un essai largement utilisé pour analyser les mécanismes impliqués dans le cycle de développement de la partie inférieure eucaryote Dictyostelium discoideum est basé sur l'observation de l' agrégation des cellules dans des conditions submergées ^8,9. Ce protocole décrit l'analyse du rôle de coronine A dans le cycle de développement par la famine dans des plaques de culture de tissus immergés dans une solution saline équilibrée (BSS) ^10. Coronin A est un membre de la pr largement conservéefamille otein de coronins qui ont été impliqués dans une grande variété d'activités ^11,12. cellules de Dictyostelium dépourvues Coronin A sont incapables de former des agrégats multicellulaires, ce défaut peut être sauvée en fournissant des impulsions d'AMPc, ce qui suggère que Coronin A agit en amont de la ¹⁰ cascade AMPc. Les techniques décrites dans ces études fournissent des outils robustes pour étudier les fonctions des protéines pendant les premières étapes du cycle de développement de Dictyostelium discoideum en amont de la cascade de l' AMPc. Par conséquent, l'utilisation de ce test d'agrégation peut permettre une étude plus approfondie des coronine Une fonction et de faire progresser notre compréhension de la biologie coronine.

Introduction

La famille coronine de protéines est fortement conservée tout au long des eucaryotes. Ces protéines sont caractérisées par la présence d'un tryptophane-aspartate amino-terminale (DEO) répéter contenant la région suivie d'une région unique connecté à un domaine coiled-coil carboxy-terminale ^13,14 (figure 1). Coronins ont été impliqués dans une variété de fonctions cellulaires, y compris la régulation du cytosquelette et la transduction du signal ^12. Chez les mammifères, jusqu'à six molécules courtes coronine (de coronine 1-6), ainsi que d' un «tandem» coronine 7, peuvent être co-exprimées ^12,15. Coronin....

Protocole

1. Observez la réponse de famine précoce de Dictyostelium discoideum par microscopie time-lapse.
   1. Cultiver des cellules DH1.10 ou des cellules CORA de dans un erlenmeyer contenant HL-5 moyenne (pour 1 litre: 5 g de protéose - peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g de glucose, 5 g d' extrait de levure, 0,35 g de Na ₂ HPO ₄ * 7H ₂ O, 0,35 g de KH ₂ PO _4, 0,05 g de sulfate de dihydrostreptomycine, pH 6,6) à 22 ° C dans un incubateur à agitation avec une rotation de 160 tours par minute. Maintenir les cellules à une densité comprise entre 0,01 x 10 ⁶ cellules / ml et 2 x 10 ⁶ cellules ....

Résultats

Les cellules déficientes en coronine Un spectacle d' un défaut dans le développement précoce (figure 2). En l'absence de Coronin A cellules sont incapables de former des agrégats multicellulaires, qui est l'étape initiale au cours du cycle de développement de Dictyostelium discoideum. Par conséquent, un coronine semble jouer un rôle dans la réponse de famine au début et / ou de signalisation de l'AMPc. En effet, l'absence de formation d' .......

Discussion

Les protéines Coronin se trouvent dans la plupart des taxons de clade eucaryote. Dictyostelium discoideum coronine A, l'homologue de coronine mammifère 1, est impliquée dans la réponse de famine précoce, étant donné que Coronin A déficientes cellules ne sont pas capables de former des centres d'agrégation au cours du développement précoce cycle de ^10. Pour être en mesure d'évaluer quantitativement et avec précision le retard dans le développement entre les souches, un microscope imagerie .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu HL-5 (pour 1 L : 5 g de peptone de protéose, 5 g de peptone de thiotone E, 10 g de glucose, 5 g d’extrait de levure, 0,35 g de Na2HPO4*2H2O, 0,35 g de KH2PO4, 0,05 g de sulfate de dihydrostreptomycine, pH 6,6)
Proteose peptone	BD Bioscience	211693
Thiotone E peptone	BD Bioscience	211684
Extrait de levure	BD Bioscience	212750
Glucose	AppliChem	A3666
Na2HPO4*2H2O	Fluka	71643
KH2PO4	AppliChem	A1043
dihydrostreptomycin-sulfate	Sigma-Aldrich	D1954000
PBM (0,02 M phosphate de potassium, 10 &mu ; M CaCl2, et l mM MgCl2, pH 6,1)			fait maison
(10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)			maison
0,45-&mu ; m Filtre Filtropure S	Sarstedt	83.1826
Falcon 24 puits Plaque de culture tissulaire	Fisher Scientific	08-772-1H
Microscope Cellobserver	Logiciel	Zeiss
Microprocesseur IPC&ndash ; pompe distributrice contrôlée	ISMATEC	ISM 931
Axiovert 135M microscope	Zeiss	491237-0001-000
Agitateur d’incubation	Inforst HT Minitron

BSS fait AxioVision sur mesure