Foraging Protocole Chemin de longueur pour Drosophila melanogaster larves

Résumé

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test de longueur de chemin de recherche de nourriture de Drosophila melanogaster. Nous discutons de la préparation et de la manipulation des animaux de test, de la façon d’effectuer le test et d’analyser les données.

Résumé

La Drosophila melanogaster larvaire longueur de chemin phénotype est une mesure établie utilisée pour étudier les contributions génétiques et environnementales à la variation du comportement. Le test de longueur de chemin larvaire a été développé pour mesurer les différences individuelles dans le comportement alimentaire qui ont ensuite été lié au gène de recherche de nourriture. Larvaire longueur de chemin est un trait facilement marqué qui facilite la collecte des échantillons de grande taille, à un coût minime, pour les écrans génétiques. Ici, nous fournissons une description détaillée du protocole actuel pour le test de longueur de chemin larvaire d'abord utilisé par Sokolowski. Le protocole décrit comment gérer de façon reproductible des animaux d'essai, effectuer le test de comportement et d'analyser les données. Un exemple de la façon dont le dosage peut être utilisé pour mesurer la plasticité comportementale en réponse aux changements environnementaux, en manipulant l'alimentation environnement avant d'effectuer le test, est également fourni. Enfin, la conception d'essai approprié, ainsi que les facteurs environnementaux qui peuvent modifierchemin de longueur larvaire tels que la qualité des aliments, l'âge de développement et les effets de jour sont discutés.

Introduction

Depuis la découverte du gène blanc dans le laboratoire de Thomas Hunt Morgan en 1910, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), a été utilisé comme modèle pour l'étude des fondements moléculaires et physiologiques de divers processus biologiques. La popularité de D. melanogaster provient en grande partie de la quantité considérable et la variété des outils génétiques. La petite taille de la drosophile, une relative facilité de manipulation et de courte durée de génération rendent un modèle idéal pour les études génétiques. Tout aussi important est la capacité de Drosophila de démontrer un grand nombre des phénotypes exprimés par des organismes plus complexes , y compris les mammifères. Cela inclut des phénotypes complexes tels que le comportement qui se dressent à l'interface entre l'organisme et son environnement. À ce titre, des études comportementales sur la mouche des fruits ont largement contribué à notre compréhension de la façon dont les gènes et l'environnement médiatisent comportement1.

L' une des premières études de D. le comportement des larves melanogaster étudié les différences individuelles dans les stratégies de recherche de nourriture des larves en mesurant le chemin d' accès longueurs des larves ² tout en se nourrissant. Chemin de longueur a été définie comme la distance totale parcourue par une seule larve sur la levure, dans un délai de cinq minutes. Les deux souches et les mouches de laboratoire à partir d'une population naturelle de Toronto varient dans leurs comportements de recherche de nourriture et il y avait une composante génétique à des différences individuelles dans le chemin de longueur. Deux morphes de recherche de nourriture des larves ont été décrites dans les distributions quantitatives chemin de longueur et ils ont été appelés rover et sitter. Rovers présentent plus de chemin longueurs tout en traversant une zone plus large tandis que sur un substrat alimentaire que sitters. L' utilisation de ce test de longueur de chemin, de Belle et al. ³ cartographié la recherche de nourriture (pour) gène qui sous - tend ces différences de comportement individuelles à un emplacement discret sur ​​chromosome- 2 (24A3-24C5). D. melanogaster pour le gène a ensuite été clone ⁴ et révélée être une protéine kinase dépendante du GMPc ^5, un modulateur de la physiologie et le comportement dans Drosophila et d' autres organismes ^6.

Nous présentons ici le protocole actuel pour le test de longueur de chemin larvaire développé à l' origine dans Sokolowski ^2. Bien que certains aspects de l'essai ont changé au fil des ans, le concept derrière le design n'a pas. Nous fournissons également des données pour illustrer le potentiel du test pour évaluer les contributions génétiques et environnementales à des différences individuelles dans le comportement alimentaire des larves de drosophile. Le test de longueur de chemin larvaire est simple, efficace, et pourtant robuste. Une seule personne peut tester jusqu'à 500 larves avec facilité en quatre heures et les résultats peuvent être obtenus avec un niveau élevé de reproductibilité. Développé à l' origine pour localiser, il peut être utilisé dans des criblages génétiques, la cartographie du locus de trait quantitatif, et dans les étudesdu gène-environnement (GxE) interactions. De plus, sa simplicité et sa reproductibilité en font une grande ressource pour l'enseignement de premier cycle.

Protocole

1. Préparer raisin assiettes et bouteilles Holding pour Collection de Larves

1. Pour fabriquer des bouteilles de maintien, les trous coupés dans un côté de bouteilles 6 oz de culture de mouche, assez grand pour accueillir un bouchon de flacon de mouche pour l' alimentation en air (Fig. 1D).
2. Pour fabriquer des plaques de raisin, préparer 250 ml de milieu de jus de raisin (1,8% de gélose, 45% de jus de raisin, l'acide acétique à 2,5%, 2,5% d'éthanol) en faisant bouillir l'agar-agar, le jus de raisin et la plupart de l'eau, refroidir à 70 ºC ( remuer pendant le refroidissement), puis ajouter de l'acide acétique et de l'éthanol et amener au volume avec de l'eau.
3. Utiliser une seringue (sans aiguille) pour remplir 35 x 10 mm boîte de Petri couvercles jusqu'à ce que la surface du milieu jus de raisin fait un dôme au- dessus de la lèvre du couvercle (Fig. 1A).
4. plaques de raisin de magasin dans un récipient étanche à l'air humide et à 4 ° C jusqu'à utilisation (jusqu'à un maximum de 2 semaines).

2. Préparation des plaques alimentaires

1. Préparez la recette de la nourriture à la mouche standard.
   Remarque: Pour taliments d'élevage est Couleur des effets de qualité sur le trajet de longueur, nous avons utilisé des aliments à faible braguette nutritif: 10% de saccharose, 1,3% d'agar, 0,8% de tartrate de sodium et de potassium, 0,1% de phosphate monopotassique, chlorure de sodium à 0,05%, 0,05% de chlorure de calcium, chlorure de magnésium à 0,05%, 0,05% de sulfate de fer, 5% de levure et l'acide propionique 0,5% dans l'eau; et à haute teneur en nutriments volantes: 1,5% de saccharose, 1,4% de gélose, 3% de glucose, 1,5% de farine de maïs, 1% de germe de blé, 1% de farine de soja, 3% de mélasse, 3,5% de levure, de l'acide propionique, 0,5%, 0,2% Tegosept et 1 % d'éthanol dans l'eau. Pour les deux aliments autoclave la solution et laisser refroidir à 50 ^° C avant d' ajouter l'acide propionique, Tegosept et de l' éthanol.
2. Verser 40 ml de nourriture à la mouche en 100 x 15mm boîtes de Pétri.
3. plaques alimentaires de magasin dans un récipient étanche à l'air humide et à 4 ° C jusqu'à utilisation (jusqu'à un maximum de 2 semaines).

3. Préparer les plaques d'essai

1. Préparer 58 x 25 cm, épaisseur de 6 mm plaques de plexiglas noir avec 10, 1 mm de profondeur des puits circulaires de 10 cm de diamètre et disposé dans une 2 x 5 jesign (Fig. 1C) pour tester les larves sur.
   Note: Jusqu'à 30 larves peuvent être testés à la fois si 3 ou plus des plaques de plexiglas ci-dessus sont disponibles. Alternativement, les larves peuvent être testés dans des boîtes de Pétri, 10 cm de diamètre. Cette option est beaucoup plus laborieuse et permet une diminution du nombre des larves à tester.
2. Obtenir un noir 39 x 8 cm, 6 mm d'épaisseur en plexiglas écarteur pour étaler la pâte de levure sur les plaques d'essai en plexiglas.
3. Préparer 100 x 15 mm boîte de Pétri couvercles pour l'enregistrement chemin longueurs larvaires en séparant les paupières de fonds à l'avance.

4. Mise en place des populations parentales

1. Gardez les conditions d' élevage constant tout au long du test (par exemple, 25 ° C, 60% d' humidité et une lumière 12h12: cycle d' obscurité sur la nourriture à la mouche standard).
2. Soulever la population parentale mêmes conditions d'élevage.
3. Collecter 100 - 150 femelles et 50 - 75 hommes et de les vieillir pendant 5 ± 1 jours pour la fécondité optimale.
4. Autoriser females et les hommes pour s'accoupler la nuit dans une mouche bouteille de culture de 6 oz avec de la nourriture à la mouche standard.
5. Transfert mouches dans une bouteille de maintien et fixer une plaque de raisin (une petite quantité de pâte de levure fraîche sur la plaque de raisin favorisera la ponte;. La figure 1B) sur le dessus avec du ruban adhésif (Fig . 1E).
6. Laisser les bouteilles debout à l' envers (Fig. 1F), avec la plaque de raisin au fond pour permettre aux adultes de pondre des œufs sur la plaque de raisin.
7. Jeter la première plaque de raisin après 24 h et de placer une nouvelle plaque de raisin dans la bouteille de maintien. Ce sera la plaque de raisin à partir de laquelle les larves sont recueillies le lendemain.
   Remarque: plaques de raisin devront être débarrassé des larves 22 heures après avoir été mis en place, mettre en place des plaques de sorte qu'ils peuvent être effacés tôt le lendemain (. Par exemple, mettre en place la plaque à 12 h et clair à 10 heures le lendemain). Il est conseillé de jeter la première plaque de raisin pour éviter les oeufs que les femelles pourraient avoir été retenues et that peut être avancé dans le développement.

5. Collecter L1 (première Instar) Larves de raisin Assiettes

1. Retirer les plaques de raisin de bouteilles 22 heures après avoir été mis en place et les placer dans une boîte de Pétri 60 x 15 mm.
2. Placez une nouvelle plaque de raisin avec de la pâte de levure fraîche sur la bouteille de maintien.
3. Effacer et jeter toutes les larves de la plaque de raisin ensemencées en utilisant une sonde de dissection.
4. Incuber effacé plaques de raisin pendant 4 heures dans des conditions standard.
5. Après 4 heures, chercher 100 larves L1 par souche à partir des plaques de raisin et de placer sur des plaques alimentaires.
   1. Placez les larves sur la nourriture doucement (sans perforer la nourriture et à enterrer les larves) et éviter l'encombrement en distribuant les larves à travers la plaque alimentaire.
6. Incuber les plaques alimentaires jusqu'à ce que les animaux d'essai sont d'environ 10 heures avant le début de l'errance.
   Note: À 25 ºC, 10 h avant de flâner en général correspond à 72-96 heures après l'éclosion. L'ExACt quantité de temps d'incubation doit être déterminé avant de commencer l'expérience en recueillant un ensemble initial de larves pour chaque souche et enregistrer le nombre d'heures avant le début de l'errance (larves errant se déplacer hors de la nourriture sur les côtés et le couvercle de la nourriture plaques).
   Remarque: Si nécessaire, les mêmes parents peuvent être utilisés pour recueillir les larves pour 3 - 4 jours d'essais en répétant les étapes 04.07 à 05.05. Changer l'ordre dans lequel les souches sont mis en place et testés à travers jours afin d'éviter un effet de commande de test sur le chemin de longueur. Testez la même souche "de commande" / souches chaque jour de tests pour contrôler les effets de jour.
7. Si de nombreuses souches sont testées, décaler les temps de mise en place et la collecte des larves pour permettre l'essai de chaque souche au point de temps approprié plus tard.

6. larvaire Chemin longueur d'essai

1. Dissoudre la levure de boulangerie sèche-actif dans l'eau à un rapport 1: 2 (poids à volume). La pâte de levure fini devrait être plus mince que pancake pâte, d'une manière qui en soulevant une cuillère sur la pâte, il coule et laisse derrière des rubans sur la surface de la pâte qui fondent rapidement loin.
   Remarque: La consistance de la pâte de levure est important et devrait être constante tout au long de l'expérience. L'exacte levure: rapport d'eau peut être ajustée en fonction de la marque et le lot de levure.
2. choisir doucement les larves de la première souche à tester de la plaque d'aliments à l'aide d'un pinceau.
3. Recueillir les larves dans une boîte de Pétri et laver délicatement avec de l'eau pour éliminer tous les aliments.
   1. Laver rapidement les larves avec 1 - 2 ml d'eau et doucement dab larves sec avec un laboratoire essuyer pour éviter le transfert de l'eau en plaçant les larves sur la plaque d'essai. Pour éviter le stress, garder les larves humide mais pas immergé dans l'eau.
4. Disposer trois côté des plaques d'essai à côte et régler une minuterie de 5 minutes pour chaque plaque d'essai.
5. Appliquer la pâte de levure au-dessus des plaques d'essai et avec l'écarteur, la propagation d'une mise minceer de la pâte de levure sur chaque plaque d'essai de telle sorte que tous les puits ont une couche uniforme de levure.
6. Placez délicatement une larve dans le centre de chaque puits, à partir de la minuterie de 5 min après avoir placé les premières larves sur chaque plaque. Remarque: Trois plaques peuvent être faites à un moment, ce qui donne une taille de 30 jours / souche / échantillon d'essai, jusqu'à un total de 500 larves.
7. Placez un plat couvercle Petri sur le dessus de chaque puits.
8. Lorsque le temps imparti, sans enlever les larves de la plaque, commencer à tracer les chemins de longueurs laissées dans la levure en utilisant un marqueur permanent. Trace Chemin des longueurs dans le même ordre que les larves ont été placées sur les plaques d'essai.
   1. Effectuer le traçage à la même vitesse que les larves ont été placées sur les plaques. Par souci de cohérence dans l'analyse ultérieure des données, utiliser le même marqueur pour tous les chemins de longueurs. Marqueur permanent est recommandé.
9. Répétez les étapes 6.2 à 6.8.1 pour chaque souche à tester. Choisissez chaque souche de la nourriture immédiatement avant l'essai pour éviter les effets de la famine sur pae-longueur.

7. pénuries alimentaires

1. Si les larves sont d'être privés de nourriture avant le test, de recueillir les larves comme décrit dans les étapes 6.2 à 6.3, mais la quantité désirée de temps de privation de nourriture plus tôt (par exemple. Si les larves sont à la nourriture privé pendant 4 heures, de recueillir les larves 4 heures avant temps de test).
2. Divisez les larves lavé en deux groupes et placer le groupe alimentaire privé dans une boîte de Pétri 60 x 15 mm avec 5 ml 1% d'agar et le groupe de contrôle dans une boîte de Pétri avec 5 ml de nourriture standard.
3. Placer un poids sur le dessus du couvercle inversé des boîtes de Pétri (sinon les larves sont en mesure d'explorer lors de la recherche de la nourriture).
4. Incuber pendant la période de privation de nourriture préalablement établie et procéder à des essais comme décrit dans les étapes 6.2 à 6.9.
5. Si de nombreuses souches sont à tester, échelonner la privation de nourriture heures de début pour permettre de tester de chaque souche au point de temps approprié.

Analyse 8. Données

Remarque: Cette section décrit une méthode pour l' analyse des données en utilisant ImageJ ⁷ ou ⁸ Fidji pour le traitement des chemins de longueurs, bien que d' autres logiciels peuvent être utilisés.

1. Utilisez une table lumineuse pour transférer tous les chemins tracés longueurs de la boîte de Petri couvercles de papier blanc (couvercles peuvent être lavés avec de l'éthanol et réutilisées pour d'autres enregistrements de longueur de chemin).
2. Tracer une droite de référence de 50 mm sur l'une des feuilles de papier.
3. Scannez le chemin d'accès longueurs à une résolution de 300 dpi et enregistrer en tant que bitmap ou tiff fichiers image.
4. Ouvrez le fichier d'image, sélectionnez l'onglet "Processus"> "binaire"> "Make binaire". Puis, sous l'onglet "Processus", sélectionnez "binaire"> "squelettisent". Cela produit une ligne de largeur d'un pixel, indépendamment de l'épaisseur de la trace.
5. Assurez-vous que chaque chemin de longueur apparaît comme une seule ligne continue, sans croisements.
6. Séparer toutes les intersections en utilisant le "li Hétérooutil ne "et la coloration de la ligne blanche (la continuité de la trajectoire peuvent être vérifiés avec le" (traçage) outil Baguette ", le chemin complet doit être mis en évidence jaune (Fig. 2).
7. Sélectionnez l'option "Analyser"> onglet mesures Définir et sélectionnez «Périmètre» et «étiquette d'affichage".
8. Sélectionnez l'onglet "Analyse"> "échelle Set" et sélectionnez "Supprimer l'échelle".
9. Sur l'image, sélectionnez la ligne de référence, sélectionnez l'onglet "Analyse"> "particules Analyser" et sélectionnez "Afficher: Outlines", "Afficher les résultats" et "tableau des résultats clairs". Remarque: La sortie affiche le nombre de pixels correspondant à la ligne de l'échelle 50 mm.
10. Sélectionnez "Analyse" onglet> "Scale" et remplissez le nombre de pixels dans "Distance en pixels" et la distance correspondante (50 mm) dans «distance connu».
11. Enfin, sélectionnez tous les dessins de longueur de chemin d'un génotype d'untemps ta, sélectionnez l'onglet "Analyse"> "particules Analyser" et sélectionnez "Afficher: contours", "Afficher les résultats" et "tableau des résultats clairs".
    1. Retirez toutes les étiquettes écrites ou des marques étrangères évidentes (ils seront reconnus comme chemin-longueurs) dans la zone sélectionnée en sélectionnant la zone et de le remplir blanc.
12. Inspecter visuellement le fichier de sortie "Outlines" pour assurer les périmètres ont été correctement vérifiées. La sortie est un chemin de longueur en mm pour chaque dessin de longueur de chemin dans la sélection. Cela peut facilement être exportées vers un tableur et analysé avec un logiciel statistique.

Résultats

Les différences de longueur de trajet du rover et sitter pour les souches et l'effet de la privation de nourriture sur le chemin de longueur sont illustrés sur la Fig. . 3 Les données recueillies pendant trois jours consécutifs de tests ont montré un effet significatif de déformation (F _(1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 ^-16;. La figure 3A), avec rovers voyager plus loin que sitters. En plus...

Discussion

Le test de longueur de chemin décrite ici propose une mesure simple et robuste du comportement alimentaire des larves de drosophile. Le protocole suit la méthodologie générale décrite dans Sokolowski ^2, mais a depuis été amélioré en ce qui concerne l' efficacité et les contrôles expérimentaux. Au meilleur de notre connaissance, cette méthode est la seule méthode disponible pour la mesure des larves de longueur de chemin. La version originale du protocole ^{2, 3, 15, 16} larves testé sur d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
6 onces  ; Flacons de culture de mouches  ;	Fisher Scientific  ;	AS355  ;
Bouchons anti-mouches	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Boîtes de Pétri	Falcon	351008
100 x 15 mm Boîtes de Pétri	Boîtes
60 x 15 mm	VWR	25384-168  ;
Sondes de dissection	Almedic	2325-58-5300  ;
Laboratoire de	levure	Scientific FLY-8040-20F