Intra-iliaque Artère injection pour la modélisation efficace et sélective des métastases osseuses Microscopique

Résumé

Ce manuscrit présente en détail la procédure d’injection intra-iliaque dans l’artère iliaque (AII), une technique permettant d’administrer des cellules cancéreuses spécifiquement aux tissus des membres postérieurs, y compris les os, afin d’établir des métastases osseuses expérimentales. Bien qu’initialement établi avec des modèles de tumeurs mammaires, ce protocole peut être facilement étendu à d’autres types de cancer.

Résumé

L’injection intra-iliaque (IIA) est une approche efficace pour introduire des lésions métastatiques de diverses cellules cancéreuses chez les animaux. Par rapport aux injections intra-cardiaques et intra-tibiales largement utilisées, l’injection IIA apporte plusieurs avantages. Tout d’abord, il peut délivrer une grande quantité de cellules cancéreuses spécifiquement aux os des membres postérieurs, fournissant ainsi des événements de colonisation précoce synchronisés spatio-temporellement et permettant une quantification robuste et une détection rapide des cellules tumorales disséminées. Deuxièmement, il injecte des cellules cancéreuses dans la circulation sans endommager les tissus locaux, évitant ainsi les processus inflammatoires et de cicatrisation des plaies qui perturbent le processus de colonisation osseuse. Troisièmement, l’injection d’IIA provoque une croissance métastatique très faible dans les organes non osseux, empêchant ainsi les animaux de succomber à d’autres métastases vitales et permettant une surveillance continue des lésions osseuses indolentes. Ces avantages sont particulièrement utiles pour l’inspection de la progression des cellules cancéreuses uniques vers les micrométastases multicellulaires, qui a été largement insaisissable dans le passé. Lorsqu’elle est combinée à des approches de pointe de l’imagerie biologique et de l’histologie osseuse, l’injection d’IIA peut être appliquée à diverses fins de recherche liées aux métastases osseuses.

Introduction

Métastases représentent plus de 90% des décès causés par des tumeurs solides. L'os est l'organe le plus commun affecté par des métastases de divers types de cancer, notamment les cancers du sein et de la prostate. Lorsqu'elle est diagnostiquée dans la clinique, les métastases osseuses habituellement sont déjà entrés dans les stades avancés avec soit ostéolytiques ou ostéoblastiques altérations osseuses, souvent accompagnées de symptômes neurologiques.

Des études antérieures principalement axées sur les manifestes des métastases osseuses ostéolytiques ^1-3, mais nous avons actuellement compréhension des micrométastases dans les os limité avant le début du processus d'ostéolyse. Ceci est au moins en partie à cause du manque de modèles et approches expérimentales appropriées. Des modèles de souris transgéniques de cancer du sein métastasent souvent aux poumons, mais beaucoup moins efficacement aux os ^4. De même, les tumeurs orthotopiquement transplantées développent rarement des métastases osseuses spontanées, avec une certaine 4T1 carcinom mammaire d'os-tropicalun sous-clones et MSP surexprimés modèle de souris transgénique PyMT comme des exceptions ^5-7. Perçage intra-tibial peut fournir les cellules cancéreuses à l'os ^8-10, mais il encourt également des dommages et de l' inflammation dans les tissus locaux. Actuellement injection intra-cardiaque de lignées de cellules de cancer du sein a été la principale approche pour étudier la colonisation osseuse ^11-13. Cependant, après que les cellules cancéreuses sont introduits dans le ventricule gauche seulement une proportion limitée sera finalement atteindre l'os et la moelle osseuse, ce qui rend difficile le suivi des métastases microscopiques d'une manière quantifiable.

Dans cette étude, nous établissons une technique, à savoir l' artère intra-iliaque (IIA) injection ^14, pour délivrer sélectivement les cellules cancéreuses dans les tissus des membres postérieurs, enrichissant ainsi les cellules cancéreuses dans les os et la moelle osseuse sans causer de dommages aux tissus locaux. En raison de la spécificité de l'os, cette approche permet également de suffisamment de temps pour les cellules cancéreuses indolents pour coloniser finalement avant unimals succombent à des tumeurs primaires ou de métastases dans d'autres organes vitaux. Lorsqu'il est combiné avec une variété d'autres techniques, telles que l'imagerie par bioluminescence, immunofluorescence et histomorphométrie osseuse, l'injection IIA est potentiellement utile pour un large éventail d'objectifs de recherche liés à des métastases osseuses, en particulier pour suivre la progression des cellules cancéreuses individuelles à multi-cellulaire micrométastases. En particulier, nous avons démontré que l'injection II nous permet de visualiser les interactions entre les cellules cancéreuses et les différents types de cellules dans le microenvironnement entourant l'os.

Protocole

Tous les travaux de l'animal a été fait conformément aux directives de protection des animaux du Baylor College of Medicine.

1. Préparation des cellules

Remarque: Les différentes lignées de cellules cancéreuses peuvent être utilisés pour l'injection en fonction AII fins de recherche. Nous avons utilisé des lignées de cellules de cancer du sein MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 et la lignée cellulaire de cancer de la prostate C4-2 dans notre recherche. Nous utilisons généralement à la fois GFP et luciole cellules cancéreuses luciférase marqué pour notre étude et nous montrons quelques données ici à partir de la lignée cellulaire MCF7 GFP-luciférase marqué.

1. Maintenir les cellules dans du DMEM contenant 10% de FBS et 0,1 mg / ml de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans 5% de _CO2.
2. Avant injection IIA, trypsiniser cellules à 80 - 90% de confluence avec 0,25% de solution / EDTA trypsine. Utilisez PBS froide pour laver les cellules deux fois, et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS pour le comptage des cellules. Pour supprimer PBS, les cellules de centrifugation à 800 g pendant 5 min.
3. cellules Re-suspendreà une concentration de 5 x 10 ⁶ cellules / ml dans du PBS glacé.
4. Utilisez 100 GFP pi et les cellules cancéreuses luciole luciférase marqué pour l'injection IIA d'une souris.
   Remarque:. Par conséquent, le nombre de cellules reçues par chaque animal est de 5 x 10 ⁵ Ce nombre peut être nécessaire de modifier en fonction de l'agressivité des lignées cellulaires.
5. Gardez des suspensions de cellules sur la glace.
   Note: Les vibrations peuvent être nécessaires pour empêcher l'agrégation des cellules toutes les quelques minutes jusqu'à ce qu'il soit prêt pour l'injection. Pour certaines lignées de cellules (comme MDA-MB-231), des procédures plus strictes (par exemple, en passant par 45 um tamis cellulaire) peuvent être nécessaires pour empêcher l' agrégation. S'il vous plaît noter que le sabot des navires peut provoquer une nécrose des tissus, et donc confondre les expériences.

2. Préparation des animaux

1. Pour la gestion de la douleur animale, donner 5 mg / kg / jour carprofène (ou un autre analgésique) avec supplément alimentaire pour les souris pas moins de 24 heures avant la chirurgie. Administrerune dose de 0,1 mg / ml de buprénorphine sous-cutanée 60 minutes avant l'intervention chirurgicale. Remarque: une procédure facultative consiste à implanter estradiol palette dans le dos des animaux pour fournir estradiol supplémentaire. Cela permettra d' accélérer le grossissement des cellules ER + cancer (par exemple, cellules MCF-7) ^9.
2. Anesthésier a 4 - souris âgées de 6 semaines (environ 20 g) avec de la kétamine (80 - 100 mg / kg) et de xylazine (10 -12,5 mg / ml) par injection intrapéritonéale.
3. Confirmer le niveau approprié de la sédation d'une souris de 20 g par pincement de l' orteil et l'observation d'une réduction de 50% de la fréquence respiratoire et rose des muqueuses (par exemple, la peau de l' oreille de la souris et de la peau de la patte). Gardez le contrôle de ces signes vitaux toutes les 15 min pendant la chirurgie. Remarque: Aucun mouvement de l'animal indique que l'animal est suffisamment anesthésié et prêt pour la chirurgie.
4. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
5. Rasez la souris sur le bas-ventre, en particulier la région de l'aine droite où la chirurgie et l'injection seraprend place.
   Note: Ceci est pas nécessaire si la souris nude athymiques sont utilisés.
6. Placez la souris sur le dos, les jambes se propager dans leurs positions naturelles et de coller les orteils au carton de dissection mobile avec du ruban adhésif.
7. Essuyez la région de l'aine droite avec 70% d'éthanol isopropylique imbibés des cotons-tiges stériles, puis avec de la bétadine récurer chirurgicale plusieurs fois.

3. La Veine iliaque commune et Artère Lieu et séparation

1. Faire une incision de la peau de 1,0 - 1,2 cm de long entre le 4 ^e et 5 ^e mamelons dans l'abdomen inférieur droit, en utilisant # 10 carbone lames de scalpels en acier stériles maintenues dans une poignée n ° 3. Ensuite, utilisez un drap chirurgical stérile pour couvrir le corps de l'animal à l'exception du site d'incision.
2. Déplacer l'animal à banc norme top dissection microscope. Utilisez un grossissement de 4X pour injection.
3. 4X sous grossissement du microscope à dissection, insérer une pince de séparation entre émoussées le tissu adipeux et le peritoneum, et pousser les tissus vers l' extérieur sur les deux côtés pour exposer les vaisseaux iliaques et des nerfs (voir Figure 1).
   Remarque: L'artère entre l'aorte de la ligne médiane et la partie inférieure des branches de l'artère est appelée artère iliaque commune. Ceci est le lieu de l'injection.
4. Utilisez une paire de pinces fines droites pour briser le tissu conjonctif (comme une membrane) entre les navires et le nerf, plus près des vaisseaux.
5. Mettez les pinces fines droites à la main gauche. Prenez une paire de pinces fines à angle en utilisant la main droite. Insérez la pince de la main droite en même position où les tissus conjonctifs ont été brisées. Et puis coller la pince de la main droite à travers, sous les navires.
6. Dans le même temps, insérez la pince de la main gauche dans les tissus conjonctifs sur le côté gauche des vaisseaux pour guider la pince de la main droite en passant par.
7. Une fois que la pince de la main droite obtient sous les vaisseaux, essayer de séparer les vaisseaux de la ti environnantessu un peu plus, puis les garder au-dessus de la pince de la main droite.
8. Utilisez une pince de la main gauche pour délivrer la pointe d'une suture 4-0 en soie à la pince de la main droite, puis tirez la suture doucement et lentement à travers sous les vaisseaux. Note: Maintenant , les deux navires de la veine et l' artère communes sont soulevées par la suture (voir la figure 2).

4. Injection et post-injection de soins

1. Préparer les cellules pour l'injection dans un 31 G seringue à insuline. Utiliser 100 ul de suspension cellulaire dans du PBS par injection. Assurez-vous de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour séparer les cellules et éviter l'agrégation de telle sorte que les cellules injectées ne seront pas obstruer et bloquer le flux sanguin.
2. Avec la pince à angle dans la main gauche, placez la pince sous les navires le long de la direction de la suture, puis ouvrez les deux bras de la pince, ayant les navires détenus doucement sur la pince.
   Remarque: L'intervalle entre les deux branches de la pince sera l'iSite njection.
3. Tenez le G aiguille 31 avec 100 suspensions cellulaires ul dans la main droite, avec le biseau de l'aiguille vers le haut, prêt pour l'injection.
4. Insérez l'aiguille dans la lumière de l'artère (sang entrera dans la pointe de l'aiguille). Poussez ensuite la suspension cellulaire lentement pour injecter les cellules. La suspension cellulaire va repousser le sang rouge dans le récipient. Essayez de ne pas briser les vaisseaux ou d'une fuite de la suspension cellulaire sur.
5. Lorsque l'injection est terminée, tirez doucement l'aiguille et maintenez les vaisseaux sur la pince de la main gauche pour arrêter le saignement. Puis arracher la suture.
6. Retirez les pinces de la main gauche, et d'utiliser rapidement un coton-tige pour presser la zone d'incision de l'artère pour arrêter le saignement.
   Remarque: En général, 5-10 min pression continue est suffisante pour arrêter le saignement.
7. Lorsque le saignement arrête, utiliser la colle de peau pour fermer les bords de la peau de la zone de la chirurgie. Faire une marque auriculaire, et vérifier la signalisation pour examiner la répartition des cellules injectées bioluminescence.
   Note: Une injection réussie se traduira par une image similaire à la figure 3.
   1. Vérifiez la signalisation bioluminescence par injection de 100 pi de 15 mg / ml de luciférine dans du PBS à 75 mg / concentration kg souris via le sinus intra-orbitaire.
      1. Pour l'injection intra-orbitaire, mettre les doigts des deux côtés de l'oeil de la souris, utiliser la pression pour faire boule d'oeil légèrement pop hors du cadre de l'oeil, insérez 28 G aiguilles insuline de seringues entre boule d'oeil et le nez, puis pousser lentement seringue pour injecter luciférine .
         Remarque: À la bonne position, l'aiguille doit être en mesure d'atteindre une profondeur de 2 - 3 mm avant de frapper les tissus durs (os).
      2. Placer la souris dans le système d'imagerie pour l'imagerie in vivo de l' animal entier pendant 10-60 secondes à 5 min (voir la figure 3).
         Note: Une procédure facultative est d'implanter estradiol pellet dans le dos des animaux pour fournir estradiol supplémentaire. Cela permettra d' accélérer la croissance des cellules ER + cancer (par exemple, MCF-7cellules) ^15.
8. Laissez la souris sur un coussin chauffant au chaud jusqu'à ce qu'il se réveille. Surveiller le saignement, un gonflement, des signes de déhiscence et de la douleur au cours de la période post-chirurgicale. Mettez les souris dos à la cage avec une couverture analgésique (complément alimentaire carprofin suggéré) donnée pour la gestion de la douleur jusqu'à ce que aucun signe de douleur. Portez une attention particulière et des soins aux animaux pendant 7 jours après la chirurgie.

5. Suivi de croissance métastatique

1. histomorphométrie:
   1. Récolte portant une tumeur des tissus osseux, fixer les os dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, puis décalcifier les pH 7,0 solution d'EDTA 14% pour les 3 - 5 jours et les soumettre à l' inclusion en paraffine comme décrit précédemment ^14.
   2. Section Les tissus osseux paraffine intégrer à l'épaisseur de 3 um et effectuer la méthode histologique standard d'hématoxyline / éosine comme décrit précédemment ^14.
2. ImmunohistochemisEssai:
   1. Objet portant une tumeur osseuse dans la paraffine coulisse pour coloration immunohistochimique à diverses fins ¹⁴ comme décrit précédemment. En bref, MCF7 immunocoloration des cellules cancéreuses par des anticorps anti-GFP et les cellules ostéogéniques immunocoloration (pré-ostéoblastes et les ostéoblastes) par les anticorps anti-Osterix et l'anti-phosphatase alcaline (ALP) des anticorps, respectivement.

Résultats

La figure 1 illustre la localisation anatomique et la relation de l' artère iliaque commune (rouge) et la veine (bleu).

La figure 2 montre la position relative des vaisseaux iliaques et les nerfs en microscopie de dissection. Comme le montre la figure 2A, les vaisseaux et les nerfs sont juste en dessous de la paroi péritonéale et peuvent être révélées après l'incision de la pe...

Discussion

Bien que l'artère iliaque est la cible d'injection pour les cellules cancéreuses, nous recommandons la séparation des deux veine iliaque et l'artère à partir de tissus environnants, et les élevons ensemble comme un paquet. En effet, la veine et l'artère contacter intensivement les uns avec les autres, et la paroi du vaisseau veineux est mince et est facile à briser. Par conséquent, pour une injection réussie, il fait gagner du temps et des efforts pour maintenir les deux navires ensemble, bien que les ce...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatéricin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsine/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 &mu ; Filtre à cellules M	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF avec carprofène  ;	Article contrôlé des soins vétérinaires à BCM		Pour la gestion de la douleur
Buprénorphine  ;	Article contrôlé des soins vétérinaires dans le BCM		Pour la gestion de
la douleur Pastille d’œstradiol	Recherche innovante d’Amérique	SE-121
Kétamine et xylazine	Article contrôlé des soins vétérinaires dans le BCM
Pommade vétérinaire	Article contrôlé des soins vétérinaires dans le BCM		Eviter la sécheresse oculaire
Rasoir	Oster	78005-050	Pour souris à fourrure
Isopropyléthanol	ACROS	67-63-0
Gommage chirurgical à la bétadine	Article contrôlé des soins vétérinaires dans
#10	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	multiple
n° 3	Ted Pella, Inc	541-31	Besoin d’être autoclavé
Champ chirurgical stérile	Technologie	d’infusion SaiPSS-SD1
Pince droite  ;	Instrument chirurgical Roboz	RS-5132	Besoin d’être autoclavé
Pince fine droite	Outils de science fine	11253-20	Besoin d’être autoclavé
Pince fine tranchante	Outils de science fine	11253-25	Besoin d’être autoclavé
4-0 Suture en soie Vicryl	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G Seringues insuline	BD	328418	Plusieurs
cotons-tiges Q-tips (stériles)	VWR International Laboratory	89031-272
Colle pour la peau	Henry Schein Animal Health	31477	Pour la fermeture de la peau du site chirurgical
Applicateur d’étiquettes d’oreille	Outils de science fine	24220-00
Étiquettes d’oreille	Outils scientifiques fins	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Évitez la lumière et mettez sur de la glace
Seringues d’insuline 28 G	BD	329410	Pour l’injection intra-orbitaire
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	Pour la fixation tissulaire
EDTA	OmniPur	4050	Pour la décalcication du tissu osseux
< strong>Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II système d’imagerie	Advanced Molecular Vision
Name	Company	>Catalog Number	Comments
>Antibodies
Antibodies anti-GFP (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix anticorps	Abcam	ab22552