Génération de signalisés et Mutants dans Modèle sans marqueurs cyanobactérielles espèces

Résumé

L’introduction de multiples altérations génomiques dans les cyanobactéries est un outil essentiel dans le développement de souches à des fins industrielles et de recherche fondamentale. Nous décrivons un système de génération de mutants non marqués chez l’espèce cyanobactérienne modèle Synechocystis sp. PCC6803 et de mutants marqués chez Synechococcus sp. PCC7002.

Résumé

Les cyanobactéries sont des organismes écologiquement importants et des plateformes potentielles pour la production de biocarburants et de produits industriels utiles. La manipulation génétique des cyanobactéries, en particulier des organismes modèles tels que Synechocystis sp. PCC6803 et Synechococcus sp. PCC7002, est un outil clé pour la recherche fondamentale et appliquée. La génération de mutants non marqués, par lesquels des altérations chromosomiques sont introduites dans une souche par l’insertion d’une cassette de résistance aux antibiotiques (un fragment d’ADN manipulable contenant un ou plusieurs gènes), suivie d’un retrait ultérieur de cette cassette à l’aide d’un marqueur sélectionnable négatif, est une technique particulièrement puissante. Les mutants non marqués peuvent être manipulés génétiquement à plusieurs reprises, ce qui permet d’introduire autant de modifications que nécessaire dans une souche. De plus, l’absence de gènes codant pour des protéines de résistance aux antibiotiques dans la souche mutée est souhaitable, car elle évite la possibilité d’une « fuite » d’organismes résistants aux antibiotiques dans l’environnement. Cependant, les méthodes détaillées pour les cycles répétés de manipulation génétique des cyanobactéries ne sont pas bien décrites dans la littérature scientifique. Nous fournissons ici une description complète de cette technique, que nous avons utilisée avec succès pour générer des mutants avec des délétions multiples, des mutations ponctuelles au sein d’un gène d’intérêt et l’insertion de nouvelles cassettes de gènes.

Introduction

Les cyanobactéries sont un phylum ancienne et diverse évolutionnaire des bactéries présentes dans presque tous les milieux naturels sur la Terre. Dans les écosystèmes marins , ils sont particulièrement abondants et jouent un rôle clé dans de nombreux cycles de nutriments, ce qui représente environ la moitié de la fixation du carbone ^1, la majorité de l' azote fixation ² et des centaines de millions de tonnes de la production d'hydrocarbures ³ dans les océans chaque année. Chloroplastes, l'organite responsable de la photosynthèse dans les algues et les plantes eucaryotes, sont susceptibles d'avoir évolué à partir d'....

Protocole

1. Préparation de la culture des médias

1. Préparer le milieu BG11 selon Castenholz 1988 ^17.
   1. Préparer des solutions mères de BG11 100x, oligo - éléments et fer stock (tableau 1).
   2. Préparer des solutions séparées de stocks de phosphate, Na ₂ CO ₃ actions, N - [Tris (hydroxyméthyl) méthyl] -2-aminoéthanesulfonique (TES) tampon et NaHCO ₃ (Tableau 1).
   3. Autoclave le phosphate et Na ₂ CO ₃ actions. Filtre-stériliser le tampon TES et NaHCO ₃ avec 0,2 um filtres.
   4. Préparer BG11 en combinant 976 ml d'eau, 10 ml de....

Résultats

La conception du plasmide est essentielle pour le succès de la génération des deux mutants marqués et non marqués. La figure 1 donne un exemple de plasmide A et B utilisées pour générer un mutant de deletion dans les gènes et Synechocystis cpcC1 cpcC2 ^13. Dans chaque cas, les régions flanquantes 5 'et 3' sont à peu près 900-1,000 pb. régions flanquant réduits peuvent être utilisées, bien que le plus petit, nous avons mis à l'essai av.......

Discussion

Les étapes les plus critiques dans la production de mutants non marquées sont: 1) la conception plasmidique soin d'assurer que la région ciblée est modifiée; 2) veiller à ce que les échantillons restent axénique, en particulier lorsqu'elles sont cultivées sur le saccharose; 3) le placage des cellules pour la production mutante marquée sur BG11 transformé d'abord des plaques de gélose dépourvues d'antibiotiques, suivie par l'addition d'agar-agar, plus des antibiotiques 24 heures plus tard; 4) la c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
acide citrique	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	Sigma	331058
CuSO4.5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2.6H2O	Sigma	239267
Citrate d’ammonium ferrique	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
cyanocobalamine	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto	agar BD	214010
Saccharose	Fisher	SUC001
Boîte de Pétri 90 mm triple ventilée	Greiner	633185
0.2 µ ; m filtres	Sartorius	16534
100 ml flacons	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  ; m	Bemis	FIL003
Phusion ADN polymérase haute fidélité  ;	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
Kit de purification d’ADN  ;	MoBio	12100-300
Restriction endonucléases	NEB
T4 ligase	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani broth	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Sulfate de kanamycine	Sigma	60615
Ampicilline	Sigma	A9518
GeneJET plasmide miniprep	kit Thermo Scientific	K0503
14 ml tube à fond rond	BD falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polymérase	Promega	M7805
425-600 µ ; Billes de verre m	Sigma	G8772
Glycérol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Ampoules fluorescentes	Gro-Lux	69
HT multitron photobioréacteur	Infors