Une fibrose soutenue avec dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire conduit à la cirrhose. L’abus d’alcool est l’une des principales causes de maladies graves du foie. Nous avons établi un modèle de foie fibrotique de poisson-zèbre induit par l’éthanol pour étudier les mécanismes et les stratégies de promotion de la régénération des hépatocytes lors de lésions induites par l’alcool.
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Article de méthode
Développement d'un fibrotique du foie Modèle induite de l'éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une fibrose hépatique soutenue avec poursuite de l’accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) entraîne la perte de compétence cellulaire du foie, conduisant à une cirrhose avec dysfonctionnement hépatocellulaire. Parmi les multiples agressions hépatiques, l’abus d’alcool peut entraîner d’importants problèmes de santé, notamment une insuffisance hépatique et un carcinome hépatocellulaire. Néanmoins, l’identité des sources cellulaires endogènes qui régénèrent les hépatocytes en réponse à l’alcool n’a pas été correctement étudiée. De plus, peu d’études ont modélisé efficacement la régénération des hépatocytes sur les lésions induites par l’alcool. Nous avons récemment rapporté l’établissement d’un modèle de foie fibrotique induit par l’éthanol (EtOH) chez le poisson zèbre dans lequel les cellules progénitrices hépatiques (HPC) ont donné naissance à des hépatocytes lors d’une perte presque complète d’hépatocytes en présence d’un stimulus fibrogène. De plus, grâce à des criblages chimiques utilisant ce modèle, nous avons identifié plusieurs petites molécules qui améliorent la régénération des hépatocytes. Nous décrivons ici en détail les procédures pour développer un modèle de foie fibrotique induit par l’EtOH et pour effectuer des criblages chimiques à l’aide de ce modèle chez le poisson zèbre. Ce protocole sera un outil essentiel pour délimiter les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération des hépatocytes dans le foie fibrotique. De plus, ces méthodes faciliteront la découverte potentielle de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies chroniques du foie in vivo.
Introduction
En dépit de la capacité de régénération des hépatocytes remarquable 1, qui sont le principal type de foie de cellules parenchymales, l' insuffisance hépatique chronique affecte cette capacité, conduisant à une cellule progénitrice hépatique (HPC) de régénération -dépendante 2.
Des dommages au foie chronique provient principalement de l' abus d'alcool, le virus de l' hépatite C chronique (VHC) 3 et non-alcoolisées maladie du foie gras (NAFLD) 4. Elle conduit à une fibrose hépatique soutenue, qui est associée à l'accumulation de protéines de matrice extracellulaire (ECM). Persi....
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Protocole
Zebrafish ont été soulevées et élevé en utilisant un protocole standard qui répond aux critères du National Institutes of Health et approuvés par le Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care et utilisation Comité.
1. Préparation des solutions
- Préparer l'eau d'œuf de 20 L (utilisés de façon interchangeable avec «moyen d'embryons ') pour maintenir le poisson zèbre embryonnaire / larvaire. Dissoudre 1,5 g de CaSO 4 et 6 g de sel marin instantané de la mer dans 250 ml d' eau distillée. Verser dans une bonbonne remplie de 20 L d'eau distillée et agiter.
- Préparer 1 L (PTU) solution mère-2-thiou....
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Résultats
La figure 1 montre le développement d'un modèle de foie fibrotique induit EtOH-zebrafish larvaire. Pour optimiser un protocole pour exposer les larves du poisson zèbre, EtOH, nous avons d'abord évalué la toxicité EtOH. 2,5 jours post-fécondation (dpf) larves ont été exposées à une concentration EtOH 1%, 1,5%, ou 2% pendant 24 heures suivie d'une concurrente 24 h EtOH traitement / MTZ. L'exposition à 2% d'EtOH a provoqué une mortalité élevée, tandis qu.......
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Discussion
Nous avons observé HPC à médiation par régénération des hépatocytes dans le foie se rétablissent EtOH / MTZ traités, ce qui suggère que, même en présence d'une quantité importante de protéines de la MEC, notamment le type de collagène fibrillaire, les CAH conservent leur aptitude à se régénérer en hépatocytes. Le MTZ que le traitement n'a pas augmenté le dépôt de protéines ECM de manière significative, alors que le seul traitement EtOH n'a pas induit l' activation du HPC 15. En utilisant le tr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du GTEC (2731336 et 1411318), le NIH (K01DK081351) et la NSF (1.354.837) au SHC Nous remercions Alem Giorgis pour la lecture critique du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Sulfate de calcium hémihydraté (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Pipérazinediethanesulfonic (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N&prime ;,N&prime ; Acide -tétraacétique (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Éthanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldéhyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Métronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phényl-2-thiourée (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoïque ester éthylique (Tricaïne) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Comprimé de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Amresco | E404 | Dissoudre un comprimé avec 100 ml d’eau distillée |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Albumine sérique bovine | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| à faible point de fusion agarose ; | Amresco | BP165 | |
| Bibliothèque de composés de signalisation de cellules souches | Selleck Chemicals | L2100 | 10 ; stock mM dans DMSO |
| ActiProbe-1K Bibliothèque | Timtec | ActiProbe-1K | 10 ; stock mM dans DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissoudre avec le DMSO à 10 ; mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissoudre avec du DMSO à 10 ; Anticorps |
| anti-collagène I | mM Abcam | ab23730 | Utilisation à 1:100 pour l’immunomarquage, réagit avec les poissons |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-lapin IgG (H+L) | Sondes moléculaires | A31573 | Utilisation à 1:200 pour l’immunocoloration |
| Milieux de montage (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Boîte de Pétri | VWR | 25384-088 | |
| 24 puits plaque | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Lame en verre | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Verre de couverture | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Pellicule plastique | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Feuille d’aluminium | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stéréomicroscope | Leica | M80 | |
| Microscope épifluorescent | Leica | M205 FA | |
| Microscope Confocol | Zeiss | LSM700 |
Références
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
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Réimpressions et autorisations
