Article de méthode

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

DOI :

10.3791/54005

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14 juin 2016

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1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 4Cardiovascular Institute, Maine Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici une méthode de visualisation de l’ultrastructure de la matrice extracellulaire dans les tissus cardiaques décellularisés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrose est une composante de toutes les formes de maladies cardiaques, quelle que soit leur étiologie, et bien que de nombreux progrès aient été réalisés dans le domaine de la biologie de la matrice cardiaque, il existe encore des lacunes majeures liées à la façon dont la matrice est formée, à la façon dont le remodelage physiologique et pathologique diffère et, surtout, à la façon dont la dynamique de la matrice pourrait être manipulée pour favoriser la guérison et inhiber la fibrose. Il n’existe actuellement aucune option de traitement pour contrôler, prévenir ou inverser la fibrose cardiaque. Une partie de la raison est probablement la complexité de la formation de cicatrices cardiaques, comme cela se produit après un infarctus du myocarde pour remplacer immédiatement les cardiomyocytes morts ou mourants. La matrice extracellulaire elle-même participe au remodelage en activant les cellules résidentes et aussi en aidant à guider les cellules infiltrantes vers la lésion défunte. La matrice est également une sorte de casier de stockage pour les protéines matricellulaires qui sont cruciales pour le renouvellement normal de la matrice, ainsi que pour la signalisation fibrotique. Il a également été démontré que la matrice joue un rôle électromécanique dans le tissu cardiaque. La plupart des techniques d’évaluation de la fibrose ne sont pas de nature qualitative, mais fournissent plutôt des résultats quantitatifs qui sont utiles pour comparer deux groupes, mais qui ne fournissent pas d’informations relatives à la structure matricielle sous-jacente. Une technique de visualisation de l’ultrastructure de la matrice cardiaque est mise en évidence ici. La microscopie électronique à balayage du tissu cardiaque décellularisé révèle des différences frappantes dans la structure qui pourraient autrement être manquées avec les méthodes de recherche quantitative traditionnelles.

Introduction

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La fibrose perturbe le réseau normal de collagène myocardique, qui est essentiel pour les fonctions mécanistes normales des cardiomyocytes 1,2 ainsi que pour la communication intercellulaire, la signalisation intracellulaire et la survie cellulaire 3. Le développement de la fibrose est un déterminant majeur de la fonction cardiaque, et le remodelage fibrotique de l’interstitium cardiaque résultant de diverses étiologies entraîne une augmentation de la rigidité ventriculaire gauche et une dysfonction diastolique 4. La fibrose myocardique peut également entraîner des arythmies, et que la progression du remodelage fibrotique soit un phénomène général ou local, elle est fortement associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de cardiomyopathie ischémique et non ischémique 5. De même, l’absence de fibrose myocardique est un puissant prédicteur de la récupération fonctionnelle ventriculaire et de la survie à long terme 6.

La caractéristique de la fibrose est le dépôt d’un excès de collagène, qui a la résistance à la traction de l’acier 7 et peut nuire à la fonction cardiomyocytaire à plusieurs niveaux. Les forces mécaniques résultant d’une matrice trop collagénique peuvent entraîner une atrophie des cardiomyocytes 8,9, une rigidité tissulaire passive 10, une rigidité myocardique induite par la contraction tonique 11-13 et une réduction de l’apport d’oxygène à la population restante de cardiomyocytes. Le couplage des jonctions lacunaires des cardiomyocytes et des myoFbs peut également compromettre les caractéristiques électriques du cœur, créant un risque accru de développement d’arythmies 14-16. La fibrose périvasculaire altère la réactivité vasomotrice des artères coronaires intramurales et des artérioles 17 et contribue au rétrécissement luminal qui réduit l’apport d’oxygène et donc la survie des cardiomyocytes 17-22. Un remodelage fibreux et électrique pathogène, émanant d’un site initial de lésion ischémique ou de déséquilibre énergétique, évolue inévitablement vers l’insuffisance cardiaque.

La nécrose des cardiomyocytes initie la réponse fibrotique, et un remodelage fibrotique indésirable ultérieur peut survenir indépendamment de l’étiologie. Trouver un moyen de contrôler la fibrose cardiaque serait cliniquement bénéfique pour le traitement des cardiomyopathies ischémiques et idiopathiques, des cardiopathies hypertensives, de la cardiomyopathie hypertrophique, des cardiopathies valvulaires et des dystrophinopathies 23-42. Quelle que soit la façon dont le processus de la maladie fibrotique commence, les facteurs profibrotiques solubles peuvent traverser l’espace interstitiel et provoquer l’activation des fibroblastes interstitiels et adventiciels à des sites éloignés de la cicatrice fibrotique initiale, créant un effet de cascade qui conduit finalement à l’insuffisance cardiaque. Le scénario optimal serait d’exploiter le processus fibrillogène à l’aide d’un traitement ciblé qui peut être appliqué au cours de la phase hypertrophique compensative de la cardiomyopathie avant qu’elle ne progresse vers une défaillance de la pompe systolique, une insuffisance cardiaque diastolique ou d’autres résultats terminaux. L’objectif ultime serait d’inverser la fibrose afin que les cardiomyocytes morts puissent être remplacés et que la fonction cardiaque soit complètement restaurée.

L’importance de la matrice est largement comprise, mais les méthodes d’étude de la matrice se limitent principalement à des mesures quantitatives des principaux composants structurels, en particulier le collagène, et aux niveaux relatifs des différentes protéines matricielles et matricellulaires. Ce protocole met en évidence une technique rarement utilisée et utile pour évaluer les différences qualitatives dans la matrice cardiaque. Cette technique a été récemment utilisée pour comparer et contraster les différences fondamentales dans les matrices cardiaques de différentes étiologies de maladies cardiaques (dans les explants humains), pour examiner les cœurs de porcs post-infarctus traités avec l’isoforme du facteur de croissance gliale (GGF) de la neuréguline-1β, par rapport aux animaux non traités 43, et pour sonder les différences dans les matrices des tissus cardiaques de mdx souris (un modèle animal couramment utilisé de la dystrophie musculaire de Duchenne) à différents âges et par rapport à des témoins de type sauvage. Cette technique a été introduite pour la première fois par les Drs Caulfield et Borg en 1979 44, mais peu d’études ont depuis utilisé cette puissante technique 45-47, réintroduite ici avec seulement de légères modifications. Cette méthodologie est un outil de recherche précieux, car elle fournit des informations qualitatives sur l’ultrastructure de la matrice extracellulaire qui pourraient autrement être négligées lors de la simple mesure de la teneur en composants de la matrice et/ou du niveau de fibrose.

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Protocole

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Déclaration d' éthique: Les protocoles pour la manipulation des animaux ont été approuvés par le Vanderbilt Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC, protocoles nombre M / 10/117 (porcine) et M / 10/219 (souris) et menées conformément aux normes AAALAC-International. l'utilisation de tissus cardiaques humaines en banque a été approuvé par l'Université Vanderbilt Medical Center IRB (numéro de protocole 100887).

1. Exemple de collecte et de stockage

  1. Faire frais glutaraldéhyde 4% dans un tampon phosphate 0,1 M (PB) solution.
    ATTENTION: glutaraldéhyde est toxique, porter des gants et des travaux dans une hotte.
    1. Faire une solution 0,2 M d'actions de PB, pH 7,4 en utilisant 21,8 g de Na 2 HPO 4 et 6,4 g de NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) à dH 2 O. 1000
    2. Ajouter 400 ul de 50% de glutaraldéhyde à 2,5 ml de solution mère PB et 2,1 ml dH 2 O.
  2. Immerger un morceau (pas plus de 2 cm 2) du tissu dans la solution de glutaraldéhyde à 4%. Nota: Les morceaux plus petits peuvent également être utilisés mais ils doivent être de taille suffisante (pas inférieure à 5 mm 2) pour être facilement visualisés à l'oeil nu, afin de faciliter les étapes ultérieures du protocole.
  3. Incuber à température ambiante pendant 1 heure, puis stocker indéfiniment à 4 ° C.

2. décellularisation du tissu cardiaque

  1. Faire une nouvelle solution aqueuse à 10% de NaOH en utilisant 10 g de NaOH pellets / dH 2 O. 100
    ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures aux alcalis, des gants portent.
  2. Rincer le tissu dans dH 2 O.
  3. Incuber dans une solution de NaOH à 10% à la température ambiante pendant 6 - 10 jours (jusqu'à ce que les changements de tissus provenant de brun rougeâtre à blanc cassé ou blanc).
  4. Rincer à l' dH 2 O jusqu'à ce que le tissu devient transparent.
  5. Immerger le tissu dans de l'acide tannique à 1% pendant 4 heures à la température ambiante. Utiliser 1 ml 5% solution mère par 4 ml dH 2 O.
    ATTENTION: L'acide tanniqueest un puissant irritant, porter des gants.
  6. Rincer à l' dH 2 O nuit.

3. Osmication et Déshydratation du tissu cardiaque (dans des hottes pour la sécurité)

  1. Faire une solution 0,2 M d'actions de tampon de cacodylate de sodium en utilisant cacodylate de sodium 21,4 g, 10,0 g de chlorure de calcium et 450 ml dH 2 O. Mélanger puis ajouter de l' acide chlorhydrique au besoin pour ajuster le pH à 7,4. Qs à 500 ml avec dH 2 O.
    ATTENTION: cacodylate de sodium et de l'acide chlorhydrique sont toxiques, porter des gants et des travaux dans une hotte.
  2. Faites solution mère aqueuse à 2% de tétroxyde d'osmium dans la hotte pour la sécurité en dissolvant 1 g de tétroxyde d' osmium cristal dans 50 ml dH 2 O.
    ATTENTION: tétroxyde Osmium est un danger d'inhalation sévère; fixation vapeur de membranes muqueuses ou des globes oculaires est possible, poignée donc seulement dans la hotte avec des gants. Un garde-boue est recommandé.
  3. Rincer le tissu dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (mélanger la solution de stock 1: 1 avec dH 2 O) pendant 5 min sur la coiffe (ou agitation douce).
  4. Répétez l'étape précédente à deux reprises, pour un total de trois rinçages tampons.
  5. Immergez tissu dans 1% de tétroxyde d'osmium dans 0,1 M tampon cacodylate de sodium (mix cacodylate stock sodium et le stock tétroxyde d'osmium 1: 1) sur la coiffe pendant 1 h.
  6. Rinçage du tissu dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M 3 fois pendant 5 min à chaque fois sur la coiffe.
  7. Rincer le tissu en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% et enfin 100%) pendant 15 min à chaque fois sur la coiffe.

4. Coupe transversale Préparation de la surface pour les SEM

  1. Transfert tissu dans 100% d'éthanol à un plat peu profond de Pétri contenant également 100% d'éthanol.
  2. Tenir deux lames de rasoir très pointus, tels que les méplats des côtés sont en contact les unes avec les autres et les arêtes de coupe transversale pour former deux côtés d'un triangle équilatéral au-dessus de l'échantillon. Pour ce faire, utiliser la main gauche pour placer une lame sur le côté droit de l'échantillon etcoupé vers la gauche. Dans le même temps, utiliser la main droite pour placer la deuxième lame à l'extrême gauche de l'échantillon et la tranche droite. Ainsi, les lames seront glissés les uns contre les autres dans des directions opposées pour faire une seule coupe lisse.
  3. Faites glisser les côtés plats de la lame contre l'autre pour faire une coupe très propre de l'échantillon avec un minimum de distorsion ou de force d'arrachement, exposant de préférence aussi grande surface que possible sans endommager l'échantillon.
  4. Répétez l'opération pour chaque échantillon afin d'exposer les plus propres possibles surfaces de section transversale pour examen dans le SEM.

5. Point critique Séchage (DPC) du tissu cardiaque

  1. Utilisez une spatule ou des pinces pour transférer le tissu sur le support du sèche-point critique (CPD) de l'échantillon, veiller à ce que le tissu reste dans 100% d'éthanol en tout temps. Assurez-vous que le support est immergé dans de l'éthanol et que le transfert est réalisé avec le tissu exposé à l'air pendant pas plus de quelques secondes.
  2. Actionner CPD par nousle manuel er pour terminer 3 purge-and-cycles de remplissage pour remplacer l'éthanol avec du dioxyde de carbone liquide.
  3. Actionner CPD par le manuel de l' utilisateur pour obtenir des points critiques séchage des échantillons et les retourner à la pression atmosphérique avec ventilation contrôlée de CO 2.

6. Montage de Specimens Coeur de tissus pour SEM

  1. Préparer un échantillon MEB pour chaque échantillon, en collant une étiquette autocollante de carbone à la surface supérieure de la fusée d'aluminium.
  2. Avec l'aide d'un stéréomicroscope, respecter scrupuleusement l'échantillon à l'onglet adhésif avec la surface de section transversale d'intérêt vers le haut (loin de l'onglet, visible), et aussi près que possible de parallèle avec le plan de la surface échantillon de moignon. Ne pas sonder ou de toucher la surface d'intérêt.
  3. Casser un applicateur bâton de bois pour obtenir une brosse conique, idéal pour l'application de peinture. Appliquer l'argent ou de la peinture de carbone à la base et les côtés de l'échantillon, pour améliorer l'adhérence au bout.
  4. Prolonger une ligne très mince d'argent ou de carbone peindre jusqu'à un bord de la surface d'intérêt, pour fournir un trajet de charge de la surface d'intérêt à la terre.
  5. Appliquer 2 ou 3 petites taches de peinture d'argent ou de carbone autour du périmètre de la languette de carbone, pour fournir un chemin conducteur à partir de la surface de patte de carbone dans l'embout métallique, et donc à la masse.
  6. Laisser la peinture conductrice à sécher pendant deux heures.
  7. Actionner pulvérisation coucheuse par le manuel de l'utilisateur d'appliquer un revêtement relativement lourd (plage cible de 30 - 40 nm) d'un alliage or-palladium ou de l'or. La chambre de pompe de l'échantillon à environ 0,1 mbar; régler la minuterie à 40 sec. Ouvrir le robinet de Set à 8:00 positions (débit de gaz Argon modérée). Appuyez sur Start pour lancer revêtement par pulvérisation à 30 mA. décharge luminescente Violet doit être visible dans la chambre d'échantillon.

7. SEM L'examen des échantillons de tissus cardiaques

  1. Effectuer microscopie électronique à balayage à relativement basse tension d'accélération pour minimiser l'imagerie problèmes associés à une mauvaise dissipation de charge dans l'échantillon (en charge). condition d'image initiale suggérée sont: 5 kV tension d'accélération, 10 mm distance de travail.
  2. Avec l'aide d'un opérateur expérimenté, emploi a augmenté la distance de travail pour étendre la profondeur de champ dans des conditions d'imagerie nécessitent l'attention de fibres dans de multiples plans focaux, ou des fibres prorogeant pour une longueur considérable dans la dimension z.
    1. Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l'accès à l'interface utilisateur de l'onglet de navigation en haut à droite.
    2. Accédez à l'onglet Coordonnées dans le menu de la scène. Pour augmenter la distance de travail, entrez une valeur supérieure en millimètres pour la coordonnée Z puis cliquez sur le Aller à onglet pour déplacer la platine d'échantillon à la distance de travail est entré.
  3. Avec l'aide d'un opérateur expérimenté, employer spécimen inclinaison et rotation pour positionner la surface d'intérêt orthogonale au faisceau d'électrons. inclinaison supplémentaire de 10 à 30 degrees de cette position peut améliorer l'observation et la documentation de la structure de la matrice.
    1. Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l'interface utilisateur, cliquez et maintenez le bouton droit de la souris, puis faites glisser à gauche ou à droite pour concentrer l'échantillon près de la périphérie du plan de surface préparée d'intérêt, notant la distance de travail focalisé .
    2. Naviguer avec le Manuel Interface utilisateur joystick pour se déplacer près du bord opposé de la surface et répétez le focus. Si la distance de travail ne sont pas à peu près égale à la première position, l'échantillon d'inclinaison pour parvenir à un accord approximatif aux deux endroits en utilisant l'onglet Coordonnées du menu de la scène (voir 7.2) et entrez une valeur d'inclinaison dans le T de coordonnées.
    3. Tournez spécimen quatre-vingt dix degrés (entrer la valeur en R champ Coordinate) et répétez le processus jusqu'à ce que tous les postes sont concentrés à environ la même distance de travail.
      Remarque: la pression variable SEM peut être utilisé pour améliorer la dissipation de chargesi disponible. Vide élevé est le mode de fonctionnement standard pour la microscopie électronique à balayage.

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Résultats

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La technique mise en évidence a été appliquée aux tissus cardiaques à partir d' un donneur de greffe de cœur humain utilisé (Figure 1), les tissus explantées de receveurs de greffe, des cœurs de type sauvage et souris dystrophique (Figure 3), et post-myocardique échantillons cardiaques infarctus d'un porcine modèle de lésion cardiaque (Figure 2). Comme on le voit sur ​​la figure 1, la matrice cardiaque humain est un tiss...

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Discussion

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Cross préparation section de surface est l'étape la plus critique au cours du protocole. Afin de préserver la structure fine, les échantillons déshydratés doivent rester en éthanol à 100% en tout temps jusqu'à introduit dans le processus de séchage au point critique. Par conséquent, le découpage des échantillons pour réaliser des surfaces d'examen EM doivent être effectués alors que les échantillons sont immergés dans de l'éthanol dans un plat peu profond. Il est également essentiel que la surface exposé...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Cette étude a été financée par des subventions des National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB) : K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398.

L’imagerie et le traitement tissulaire (après macération au NaOH) ont été réalisés grâce à l’utilisation de la ressource partagée d’imagerie cellulaire (CISR) du Vanderbilt University Medical Center (VUMC) (soutenue par les subventions NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 et EY08126). Nous sommes particulièrement reconnaissants aux directeurs principaux du CISR de VUMC (Dr Sam Wells et Dr W. Gray (Jay) Jerome) pour leurs précieux conseils techniques et pour avoir fourni de l’espace et des ressources de base dans le but de filmer la technique mise en évidence dans ce document.

Nous tenons à exprimer notre plus profonde gratitude au Dr Yan Ru Su et à Mme Kelsey Tomasek du Laboratoire central de cardiologie pour la recherche translationnelle et clinique de l’Université Vanderbilt pour leur expertise technique et pour la collecte des échantillons de tissus humains utilisés dans cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de calciumMicroscopie électronique Sciences12340100 g
Adhésif au carboneMicroscopie électronique Sciences1266430 g
Languettes adhésives au carboneMicroscopie électronique Sciences77825à commander pour s’adapter aux talons
Lames de rasoir à double tranchant Acier inoxydableTed Pella, Inc121-6250/paquet
Éthanolélectronique Microscopie Sciences15055450 ml
Glutéraldéhyde, solution à 50 %Microscopie électronique Sciences16310EM, distillation purifiée
Acide chlorhydriqueMicroscopie électronique Sciences16760 ou 16770100 ml
Phosphate monosodique NaH2PO4AldrichS9251-250G250 g
Osmium Microscopie électronique tétroxyde Sciences191001 g
Adhésif conducteur d’argentMicroscopie électronique Sciences12686-1515 g
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-AldrichS8045-1KG1 kg
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)Sigma-AldrichS3264-500G500 g
Acide tannique, 5 % Aqueux  ;Microscopie électronique Sciences21702-5500 ml
Cacodylate de sodium trihydratéMicroscopie électronique Sciences12300100 g
Alliage or-palladium ou GoldRefining Systems, Inc.  ;varieselon la marque et le modèle de la machine à vervoir par pulvérisation cathodique
Sécheur à point critiqueMicroscopie électronique Sciences850
Applicateurs en bois ordinaireFisher Scientific23-400-102
Quanta 250 MEB environnementalFEIQ250 MEB
Coucheuse par pulvérisation cathodiqueCressington Scientific Instruments Ltd.Modèle 108
Stubs d’échantillons de MEB en aluminiumMicroscopie électronique Sciences75220-12spécifique au miscroscope

Références

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