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Abstract
Introduction
Protocol
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Discussion
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Acknowledgements
Materials
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Biology

Microscopie électronique à balayage du tissu macéré pour visualiser la matrice extracellulaire

Published: June 14, 2016
doi:
10.3791/54005
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Summary

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Abstract

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Introduction

Fibrosis disrupts the normal myocardial collagen network, which is critical for normal mechanistic functions of cardiomyocytes 1,2 as well as for inter-cellular communication, intracellular signaling, and cell survival 3. The development of fibrosis is a major determinant of cardiac function, and fibrotic remodeling of the cardiac interstitium arising from a variety of etiologies leads to increased left ventricular stiffness and diastolic dysfunction 4. Myocardial fibrosis may also lead to arrhythmias, and whether the progression of fibrotic remodeling is a general or local phenomenon, it is highly associated with a poor prognosis in patients with ischemic and non-ischemic cardiomyopathy 5. Likewise, the absence of myocardial fibrosis is a strong predictor of ventricular functional recovery and long-term survival 6.

The hallmark of fibrosis is the deposition of excess collagen, which has the tensile strength of steel 7 and can adversely affect cardiomyocyte function on multiple levels. Mechanical forces resulting from an excessively collagenous matrix can lead to cardiomyocyte atrophy 8,9, passive tissue stiffness 10, tonic contraction-induced myocardial stiffness 11-13, and reduced delivery of oxygen to the remaining population of cardiomyocytes. Gap junction coupling of cardiomyocytes and myoFbs can also compromise the heart’s electrical characteristics, creating a greater risk for the development of arrhythmias 14-16. Perivascular fibrosis alters vasomotor reactivity of intramural coronary arteries and arterioles 17 and contributes to luminal narrowing that reduces the supply of oxygen and thus the survival of cardiomyocytes 17-22. Pathogenic fibrotic and electrical remodeling, emanating from an initial site of ischemic injury or energy imbalance, inevitably progresses to heart failure.

Cardiomyocyte necrosis initiates the fibrotic response, and subsequent adverse fibrotic remodeling can occur irrespective of etiology. Finding a way to control cardiac fibrosis would be clinically beneficial for the treatment of ischemic and idiopathic cardiomyopathies, hypertensive heart disease, hypertrophic cardiomyopathy, valvular heart disease and dystrophinopathies 23-42. Regardless of how the fibrotic disease process begins, soluble, profibrotic factors can cross the interstitial space and provoke activation of interstitial and adventitial fibroblasts at sites remote to the initial fibrotic scar, creating a cascade effect that ultimately leads to heart failure. The optimum scenario would be to exploit the fibrillogenic process using a targeted therapeutic that can be applied during the compensative hypertrophic stage of cardiomyopathy before it progresses to systolic pump failure, diastolic heart failure, or other end-stage outcomes. The ultimate goal would be to reverse fibrosis so that dead cardiomyocytes can be replaced and heart function restored completely.

The importance of the matrix is widely understood, yet methods to study the matrix are limited mainly to quantitative measurements of major structural components, particularly collagen, and relative levels of different matrix and matricellular proteins. This protocol highlights a rarely used technique that is useful for assessing qualitative differences in the cardiac matrix. This technique has been recently used to compare and contrast fundamental differences in heart matrices from different etiologies of heart disease (in human explants), to examine hearts from post-infarcted pigs treated with the glial growth factor (GGF) isoform of neuregulin-1β, relative to untreated animals 43, and to probe for differences in the matrices of cardiac tissues from mdx mice (a commonly used animal model of Duchenne Muscular Dystrophy) at different ages and compared to wild-type controls. This technique was first introduced by Drs. Caulfield and Borg in 1979 44, but few studies have since employed this powerful technique 45-47, re-introduced here with only slight modification. This methodology is a valuable research tool, because it provides qualitative information about extracellular matrix ultrastructure that might otherwise be overlooked when simply measuring matrix component content and/or level of fibrosis.

Protocol

Déclaration d' éthique: Les protocoles pour la manipulation des animaux ont été approuvés par le Vanderbilt Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC, protocoles nombre M / 10/117 (porcine) et M / 10/219 (souris) et menées conformément aux normes AAALAC-International. l'utilisation de tissus cardiaques humaines en banque a été approuvé par l'Université Vanderbilt Medical Center IRB (numéro de protocole 100887).

1. Exemple de collecte et de stockage

  1. Faire frais glutaraldéhyde 4% dans un tampon phosphate 0,1 M (PB) solution.
    ATTENTION: glutaraldéhyde est toxique, porter des gants et des travaux dans une hotte.
    1. Faire une solution 0,2 M d'actions de PB, pH 7,4 en utilisant 21,8 g de Na 2 HPO 4 et 6,4 g de NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) à dH 2 O. 1000
    2. Ajouter 400 ul de 50% de glutaraldéhyde à 2,5 ml de solution mère PB et 2,1 ml dH 2 O.
  2. Immerger un morceau (pas plus de 2 cm 2) du tissu dans la solution de glutaraldéhyde à 4%. Nota: Les morceaux plus petits peuvent également être utilisés mais ils doivent être de taille suffisante (pas inférieure à 5 mm 2) pour être facilement visualisés à l'oeil nu, afin de faciliter les étapes ultérieures du protocole.
  3. Incuber à température ambiante pendant 1 heure, puis stocker indéfiniment à 4 ° C.

2. décellularisation du tissu cardiaque

  1. Faire une nouvelle solution aqueuse à 10% de NaOH en utilisant 10 g de NaOH pellets / dH 2 O. 100
    ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures aux alcalis, des gants portent.
  2. Rincer le tissu dans dH 2 O.
  3. Incuber dans une solution de NaOH à 10% à la température ambiante pendant 6 – 10 jours (jusqu'à ce que les changements de tissus provenant de brun rougeâtre à blanc cassé ou blanc).
  4. Rincer à l' dH 2 O jusqu'à ce que le tissu devient transparent.
  5. Immerger le tissu dans de l'acide tannique à 1% pendant 4 heures à la température ambiante. Utiliser 1 ml 5% solution mère par 4 ml dH 2 O.
    ATTENTION: L'acide tanniqueest un puissant irritant, porter des gants.
  6. Rincer à l' dH 2 O nuit.

3. Osmication et Déshydratation du tissu cardiaque (dans des hottes pour la sécurité)

  1. Faire une solution 0,2 M d'actions de tampon de cacodylate de sodium en utilisant cacodylate de sodium 21,4 g, 10,0 g de chlorure de calcium et 450 ml dH 2 O. Mélanger puis ajouter de l' acide chlorhydrique au besoin pour ajuster le pH à 7,4. Qs à 500 ml avec dH 2 O.
    ATTENTION: cacodylate de sodium et de l'acide chlorhydrique sont toxiques, porter des gants et des travaux dans une hotte.
  2. Faites solution mère aqueuse à 2% de tétroxyde d'osmium dans la hotte pour la sécurité en dissolvant 1 g de tétroxyde d' osmium cristal dans 50 ml dH 2 O.
    ATTENTION: tétroxyde Osmium est un danger d'inhalation sévère; fixation vapeur de membranes muqueuses ou des globes oculaires est possible, poignée donc seulement dans la hotte avec des gants. Un garde-boue est recommandé.
  3. Rincer le tissu dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (mélanger la solution de stock 1: 1 avec dH <sub> 2 O) pendant 5 min sur la coiffe (ou agitation douce).
  4. Répétez l'étape précédente à deux reprises, pour un total de trois rinçages tampons.
  5. Immergez tissu dans 1% de tétroxyde d'osmium dans 0,1 M tampon cacodylate de sodium (mix cacodylate stock sodium et le stock tétroxyde d'osmium 1: 1) sur la coiffe pendant 1 h.
  6. Rinçage du tissu dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M 3 fois pendant 5 min à chaque fois sur la coiffe.
  7. Rincer le tissu en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% et enfin 100%) pendant 15 min à chaque fois sur la coiffe.

4. Coupe transversale Préparation de la surface pour les SEM

  1. Transfert tissu dans 100% d'éthanol à un plat peu profond de Pétri contenant également 100% d'éthanol.
  2. Tenir deux lames de rasoir très pointus, tels que les méplats des côtés sont en contact les unes avec les autres et les arêtes de coupe transversale pour former deux côtés d'un triangle équilatéral au-dessus de l'échantillon. Pour ce faire, utiliser la main gauche pour placer une lame sur le côté droit de l'échantillon etcoupé vers la gauche. Dans le même temps, utiliser la main droite pour placer la deuxième lame à l'extrême gauche de l'échantillon et la tranche droite. Ainsi, les lames seront glissés les uns contre les autres dans des directions opposées pour faire une seule coupe lisse.
  3. Faites glisser les côtés plats de la lame contre l'autre pour faire une coupe très propre de l'échantillon avec un minimum de distorsion ou de force d'arrachement, exposant de préférence aussi grande surface que possible sans endommager l'échantillon.
  4. Répétez l'opération pour chaque échantillon afin d'exposer les plus propres possibles surfaces de section transversale pour examen dans le SEM.

5. Point critique Séchage (DPC) du tissu cardiaque

  1. Utilisez une spatule ou des pinces pour transférer le tissu sur le support du sèche-point critique (CPD) de l'échantillon, veiller à ce que le tissu reste dans 100% d'éthanol en tout temps. Assurez-vous que le support est immergé dans de l'éthanol et que le transfert est réalisé avec le tissu exposé à l'air pendant pas plus de quelques secondes.
  2. Actionner CPD par nousle manuel er pour terminer 3 purge-and-cycles de remplissage pour remplacer l'éthanol avec du dioxyde de carbone liquide.
  3. Actionner CPD par le manuel de l' utilisateur pour obtenir des points critiques séchage des échantillons et les retourner à la pression atmosphérique avec ventilation contrôlée de CO 2.

6. Montage de Specimens Coeur de tissus pour SEM

  1. Préparer un échantillon MEB pour chaque échantillon, en collant une étiquette autocollante de carbone à la surface supérieure de la fusée d'aluminium.
  2. Avec l'aide d'un stéréomicroscope, respecter scrupuleusement l'échantillon à l'onglet adhésif avec la surface de section transversale d'intérêt vers le haut (loin de l'onglet, visible), et aussi près que possible de parallèle avec le plan de la surface échantillon de moignon. Ne pas sonder ou de toucher la surface d'intérêt.
  3. Casser un applicateur bâton de bois pour obtenir une brosse conique, idéal pour l'application de peinture. Appliquer l'argent ou de la peinture de carbone à la base et les côtés de l'échantillon, pour améliorer l'adhérence au bout.
  4. Prolonger une ligne très mince d'argent ou de carbone peindre jusqu'à un bord de la surface d'intérêt, pour fournir un trajet de charge de la surface d'intérêt à la terre.
  5. Appliquer 2 ou 3 petites taches de peinture d'argent ou de carbone autour du périmètre de la languette de carbone, pour fournir un chemin conducteur à partir de la surface de patte de carbone dans l'embout métallique, et donc à la masse.
  6. Laisser la peinture conductrice à sécher pendant deux heures.
  7. Actionner pulvérisation coucheuse par le manuel de l'utilisateur d'appliquer un revêtement relativement lourd (plage cible de 30 – 40 nm) d'un alliage or-palladium ou de l'or. La chambre de pompe de l'échantillon à environ 0,1 mbar; régler la minuterie à 40 sec. Ouvrir le robinet de Set à 8:00 positions (débit de gaz Argon modérée). Appuyez sur Start pour lancer revêtement par pulvérisation à 30 mA. décharge luminescente Violet doit être visible dans la chambre d'échantillon.

7. SEM L'examen des échantillons de tissus cardiaques

  1. Effectuer microscopie électronique à balayage à relativement basse tension d'accélération pour minimiser l'imagerie problèmes associés à une mauvaise dissipation de charge dans l'échantillon (en charge). condition d'image initiale suggérée sont: 5 kV tension d'accélération, 10 mm distance de travail.
  2. Avec l'aide d'un opérateur expérimenté, emploi a augmenté la distance de travail pour étendre la profondeur de champ dans des conditions d'imagerie nécessitent l'attention de fibres dans de multiples plans focaux, ou des fibres prorogeant pour une longueur considérable dans la dimension z.
    1. Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l'accès à l'interface utilisateur de l'onglet de navigation en haut à droite.
    2. Accédez à l'onglet Coordonnées dans le menu de la scène. Pour augmenter la distance de travail, entrez une valeur supérieure en millimètres pour la coordonnée Z puis cliquez sur le Aller à onglet pour déplacer la platine d'échantillon à la distance de travail est entré.
  3. Avec l'aide d'un opérateur expérimenté, employer spécimen inclinaison et rotation pour positionner la surface d'intérêt orthogonale au faisceau d'électrons. inclinaison supplémentaire de 10 à 30 degrees de cette position peut améliorer l'observation et la documentation de la structure de la matrice.
    1. Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l'interface utilisateur, cliquez et maintenez le bouton droit de la souris, puis faites glisser à gauche ou à droite pour concentrer l'échantillon près de la périphérie du plan de surface préparée d'intérêt, notant la distance de travail focalisé .
    2. Naviguer avec le Manuel Interface utilisateur joystick pour se déplacer près du bord opposé de la surface et répétez le focus. Si la distance de travail ne sont pas à peu près égale à la première position, l'échantillon d'inclinaison pour parvenir à un accord approximatif aux deux endroits en utilisant l'onglet Coordonnées du menu de la scène (voir 7.2) et entrez une valeur d'inclinaison dans le T de coordonnées.
    3. Tournez spécimen quatre-vingt dix degrés (entrer la valeur en R champ Coordinate) et répétez le processus jusqu'à ce que tous les postes sont concentrés à environ la même distance de travail.
      Remarque: la pression variable SEM peut être utilisé pour améliorer la dissipation de chargesi disponible. Vide élevé est le mode de fonctionnement standard pour la microscopie électronique à balayage.

Representative Results

Discussion

Cross préparation section de surface est l'étape la plus critique au cours du protocole. Afin de préserver la structure fine, les échantillons déshydratés doivent rester en éthanol à 100% en tout temps jusqu'à introduit dans le processus de séchage au point critique. Par conséquent, le découpage des échantillons pour réaliser des surfaces d'examen EM doivent être effectués alors que les échantillons sont immergés dans de l'éthanol dans un plat peu profond. Il est également essentiel que la surface exposée ne soit pas touché ou sondé lors des manipulations ultérieures. Aucune modification majeure sont prévues pour l'application de cette technique à d'autres types de tissus pour les observations de matrice similaires, bien que la partie SEM du protocole pourrait nécessiter de base microscopie électronique dépannage sans distinction d'origine échantillon. Images collectées à partir des échantillons fibreux sont sujettes à des artefacts introduits par une mauvaise dissipation responsable ( "charge"). problèmes de charge peuvent généralement être réduites en réduisant la tension d'accélération, ce qui augmente la vitesse de balayage (également appelé temps de séjour) Et en réduisant la taille du spot du faisceau d'électrons. L'intégration de plusieurs balayages recueilli assez rapidement pour éviter les artefacts de charge va produire une image d'un signal comparable à la qualité du bruit sans les artefacts de charge présents dans une unique image de balayage plus lent de qualité supérieure.

Cette technique est par nature qualitative et complète lorsqu'elle est considérée aux côtés des mesures quantitatives (par exemple, le trichrome de Masson ou picoserius coloration rouge, mesure de la teneur en hydroxyproline, la spectrométrie de masse et de RNA-seq) pour déterminer comment les différences structurelles visualisées pourraient être liées à divers états de développement ou de la maladie ainsi. Cependant, en dépit de cette limitation, la méthode est importante au-delà de la fibrose cardiaque spécifiquement, parce que la matrice extracellulaire est une composante essentielle de presque tous les organes du corps. Dans le cœur, la matrice cardiaque fournit un support mécanique critique pour le pompage continu caractérisé par le complexe d'étirement, la torsion, et deformation, qui confère l' entrée optimale et efflux de sang oxygéné et désoxygéné 49 pour les> 2,5 milliards de battements qui se produisent au cours de la durée de vie humaine moyenne. Compte tenu de la très faible capacité de régénération du tissu cardiaque, une matrice dynamique qui peut être remodelé en fonction des besoins contextuels est logique. Avec seulement un léger étirement de l'imagination, on pourrait en déduire qu'il existe des cibles thérapeutiques pour la manipulation de remodelage de la matrice pour améliorer le processus de guérison, tout en limitant la fibrose indésirable. Application de la technique démontrée au minimum met en valeur la sophistication et la beauté de la matrice cardiaque et, ce faisant, souligne encore son importance fonctionnelle.

Alors que la valeur des mesures quantitatives est un principe de base pour l'évaluation de la quasi-totalité des études expérimentales, la technique a mis en évidence ici peut être utilisé pour révéler les variations ultrastructurales qualitatives qui complètent non seulement les mesures de la matrice standardsmais pourrait suggérer des chemins d'enquête alternatives pour comprendre les altérations biochimiques fondamentaux qui mettent en évidence les changements qualitatifs. applications futures attendues de cette technique sont son utilisation dans des modèles de maladies cardiaques et de tissus humains comme un outil complémentaire pour évaluer les changements de la matrice, ainsi que l'utilisation élargie pour étudier d'autres organes pour lesquels des modifications de la matrice sont une composante du processus de la maladie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

Calcium ChlorideElectron Microscopy Sciences12340100 g
Carbon AdhesiveElectron Microscopy Sciences1266430 g
Carbon Adhesive TabsElectron Microscopy Sciences77825order to fit stubs
Double Edge Razor Blades Stainless SteelTed Pella, Inc121-6250/pkg
EthanolElectron Microscopy Sciences15055450 ml
Gluteraldehyde, 50% SolutionElectron Microscopy Sciences16310EM grade, distillation purified
Hydrochloric AcidElectron Microscopy Sciences16760 or 16770100 ml
Monosodium Phosphate NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>Sigma-AldrichS9251-250G250 g
Osmium TetroxideElectron Microscopy Sciences191001 g
Silver Conductive AdhesiveElectron Microscopy Sciences12686-1515 g
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS8045-1KG1 kg
Sodium Phosphate Dibasic (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)Sigma-AldrichS3264-500G500 g
Tannic Acid, 5% Aqueous&nbsp;Electron Microscopy Sciences21702-5500 ml
Trihydrate Sodium CacodylateElectron Microscopy Sciences12300100 g
Gold-palladium Alloy or GoldRefining Systems, Inc.&nbsp;variesspecific to the sputter coater make and model
Critical Point DryerElectron Microscopy Sciences850
Plain Wooden ApplicatorsFisher Scientific23-400-102
Quanta 250 Environmental SEMFEIQ250 SEM
Sputter CoaterCressington Scientific Instruments Ltd.Model 108
Alluminum SEM Sample StubsElectron Microscopy Sciences75220-12specific to the miscroscope
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References

  1. Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
  2. Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
  3. Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
  4. Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
  5. Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
  6. Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
  7. Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
  8. Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
  9. Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
  10. Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
  11. Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
  12. Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
  13. Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
  14. Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
  15. Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
  16. Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias?. Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
  17. Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
  18. Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
  19. Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
  20. Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
  21. Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural (‘small vessel’) coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
  22. Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
  23. Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
  24. Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
  25. Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
  26. Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
  27. de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
  28. Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy–scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
  29. Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
  30. Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
  31. Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
  32. Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
  33. Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
  34. Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
  35. Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
  36. Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
  37. Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
  38. O’Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
  39. Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
  40. Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
  41. Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
  42. Finsterer, J., Stollberger, C. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  43. Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773 (2014).
  44. Caulfield, J. B., Borg, T. K. The collagen network of the heart. Lab Invest. 40, 364-372 (1979).
  45. Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
  46. Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
  47. Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
  48. McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
  49. Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).

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Stephenson, M. K., Lenihan, S., Covarrubias, R., Huttinger, R. M., Gumina, R. J., Sawyer, D. B., Galindo, C. L. Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (112), e54005, doi:10.3791/54005 (2016).
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