Développement et caractérisation de In vitro Microvaisseaux réseau et des mesures quantitatives de l'endothélium [Ca 2+] i Et production d'oxyde nitrique

Summary

Cellules endothéliales primaires de la veine ombilicale humaine (HUVECs) ont été cultivées jusqu’à la confluence au sein d’un dispositif de réseau microfluidique. La jonction cellulaire endothéliale et les distributions de l’actine F ont été illustrées et les changements dans la concentration intracellulaire de calcium et la production d’oxyde nitrique en réponse à l’adénosine triphosphate (ATP) ont été quantifiés en temps réel au niveau cellulaire individuel.

Abstract

Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l' écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire. Bien que le développement de dispositifs microfluidiques a été adopté par les ingénieurs plus de deux décennies, leurs applications biologiques restent limitées. Un modèle in vitro plus physiologiquement pertinents dans des microvaisseaux validées par des applications biologiques est important pour faire avancer le terrain et combler les lacunes entre in vivo et in vitro des études. Ici, nous présentons des procédures détaillées pour le développement du réseau de microvaisseaux cultivées en utilisant un dispositif microfluidique avec une capacité de perfusion à long terme. Nous démontrons également ses applications pour des mesures quantitatives de changements induits par un agoniste de la CE [Ca2 ^+] _i et de l' oxyde nitrique (NO) la production en temps réel en utilisant la microscopie confocale et de fluorescence conventionnelle. Le filet de microvaisseaux formétravail avec perfusion continue a montré des jonctions bien développées entre CEs. la distribution VE-cadhérine était plus proche de celle observée dans les microvaisseaux intacts que monocouches CE statiquement cultivées. ATP-induit des augmentations transitoires CE [Ca2 ^+] _i et la production de NO ont été quantitativement mesurée à des niveaux de cellules individuelles, qui a validé la fonctionnalité des microvaisseaux de culture. Ce dispositif microfluidique permet ECs de croître sous un flux physiologiquement pertinente bien contrôlée, ce qui rend l'environnement de culture cellulaire plus proche de in vivo que dans les cultures, 2D statiques classiques. La conception du réseau de microcanaux est très polyvalent, et le processus de fabrication est simple et reproductible. Le dispositif peut être facilement intégré au système microscopique confocale ou conventionnelle permettant l'imagerie haute résolution. Plus important encore, parce que le réseau de microvaisseaux de culture peut être formé par CEs humaines primaires, cette approche servira comme un outil utile pour étudier commentpathologiquement modifiés composants sanguins à partir d'échantillons de patients affectent CEs humaines et permettent de mieux comprendre les problèmes cliniques. Il peut également être mis au point en tant que plate-forme pour le criblage de médicaments.

Introduction

Les cellules endothéliales (EC) qui tapissent les parois des vaisseaux sanguins in vivo sont constamment exposés à l' écoulement, mais CEs cultivées sont souvent cultivées dans des conditions statiques et présentent un phénotype pro-inflammatoire ^1,2. La technologie microfluidique permet à un fluide régulé avec précision à travers un micro - géométrie contrainte (inférieure au millimètre) , les canaux ^3, ce qui offre la possibilité aux cellules mises en culture, en particulier pour vasculaires endothéliales, de croître sous des conditions d'écoulement désirées. Ces caractéristiques rendent les conditions de culture cellulaire pl....

Protocol

1. microfluidique Fabrication de périphériques

1. Photolithographie standard Fabrication d'un moule SU-8 50 Maître
   1. Nettoyer la tranche de silicium avant centrifugation. Rincez nue tranche de silicium de 2 pouces avec de l'acétone pendant 15 min suivi par l'alcool isopropylique (IPA) pour 15 min. Déshydrater la plaquette en la plaçant sur une plaque chauffante à 150 ° C pendant 1 heure. Après séchage, refroidir la plaquette à température ambiante.
   2. Spin-coat la plaquette de silicium avec SU-8. Ajouter 2 ml SU-8 sur la plaquette. Rampe de la plaquette à 500 tours par minute à une accélération / s 100 rpm pendant 10 s, suivie de 1000 tours par ....

Results

Cette section présente quelques-uns des résultats obtenus avec le réseau de microvaisseaux culture développée avec ce protocole. Le motif de micro - canaux est un réseau de dérivation à trois niveaux (figure 1A). Dans cette conception, un 159 m de large branches en deux 126 um canaux larges, et les branches de canal mère à nouveau en quatre 100 um canaux filles larges. Une simulation numérique 3D a été réalisée pour évaluer les distributions de contraintes de cisaillemen.......

Discussion

Dans cet article, nous présentons des protocoles détaillés pour le développement du réseau de microvaisseaux culture, la caractérisation des jonctions CE et cytosquelette distribution F-actine, et les mesures quantitatives des CE [Ca2 ^+] _i et la production de NO en utilisant un dispositif microfluidique. Le dispositif microfluidique perfusé fournit un modèle in vitro qui permet une simulation proche des in vivo géométries de microvasculaires et des conditions d'écoulemen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Acétone	Fisher Scientific	A929
Poinçon de biopsie	Miltex	33-31 AA
Albumine bovine	MP Biomedicals	810014
Extrait de cerveau bovin (BBE)	Lonza	CC-4098
Recouvrement	Fisher Scientific	12-542C
DAF-2 DA	Calbiochem	251505
Dextran	Sigma-Aldrich	31390
Âne anti-chèvre IgG (H+L) Anticorps secondaires	Life technologies	A-11055
DPBS, sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190-250
DRAQ5 (coloration des noyaux)  ;	Technologie de signalisation cellulaire	4084
Supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Sérum fœtal bovin	Gibco	16000-044
Fibronectine	Gibco	PHE0023
Fluo-4 AM	Life technologies	F-14201
Gélatine de peau porcine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
Gentamicine (50 mg/ml)	Gibco	15750-078
Lamelle en verre	Fisher Scientific	12-548B
Verre Pasteur pippette	VWR	14672
Héparine sel sodique de la muqueuse intestinale porcine	Sigma-Aldrich	H3393-10KU
HEPES Solution saline tamponnée	Lonza	CC-5024
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs)	Lonza	CC-2517
Alcool isopropylique (IPA)	VWR	89125
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-081
Solution de sonnerie de mammifère Ingrédient
NaCl (132 mM)	Fisher Scientific	S671-3
KCl (4.6 mM)	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2 · ; 2H2O (2,0 mM)	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4 · ; 7H2O (1,2 mM)	Fisher Scientific	M63-500
Glucose (5,5 mM)	Fisher Scientific	BP350-1
NaHCO3 (5,0 mM)	Fisher Scientific	S233-500
Sel de Hepes (9,1 mM)	Research Organics	6007H
Acide de Hepes (10,9 mM)	Research Organics	6003H
MCDB 131 Culture Medium Life	technologies	10372-019
Paraformaldéhyde	Microscopie électronique	Sciences 15710
Phalloïdine (coloration à l’actine F)	Sigma-Aldrich	P1951
Phosphate salin tamponné  ;	Life technologies	14040-133
Polydiméthylsiloxane (PDMS)	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Scalpel	Exel Int	29552
Scotch tape	3M	34-8711-3070-3
Plaquette de silicium	VWR	14672
SU-8 photorésine	MicroChem	SU-8 2050 Y111072
SU-8 développeur	MicroChem	Y020100
flacons de culture tissulaire	Sigma-Aldrich	Z707503-100EA
Triton X-100	Chemical Book	T6878
Trypsine Neutralizer solution	Gibco	R-002-100
Trypsine/EDTA Solution (TE)	Gibco	R-001-100
Tubing	Cole-Parmer	Tube de microalésage en PTFE, 0,012 » ID x 0,030 » OD
VE-cadhérine	Santa Cruz Biotechnology	SC-6458
Nom de l’équipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments/DescriptionBiosafety
Capot laminaire	NuAire	NU-425 Classe II, Type A2
Caméra CCD	Hamamatsu	ORCA
Microscope confocal	Leica	TCS SL
Dessiccateur	Bel-Art	F42022
Plaque chauffante	Wenesco	HP-1212
Incubateur	Forma Scientific	3110
Four	Isotemp Barnstead	3608-5
Lithographie banc	Karl Suss	MA6 Lithographie
Microscope optique	Nikon	L200 ND & Diaphod 300
Obturateur pour la caméra CCD	Sutter Instrument	Lambda 10-2
Nettoyeur de plasma	PVA TePla/Harrick plasma	M4L/PDC-32G
Spin coater	Brewer Science	Cee 200X
Système de pompe à seringue	Harvard Appareil	703005
Nom du logiciel	Entreprise	Numéro de catalogue	>Commentaires/Description
Logiciel de CAO	Autodesk	AutoCAD 2015
Logiciel de simulation CFD	COMSOL COMSOL	Multiphysics 4.0.0.982
Acquisition et analyse d’images pour la production NO  ;	Imagerie universelle	Metafluor