Génération de cellules de souris Airway épithéliales ESC dérivés Utilisation décellularisé Lung échafauds

Différenciation dirigée des cellules pluripotentes à la lignée du poumon dépend des événements de signalisation précis dans le microenvironnement ^1,2. En raison de la nature dynamique de ce processus , il a été difficile d'imiter les événements précis de l' organogenèse du poumon in vitro. Des rapports récents ont utilisé des stratégies de restriction de la lignée étape-sage avec le facteur de croissance soluble supplémentation des cultures en deux dimensions pour obtenir une différenciation pulmonaire ^3-8. Dans les protocoles de différenciation étapes, des cellules pluripotentes, si des cellules souches embryonnaires (ESC) ou des cellules souches pluripotentes induites, ont d'abord été différenciées sur la couche de germe endoderme définitif. cellules endodermiques ont ensuite été poussées à l'endoderme sort antérieur et ensuite à des cellules souches pulmonaires, tels que définis par l'expression contenant homéodomaine du facteur de transcription NKX2-1. Ces progéniteurs pulmonaires ont ensuite été différenciées à proximale (voie respiratoire) ou (alvéolaire), les cellules épithéliales pulmonaires distales wie continué facteur de croissance supplémentation. Ces stratégies 2 dimensions ont eu un certain succès dans la génération de cellules épithéliales pulmonaires, mais il y a plusieurs limitations, y compris l'efficacité imprécises, la contamination possible des autres lignées endodermiques, le manque d'un (3D) la structure en 3 dimensions, et dans certains cas, l'utilisation de cultures non définies avec la supplémentation de sérum. Culture de pluripotentes ou cellules différenciées sur des échafauds pulmonaires décellularisé est de plus en plus utilisé comme un test pour évaluer le potentiel de régénération des cellules ensemencées dans la formation de structures épithéliales pulmonaires ^3,5,6,8,9. culture Ces rapports cellules ensemencées sur des échafaudages avec facteur de croissance continue ou la supplémentation en sérum.

le développement du poumon implique la division, la migration, l'expression des gènes et la différenciation des cellules individuelles en réponse aux signaux environnementaux. La matrice extracellulaire (ECM) est un treillis de glycoprotéines qui en plus de fournir un soutien structurel, dirige tissue morphogenèse en intégrant et la régulation de ces processus ^10,11. En utilisant l'échafaudage ECM du poumon comme une plate - forme naturelle pour la culture de l' endoderme pour mieux imiter le poumon milieu de développement in vivo, nous avons généré souches respiratoires cellules épithéliales dérivées de cellules dans un 3D-culture définie de réglage avec une grande efficacité et de reproductibilité.

poumon de rat échafauds ECM ont été générés par décellularisation ainsi que des cellules endodermiques souris ESC dérivées ont été générées et ensuite ensemencés sur ces échafaudages. Double expression de CXCR4 et protéines c-KIT indique une identité de cellule endoderme définitif et les cellules positives pour les deux SOX2 & expression NKX2-1 sont identifiés comme les cellules des voies respiratoires (poumon proximale) progénitrices. Les cellules de l' endoderme définitives ont été cultivées à l' interface air - liquide (ALI) pour un maximum de trois semaines pour produire des cellules épithéliales des voies respiratoires fonctionnels in vitro.

Ce protocole favorise la différenciation de la lignée des poumons de definitiontive endoderme dès 7 jours, observés avec l'émergence de NKX2-1 ⁺ / SOX2 ⁺ début des progéniteurs pulmonaires proximales. Au jour 14 et 21 de la culture des populations de cellules des voies respiratoires épithéliales matures émergent notamment ciliées (TUBB4A ^+), club (SCGB1A1 ⁺⁾ et de base (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ des cellules avec ressemblance morphologique et fonctionnelle à long des voies aériennes souris indigènes. Ce protocole démontre l'importance du microenvironnement 3D matrice pour atteindre la différenciation robuste pour des voies aériennes des cellules épithéliales.

Les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives du Comité de protection des animaux de l'Hôpital pour enfants malades Research Institute.

1. Échafaudages Préparation

1. Décellularisation des poumons
   1. Euthanasier rats Wistar adultes utilisant le CO ₂ chambre. Placez l' animal dans la chambre et commencer à 100% de CO ₂ exposition à un taux de 10-30% du volume de la chambre par minute de remplissage.
      1. Observer animal pour l'inconscience; cela se produira après environ 2-3 min. Si la perte de conscience ne se produit pas dans cette période de temps, vérifier le taux et le joint de la chambre remplir. Après la perte de conscience, d'observer des animaux pour la couleur des yeux fané et le manque de respiration. Si les deux sont observées, maintenir CO ₂ remplissage pendant 1-2 min, puis retirer l' animal de la chambre pour la procédure.
   2. Fixer animal à la surface de dissection en fixant pattes et pattes de derrière, et pulvériser vers le bas de la poitrine et abdomen avec 70% d'éthanol. Accéder au coeur et lungs en ouvrant la cavité thoracique à l'aide d'une incision verticale le long du sternum.
   3. Faire de petites incisions à travers le diaphragme premier à provoquer les poumons de se rétracter, ce qui réduit le risque de perforer les poumons. Ligaturer la veine cave inférieure d'un fil de suture et placer une petite incision dans l'oreillette gauche avec de petits ciseaux de dissection.
   4. En utilisant une préparé seringue de 10 ml avec une aiguille 25 G rempli de solution saline équilibrée de héparinisé Hank (HBSS) (10 UI / ml d'héparine dans du HBSS), commencer la perfusion pulmonaire en insérant l'aiguille dans le ventricule droit pour pousser le tampon à travers la circulation pulmonaire (débit de 2 ml / min). Continuez cette procédure jusqu'à ce que les poumons deviennent blancs et le fluide circulant de l'oreillette gauche soit claire.
   5. Après perfusion, exposer la trachée et Cathétériser avec un cathéter en plastique près du cartilage thyroïde et fixer en place avec une suture.
   6. Installation d'un système de perfusion par gravité en fixant une seringue de 10 ml à un statif et le collier. Retirez et discard piston de la seringue. Fixer le point de remplissage maximal sur la seringue baril à 20 cm au-dessus des poumons. Fixer un robinet d'arrêt à deux voies à l'extrémité de la seringue, et un tube en plastique de temps à l'autre extrémité du robinet d'arrêt pour fournir une solution de décellularisation à la trachée-artère canulée. Verser la solution dans la seringue et laisser la solution pour remplir un tube en plastique attaché et le cathéter.
      1. Le lavage des poumons en remplissant à la capacité pulmonaire totale (environ 12 ml) pendant 1 min et retirer le cathéter en plastique de la trachée, afin de permettre l'écoulement du fluide hors des poumons. Ne pas remplir la seringue plus de 10 ml quand lavaging poumons pour maintenir la pression en dessous de 20 cm de H ₂ O.
   7. Répétition de lavage des poumons huit fois avec une solution de décellularisation, suivie de 10 lavages avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   8. Disséquer la trachée et les poumons libres de la cavité du cou et la poitrine et de retirer de l'animal. Gardez le tissu dans du PBS froid à 4 ° C jusqu'à ce que la préparation de vibratome sectioning.
2. Thick génération de section
   1. Préparer environ 15 ml de 2% et 4% (p / v) d'agarose et suffisamment 6% (p / v) d'agarose pour incorporer tous les lobes en petits blocs rectangulaires. Dissoudre faible poudre d'agarose à point de fusion dans du PBS par micro-ondes. Transférer l'agarose à tubes de 50 ml sur un bloc chauffant et de maintenir une température supérieure à 40 ° C pour éviter la gélification.
   2. Disséquer poumon décellularisé à la fin de chaque bronche lobaire pour détacher chaque lobe (crânienne médiane, l'accessoire, et le lobe caudal droit et le lobe gauche) à l'aide de petits ciseaux. Séchez chaque lobe en utilisant des feuilles absorbantes pour éliminer l'excès de PBS et de placer à l'intérieur de 2% (p / v) d'agarose tandis que sur le bloc chauffant.
   3. Retirez chaque lobe après 5 min de revêtement en agarose, placer dans une boîte de Pétri et laissez la surface gélifier pendant 1 min sur une plaque froide.
   4. Placez délicatement lobes arrière dans 4% (p / v) d'agarose, cool après 5 min, et répéter le revêtement une fois de plus avec les 6% (p / v) d'agarose.
   5. Après co séquentielleCLASSEMENT de chaque lobe, chaque lobe incorporer séparément dans 6% (p / v) d'agarose en utilisant des moules de métal de base avec au moins 3 mm d'agarose entourant le tissu à partir des bords. Orient chaque lobe en utilisant une pince en positionnant le plus grand bord plat du lobe à la surface du moule métallique faisant face à l'expérimentateur. Ce bord sera le côté fixé à la plaque d'échantillon pour vibratome tronçonnage.
   6. Laisser blocs gel sur plaque froide pendant au moins 30 min avant la coupe avec vibratome. blocs de magasins dans une chambre humidifiée jusqu'à 12 heures à 4 ° C avant vibratome sectionner.
   7. Configuration du vibratome en remplissant la chambre sectionnant avec PBS froid ^12. Maintenir la température froide tout au long de la coupe avec le bain de glace environnante. Retirer les blocs de moules en métal et d'utiliser une lame de rasoir pour couper le bas excès d'agarose lobes environnant, tout en gardant environ 3 mm du bord du tissu.
   8. Fixer le tissu au centre de la plaque d'échantillons en utilisant un adhésif, et plonger la plaque en til PBS-chambre remplie de sectionnement. Configuration sectionnant limites sur vibratome en sélectionnant les valeurs de vitesse, d'amplitude, et l'épaisseur suivants respectivement: 0,2 mm / s, 1,85 mm, et 350 um.
      Nota: Les deux sections longitudinale et transversale de l'orientation des lobes sont acceptables.
   9. Section chaque lobe complètement. Les sections coupées manuellement libres à l'aide de petits ciseaux si un article n'a pas été complètement séparée par la lame à la fin de la séquence de la section. Collecter des sections d'échafaudage doucement et rester en PBS sur la glace jusqu'à ce que la prochaine étape.
      Note: Les articles générés comprendront à la fois les zones proximale et distale du poumon et les deux sources peuvent être utilisées pour recellularization; cependant, la plupart de la surface englobera pulmonaire distale.
3. Décontamination des sections d'échafaudage
   1. Transfert 350 microns sections d'échafaudage épais de PBS dans des tubes de microcentrifugation (jusqu'à 30 sections / tubes) et de traiter avec la nucléase (90 U / ml dans PBS) (voir la liste des matériaux) pour les 12 - 24 heures à la température ambiante, surun dispositif de rotation.
   2. À la suite de traitement à la nuclease, les sections de transfert à l'aide de pinces à de nouveaux tubes de microcentrifugation et on traite avec une solution antimicrobienne (200 U / ml de pénicilline et streptomycine 25 pg / ml d'amphotéricine B dans du PBS) dans des conditions stériles pendant 6 heures à la température ambiante, sur un dispositif de rotation.
      Nota: Les échafaudages peuvent être stockés dans une solution antimicrobienne pendant jusqu'à une semaine à 4 ° C avant utilisation.
   3. Après l'étape de décontamination avec une solution antimicrobienne, rincer deux fois avec du PBS échafauds dans des conditions stériles et transférer au sérum milieu de différenciation libre (SFDM) avant l'ensemencement avec des cellules.

2. Préparation des cellules endodermique

1. Definitive Endoderme Induction
   1. Maintenir les lignes souris ESC sous, culture sans sérum sans alimentation- en utilisant des conditions 2i ^13. Démarrez endoderme induction en éliminant les cellules de la culture pluripotentes adhérente par trypsinisation.
   2. Resuspendre les cellules dans SFDM et de semences à une densité de 20 000cellules / ml dans de faibles plaques adhérentes pour trois jours sans changement de support pour permettre la formation EB.
   3. Après trois jours de transférer doucement les EBs dans 50 ml tubes coniques en utilisant une pipette de 10 ml et leur permettre de recueillir au fond pendant 3 min à température ambiante.
   4. Soigneusement médias aspirés et ajouter les médias SFDM frais complétés avec 50 ng / ml activine A.
   5. cellules de semences en arrière sur les basses plaques adhérentes à 1: densité 2 et de la culture pendant trois jours supplémentaires pour parvenir à la différenciation de l'endoderme définitif.
2. l'enrichissement de l'endoderme définitif
   1. Collecter jour 6 EB, dissocier la trypsine et l' étiquette c-KIT et d' expression CXCR4 en utilisant des anticorps fluorescents conjugués ^14.
   2. Cellules Trier marqués en utilisant le tri de cellules activées par fluorescence (FACS) pour l' expression des deux marqueurs pour obtenir une population de endoderme définitif enrichi ^15.

3. Recellularization Setup

1. Interface Air-liquidela configuration de la culture
   1. Transférer chaque section d'échafaudage décellularisé (étape 1.2.9) de SFDM sur une membrane hydrophobe flottant (8 taille des pores um) en utilisant des pinces stériles. Veiller à échafaudage sections sont répartis uniformément sur la membrane.
   2. Préparer 6 ou 12 puits des plaques en remplissant les puits avec 1 ou 0,5 ml de SFDM, respectivement. Placez délicatement les membranes dans des puits, permettant à la membrane de flotter au-dessus des médias, la création d'une installation de culture air-liquide.
2. Ensemencement des échafauds 3D
   1. FACS Après des marqueurs endodermiques définitives (étape 2.2.2) comptent cellules triées en utilisant un hémocytomètre, tournent vers le bas à 400 xg pendant 5 min et remettre en suspension dans SFDM. Remettre en suspension les cellules pour obtenir un volume contenant environ 100 000 cellules / 10 pl / échafaudage.
   2. Pour recellularize échafauds, pipette 10 pi de cellules directement sur chaque section préparée à l'étape 3.1.2.
   3. Remplacer les médias SFDM dans les cultures toutes les 48 heures. Aspirer les anciens médias en maintenant la plaque à une légère inclinaisonpour éviter de perturber la culture. Ajouter lentement SFDM frais à la culture le long du côté du puits pour éviter la submersion de la membrane flottante.
   4. Maintenir les cultures d'air-liquide pour jusqu'à 21 jours pour atteindre la différenciation des cellules ensemencées dans la maturité épithéliums des voies respiratoires.
      Remarque: les sections Recellularized peuvent être traitées pour la coloration des tissus et immunofluorescence (IF) microscopie à tout point de temps au cours de la culture cellulaire ^16.

Comme il est indiqué dans ce protocole, la différenciation robuste de l'endoderme définitif à maturité des voies aériennes cellules épithéliales peuvent être réalisées en utilisant la culture prolongée de cellules ensemencées sur des sections d'échafaudage du poumon décellularisés. Il est recommandé que les échafaudages soient caractérisés décellularisées pour assurer (1) les cellules hôtes sont complètement éliminées, et (2) les protéines de la matrice extracellulaire sont conservés avant d'utiliser les échafaudages de différenciation. Décellularisation peut être évaluée en utilisant une coloration tissulaire avec de l' hématoxyline et de l' éosine (H & E) et de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), comme illustré sur la figure 1A. Fort grossissement au microscope électronique à balayage (MEB) des échafaudages confirme l'absence de cellules hôtes et l' architecture de la matrice intacte, comme illustré sur la figure 1B. Caractérisation supplémentaire du reste échafaudage par des essais de traction et immunocoloration des protéines de la matrice peut être réalisée afin d'assurer PRESEVATion de l'ECM suivant décellularisation 16.

Culture non-adhérente du CES dans SFDM médias pour six jours aboutit à la formation d'agrégats de cellules (EbS) comme illustré sur la figure 2A. Trois jours de activine A résultats du traitement en définitive endoderme induction. Restriction de Lineage de l' ESC à endoderme définitif peut être confirmé par surexpression et l' expression des gènes et des protéines 17 lignée associée endoderme, et ne peut être affirmé morphologiquement. efficacité Endoderme-induction varie de 50-70% en fonction de la ligne ESC utilisée. Des expériences ont été réalisées dans des lignées de souris ESC: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (DsRed -MST) et 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), alors que toutes les données illustrées dans le manuscrit utilise la cellule R1 ligne. Le CXCR4 + / c-KIT positif double + définitif population endoderme est triée comme illustré sur la figure 2B, ensemencéessur échafauds pulmonaires 3D, et cultivées pendant jusqu'à 21 jours à l'interface air-liquide dans SFDM. Il est important de trier et d' enrichir pour endoderme définitif organisation limitée et la différenciation est obtenue avec la culture de cellules unsorted de jour hétérogène 6 EB comme illustré sur la figure 2C. Les structures formées par des cellules triées sur des échafaudages sont pas sans rappeler le développement pulmonaire (jour embryonnaire 13,5) , comme cela est illustré sur la figure 2C-D. Dans notre expérience, une densité de semis de 100.000 cellules triées / échafaudage a donné le meilleur repopulation d'échafaudage.

Différenciation à la lignée du poumon est observée dès 7 jours après la culture de l'échafaudage. Airway cellules progénitrices epitheliales positives pour NKX2-1 et SOX2 sont détectées en utilisant une analyse confocale IF tel qu'illustré à la figure 3A. SOX2 positif, les cellules NKX2-1 négatives sont des cellules endodermiques pluripotentes probables qui ne sont pas différenciés à la li pulmonaireneage. Avec la culture plus ces cellules peuvent commencer à exprimer NKX2-1 ou subir une apoptose sans un soutien adéquat dans le microenvironnement. SI l' analyse du jour 21 cultures révèle une population des voies respiratoires épithéliales matures contenant TUBB4A + cellules ciliées, cellules SCGB1A1 + club et TRP63 + / KRT5 + cellules basales , comme illustré sur la figure 3B. analyse par MEB de la surface de culture de 21 jours révèle la similarité morphologique des cultures dérivées de cellules souches pour les voies respiratoires de souris.

Les deux protéines de matrice isolées (collagène I, le collagène IV, la fibronectine, laminine) , et décellularisés échafauds de rein de rat ont été incapables de favoriser la différenciation de lignées pulmonaires lors ensemencé avec endoderme définitif et mis en culture dans les mêmes conditions que celles décrites ci - dessus 16. Ceci démontre que le micro-environnement 3D créé par échafauds pulmonaire dérivées est distincte de échafauds dérivées de rein de sa capacité à favoriser la différenciation pulmonaire lignée de semenced cellules endodermiques.

Figure 1. technique de décellularisation élimine les composants cellulaires et préserve ECM. (A) H & E (panneau supérieur) et DAPI (panneau inférieur) coloration du tissu pulmonaire naturel et décellularisé montrant l'absence de noyaux suivants décellularisation. Panneau de droite montre des exemples de coupes de tissus de poumons sans décellularisation optimale. Arrowheads montrent les noyaux restants sur échafauds en raison de décellularisation incomplète, soulignant l'importance de l'optimisation de la technique avant recellularization. Barre d'échelle = 25 pm. Images (B) MEB de poumon naturel et décellularisé, montrant l' absence de cellules et la préservation de l' architecture de matrice sur échafauds décellularisés. Barre d' échelle = 10 pm. S'il vous plaît , cliquez icipour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Classé ESC dérivées des résultats de l' endoderme définitif dans recellularization optimal. Corps (A) Jour 6 embryoïdes (EbS) Après trois jours de activine Un traitement pour favoriser la différenciation de l' endoderme définitif. (B) Les ballasts électroniques sont triés par FACS pour l' expression de deux marqueurs de surface CXCR4 et c-kit pour isoler la population endoderme définitif. Cette population sera ensemencée sur échafauds décellularisés. (C) coloration H & E de échafauds recellularized au jour 7 et le jour 21 de la culture. Le panneau de gauche représente organisé, les structures des voies respiratoires comme suit l'ensemencement avec des cellules triées, et le panneau de droite représente les cellules unsorted désorganisés, hautement prolifératives sur échafauds mettant en évidence l'importance du tri des cellules avant recellularization. Échellebar = 30 um. (D) coloration H & E de la journée 13.5 poumons embryonnaires de souris. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. culture prolongée de l' endoderme définitif sur échafauds pulmonaires naturelles dirige la différenciation de cellules épithéliales des voies aériennes. (A) proximaux des cellules progénitrices du poumon (NKX2-1 + / SOX2 de +) sont détectées après sept jours de culture sur échafauds décellularisés. Barre d'échelle = 15 pm. (B) gauche montre l' image matures pseudostratifié cellules épithéliales (CDH1 +) structures bordées par membrane basale protéine laminine sur le côté basal de structures. Centre et à droite montrent des images matures épithéliums des voies respiratoires complets avec des cellules ciliées (TUBB4A de +), club cellules (SCGB1A1 +) et les cellules basales (KRT5 + / TRP63 +). barre d'échelle de l'image de gauche = 30 pm; centre et à droite barre d'échelle d'image = 15 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Il n'y a pas d'intérêts financiers concurrents à déclarer.