Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Summary

Les techniques de clarification optique révolutionnent la façon dont les tissus sont visualisés. Dans ce rapport, nous décrivons les modifications apportées au protocole CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) qui donne des résultats plus cohérents et moins coûteux.

Abstract

Traditionnellement, la visualisation tissulaire nécessitait que le tissu d’intérêt soit sectionné et imagé en série, soumettant chaque section tissulaire à des déformations non linéaires uniques, entravant considérablement la capacité d’une personne à évaluer la morphologie, la distribution et la connectivité cellulaires dans le système nerveux central (SNC). Cependant, les techniques de clarification optique modifient la façon dont les tissus sont visualisés. Ces approches permettent de sonder en profondeur les préparations d’organes intacts, ce qui fournit un aperçu considérable de l’organisation structurelle des tissus en santé et en maladie. Des techniques telles que CLARITY (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) atteignent cet objectif en fournissant une matrice qui lie des biomolécules importantes tout en permettant aux lipides diffusant la lumière de se diffuser librement. L’élimination des lipides, suivie de l’appariement de l’indice de réfraction, rend le tissu transparent et facilement imagé en 3 dimensions (3D). Néanmoins, le nettoyage électrophorétique des tissus (ETC) utilisé dans le protocole CLARITY original peut être difficile à mettre en œuvre avec succès et l’utilisation d’une solution propriétaire d’appariement de l’indice de réfraction rend coûteuse l’utilisation systématique de la technique. Ce rapport démontre la mise en œuvre d’un protocole de clarification optique simple et peu coûteux qui combine la CLARITY passive pour une meilleure intégrité des tissus et le 2,2′-thiodiéthanol (TDE), une solution d’appariement de l’indice de réfraction décrite précédemment.

Introduction

La capacité d’imager des structures neuroanatomiques complètes est extrêmement précieuse pour comprendre le cerveau dans la santé et la maladie. Traditionnellement, l’imagerie 3D nécessitait une section tissulaire pour fournir la résolution axiale et visualiser les structures anatomiques profondes. Cette approche peut produire des ensembles de données à haute résolution, mais nécessite des techniques sophistiquées de reconstruction d’images et demande beaucoup de main-d’œuvre. En conséquence, elle a été limitée à l’imagerie de petits volumes de tissu^1-3. Le sectionnement optique, en revanche, est bien adapté à la création d’images 3D haute résolution de tissus marqués par fluorescence. Étant donné que le sectionnement optique est intrinsèquement tridimensionnel, il ne nécessite pas de calcul approfondi pour produire un volume d’image 3D. Cependant, la diffusion de la lumière et l’opacité des tissus limitent la profondeur à laquelle les tissus peuvent être sectionnés optiquement. La profondeur d’imagerie est limitée à environ 150 μm en microscopie confocale à balayage laser et à moins de 800 μm en microscopie à excitation biphotonique^4-8.

Afin de surmonter ces limitations, plusieurs techniques de clarification optique ont été récemment développées puis affinées pour permettre l’imagerie microscopique profonde de tissus intacts. L’utilisation d’alcool benzylique et de benzoate de benzyle (BABB) pour rendre les tissus fixés transparents a été l’une des premières approches⁹. Cependant, cette approche a été limitée par l’extinction de la fluorescence dans les échantillons et l’élimination incomplète des structures fortement myélinisées¹⁰. Les améliorations de cette technique, telles que l’imagerie 3D des organes clairsemés par solvant (3DISCO), ont conduit à une clarification tissulaire très rapide et complète, mais souffrent toujours d’une perte rapide de signaux fluorescents, en particulier de protéine fluorescente jaune (YFP)¹⁰. Les solutions de clarification à base d’eau, telles que Sca/e¹¹ et SeeDB¹², préservent les signaux fluorescents, mais ne nettoient pas complètement les tissus fortement myélinisés. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) est une nouvelle technologie de nettoyage optique prometteuse qui semble surmonter les limites des solutions de nettoyage à base d’eau précédemment développées¹³. Contrairement à d’autres techniques de clarification optique, le ^CLARITY14 intègre le cerveau dans une matrice poreuse qui assure l’intégrité structurelle des protéines, des acides nucléiques et des petites molécules, tout en laissant les lipides non liés. Les lipides sont ensuite éliminés par électrophorèse, ce qui aboutit à un cerveau optiquement dégagé qui peut être facilement visualisé et tout aussi facilement sondé à l’aide de techniques couramment disponibles.

Le nettoyage des tissus électrophorétiques (ETC) est utilisé pour éliminer les lipides des tissus inclus dans l’hydrogel dans CLARITY, cependant, l’ETC peut être difficile à mettre en œuvre de manière cohérente et les tissus sujets à l’électrophorèse peuvent présenter une distorsion tissulaire, un brunissement, une perte de fluorescence et une réactivité des anticorps. L’élimination passive des lipides évite ces limitations, mais nécessite des temps d’élimination plus longs^{de 15 à 17} heures. Le nettoyage passif permet également de nettoyer un grand nombre d’échantillons en parallèle, car il n’est pas limité par le nombre d’appareils ETC disponibles. La diminution de la concentration de paraformaldéhyde et l’exclusion du bis-acrylamide de l’hydrogel ont entraîné une augmentation considérable de la vitesse de clarification au détriment d’une plus grande expansion tissulaire¹⁶. Des alternatives moins coûteuses à la solution d’appariement de l’indice de réfraction utilisée dans la technique CLARITY originale ont été développées^17-19. Le 2,2'-thiodiéthanol (TDE) est un agent peu coûteux et rapide qui nettoie le cerveau qui inverse une partie de l’expansion tissulaire qui se produit lors de l’élimination des lipides¹⁸. Ce rapport intègre le nettoyage passif des tissus inclus dans l’hydrogel et l’utilisation de TDE comme solution d’appariement de l’indice de réfraction à la technique CLARITY originale pour produire un protocole hautement reproductible et peu coûteux pour le nettoyage optique du système nerveux central de la souris.

Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices. souris THY1-YFP, EGFP et PLP-PV-tdTomato ont été utilisées pour ces expériences, mais toutes les souris exprimant des protéines fluorescentes peuvent être effacées avec succès et imagée.

1. Préparation des tissus

Attention: paraformaldéhyde (PFA) et d'acrylamide sont toxiques et irritants. Effectuer des expériences en utilisant ces réactifs dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).

1. Sacrifiez l'animal dans la chambre de l'euthanasie avec ~ 1 ml de isoflurane jusqu'à ce que la respiration cesse (~ 2 - 3 min).
2. Utiliser une pompe péristaltique à régler ~ 5 ml / min pour perfuser intracardiaque la souris avec une solution de perfusion (tableau 1) à 4 ° C jusqu'à ce que le sang est éliminée des tissus (5-10 min).
3. Changez le perfusat à la solution de fixation (tableau 1)à 4 ° C jusqu'à ce que le cou et la queue ont sensiblement rigidifiée (5 - 10 min).
4. Mettre fin à la perfusion et décapite l'animal. Disséquer soigneusement le cerveau du crâne d'abord retirer le tissu conjonctif entourant le crâne et les os puis en éliminant de la surface ventrale du crâne et en soulevant le cerveau (Figure 1a), comme décrit dans ^20.
   Note: Donnez un soin particulier à la suppression de l'os entourant les lobes flocculonodulaire du cervelet et des bulbes olfactifs.
   1. Disséquer la moelle épinière de la colonne vertébrale en insérant délicatement la pointe d'une amende, ciseaux nette entre la moelle épinière et la colonne vertébrale et en coupant les différents segments de la colonne vertébrale de suite, comme décrit dans ^21.
5. Hemisect le cerveau en le plaçant dans une matrice de cerveau de souris en plastique et la découpe le long de la ligne médiane, avec une lame de matrice.
6. Ajouter chaque hémisphère et la moelle épinière pour séparer 50 ml baignoire centrifugeuse~ es avec 40 ml d' une solution d'hydrogel (tableau 1). De ce point couvercle avant les tubes avec du papier d'aluminium pour protéger les fluorophores pendant toutes les étapes ultérieures.
7. Incuber le tube contenant l'échantillon dans un hydrogel à 4 ° C avec agitation douce (~ 30 tours par minute) pendant 7 jours.

2. Polymérisation

1. Jeter ~ 25 ml d'hydrogel, en conservant l'échantillon et ~ 25 ml d'hydrogel dans le tube de centrifugation.
2. Désoxygéner l'échantillon en retirant le bouchon et placer le tube centrifuge dans un bocal de dessiccateur et reliant le pot à un vide. Appliquer le vide pendant au moins 10 minutes pour permettre aux gaz dissous pour sortir de la solution et former des bulles. Agitez doucement pour déloger les bulles.
3. Remplacer le vide dans le pot de dessiccateur avec 100% de l'azote gazeux plus de 2 - 3 min. Une fois que la pression égalise (une fois la partie supérieure du pot de dessiccateur peut être ouvert), plafonner rapidement le tube pour empêcher la réintroduction de l'oxygène.
4. Polymèreiser l'hydrogel en plaçant le tube contenant l'échantillon dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 heures jusqu'à ce que la polymérisation soit terminée. Hydrogel polymérisé prendra une consistance (figure 1b) analogue à un gel. Remarque: Une petite quantité d'hydrogel non polymérisé dans la partie supérieure est acceptable.
5. Utilisez une spatule pour retirer l'échantillon polymérisé du tube de centrifugeuse, puis couper l'excédent hydrogel de l'échantillon.
6. Retirer l'hydrogel restant en plaçant l'échantillon sur une fibre essuyez libre et en frottant doucement et rouler le tissu sur elle, laissant derrière une mince couche d'hydrogel polymérisé sur l'échantillon.

3. Lipid Removal

Remarque: le tissu Lipid-autorisé est fragile, manipuler avec précaution. Utilisez un filtre cellulaire lors de la vidange du tube pour éviter de perdre l'échantillon. En outre, l'échantillon va gonfler tout au long du processus de compensation, cependant, le gonflement peut être inversée pendant le processus d'adaptation d'indice de réfraction.

Attention: Sodium dodécylsulfate (SDS) et l'acide borique sont irritants. Effectuer des expériences les utilisant dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).

1. Transférer l' échantillon polymérisé à 50 ml tube de centrifugeuse propre et ajouter 45 ml de compensation tampon (tableau 1). Incuber à 45 ° C avec agitation douce par secousses (~ 30 tpm). Changer le tampon quotidien pendant 7 premiers jours en versant hors du tampon de compensation utilisé dans les déchets chimiques et en ajoutant ~ 45 ml de tampon de compensation frais. Gardez les tubes de centrifugeuse contenant les échantillons recouverts de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores.
2. Après les 7 premiers jours, incuber l'échantillon à 40 ° C et l'échange tampon de compensation tous les 2 - 3 jours. Continuer compensation jusqu'à ce que tous les lipides sont solubilisés et le tissu atteint la transparence (figure 1c). Ce sera de 4 - 6 semaines pour un hémisphère du cerveau de la souris et 2 - 4 semaines pour une moelle épinière.
3. Une fois que le tissu est effacé, le transfertéchantillon à un nouveau 50 ml tube de centrifugeuse et laver 4 fois en PBST (tableau 1) à 40 ° C avec agitation douce (~ 30 min) de plus de 24 heures pour éliminer le SDS résiduel.

4. Molecular Coloration

Attention: 4 ', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) est un irritant et toutes les expériences utilisant elle doit être effectuée dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).

1. Transférer l'échantillon à un tube de 15 ml de centrifugeuse propre et remplir avec 1 pg / ml de DAPI dans 1x PBST, pH 7,5. Incuber à température ambiante (TA) pendant 24 h. Gardez les tubes de centrifugeuse contenant les échantillons recouverts de papier d'aluminium pour protéger les fluorophores.
2. Laver 3 fois en PBST à température ambiante pendant au moins 6 h / lavage.

5. Refractive Index Matching

Attention: 2,2'-thiodiéthanol (TDE) est un irritant et des expériences en utilisant ce should être effectuée dans une hotte et d'un équipement de protection individuelle (blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection).

1. Transférer l'échantillon à un tube de 15 ml de centrifugeuse propre et remplir avec 30% (v / v) TDE dans 1x PBS, pH 7,5. Incuber à 40 ° C avec agitation douce (~ 30 rpm) pendant 24 heures.
2. 30% TDE échange avec 63% (v / v) TDE dans 1 x PBS, pH 7,5. Incuber à 40 ° C avec agitation douce pendant 24 heures.
   Remarque: L'échantillon sera reculer à la taille environ d'origine.
3. Sur une surface plane, propre rouler un morceau d'adhésif réutilisable dans un cylindre avec un diamètre uniforme légèrement supérieure à l'épaisseur de l'échantillon.
4. Poser le cylindre adhésif réutilisable dans un cercle ouvert (~ diamètre 25 mm intérieur avec une petite ouverture en haut) sur un verre plat en bas de 40 mm. Si des corrections doivent être apportées, retirer le cylindre du verre et coupé avec une lame de rasoir.
5. Utiliser un embout de pipette p1000 pour créer un joint entre l'adhésif réutilisable et le verre parrouler sur le pourtour extérieur du cylindre.
6. Lieu ~ 100 ul 63% TDE sur le plat en verre et se répandre pour couvrir la surface du verre dans le cercle d'adhésif réutilisable.
7. Avec une spatule, placer soigneusement l'échantillon dans le milieu du cercle, en prenant soin de ne pas former des bulles.
8. Pipeter autre 100 ul de 63% TDE directement sur l'échantillon, puis placer immédiatement une circulaire couvercle en verre de 40 mm sur l'adhésif réutilisable.
9. Utilisation de l'index, le majeur et l'annulaire des deux mains, appuyez avec précaution sur le pourtour du cercle jusqu'à ce que le verre de couverture a pris contact avec l'échantillon.
10. Ramenez lentement le plat de fond de verre pour une position verticale en appui sur une surface, puis ajouter 63% TDE avec une pipette jusqu'à ce que la solution atteigne la petite ouverture en haut. Utilisez un charpie essuyez libre pour sécher la pointe de la pipette de sorte que la solution ne coule pas sur le verre. Pour éviter les bulles dans la chambre, jamais vider la pipette tout le chemin.
11. Àla petite ouverture, ajouter élastomère de silicone pour enfermer le cercle et créer une chambre fermée. Attendre 5 minutes pour sécher avant de l'imagerie.

6. Microscopie

Attention: Les lasers utilisés dans confocal, seule illumination d'avion et la microscopie nappe de lumière sont très puissant et peut provoquer la cécité. Les expériences utilisant des lasers doivent être effectués après une formation approfondie et avec une grande prudence et une protection oculaire appropriée.

1. Placer la chambre d'imagerie à l'intérieur de l'échantillon sur la platine d'un microscope à balayage laser confocal.
2. Ouvrez le logiciel d'imagerie (voir le tableau des matériaux). Pour activer le laser argon d'excitation, cliquez sur l'onglet de configuration en haut du programme puis sur l'icône de laser. Cochez la case à côté de l'argon pour alimenter le laser et déplacer l'échelle de diapositives à 30%. Observez le pointeur se réchauffer lentement jusqu'à la position sélectionnée.
   1. Retour à l'onglet acquérir au sommet. Dans la grande boîte "faisceau Réglages Chemin &# 34; aller à la charge / enregistrer boîte réglage et sélectionnez le menu déroulant pour sélectionner un canal de longueur d'onde appropriée à l'image YFP (527 nm).
3. Sélectionnez des objectifs appropriés pour l'imagerie en plaçant le lien hypertexte rouge marqué «objectif: objet courant" sous la boîte des paramètres de canal. En cliquant sur l'onglet ouvre tous les objectifs disponibles et une sélection sera automatiquement tourner la tourelle.
   1. Utiliser des objectifs (par ex., 10X) avec une grande distance de travail (supérieure à l'épaisseur du tissu à imager, par exemple 11 mm) et une grande ouverture numérique (par ex., 0,3) afin de maximiser dans le plan de résolution d'image et de minimiser l'épaisseur de la section optique.
4. Sur la colonne de gauche de menus déroulants, ouvrez le "XY: résolution" fenêtre pour définir la matrice d'acquisition, appelé "format", à 1.024 x 1.024 ou une valeur appropriée pour la limite de résolution latérale de l'objectif. Réglez le facteur de zoom aussi bas que possible (par exemple., 1.7).
5. Dans la même fenêtre, réglez 8 moyenne de ligne et 1 cadre paramètres moyens en laissant tomber les menus étiquetés individuellement en conséquence. Utilisez de grandes valeurs pour un rapport signal-bruit et de petites valeurs pour l'acquisition rapide.
   Note: 8 moyennes de ligne et 1 moyenne de trame vont acquérir des images de haute qualité d'un hémisphère du cerveau de la souris dans environ 4 heures.
6. Repérez l'échantillon en utilisant les commandes de scène. Une fois un champ représentatif est visible, régler le gain et l'offset.
   Remarque: Le gain et le décalage varie considérablement en fonction du type de tissu, des fluorophores et / ou caractéristique anatomique imagée. Pour YFP, définir des valeurs 760-780 pour le gain et de -1,0 à -1,5 pour le décalage.
7. Sélectionnez "scan de tuiles" et sélectionnez les limites de la région d'intérêt. Définissez les limites supérieure et inférieure de la z-stack à acquérir. Régler l'épaisseur de la coupe optique sur la base de l'article optique limite de résolution de l'objectif.
   Note: Un objectif deoptique limite la section de résolution est définie principalement par son ouverture numérique. La plupart des logiciels de contrôle de microscope calcule automatiquement une valeur appropriée pour l'objectif utilisé. Pour un objectif 10X avec une ouverture numérique de 0,3 qui serait d'environ 11 um.
8. Lancement de l'acquisition.
   Remarque: Cette opération peut prendre plusieurs heures.
9. Collecter des images haute résolution en utilisant des objectifs de grossissement plus élevé des régions d'intérêt spécifiques.

Results

Visualiser l'organisation structurelle du cerveau est essentielle pour comprendre comment la morphologie et la connectivité affectent le fonctionnement du cerveau dans la santé et la maladie. techniques de compensation optiques permettent aux populations de cellules d'image en 3D dans des tissus intacts, ce qui nous permet d'étudier la morphologie et de la connectivité cohésive.

Les souris qui expriment des protéines fluoresce...

Discussion

compensation passive de tissus d'hydrogel incorporé (CLARITY passive) est une méthode simple et peu coûteuse pour la compensation de gros morceaux de tissu. Cette approche ne nécessite pas de matériel dédié et peut facilement être réalisé dans un agitateur à température contrôlée. En l'espace de quelques semaines, même les grandes, les tissus fortement myélinisées, comme un cerveau entier ou de la moelle épinière, deviendront transparents et adaptés pour la microscopie. Même si ce rapport a mis l'accent sur ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher	BP399-1	tampons 32
% paraformaldéhyde (PFA)	Microscopie électronique Sciences	15714-5	perfusion et hydrogel
2,2'-thiodiéthanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	solution d’adaptation de l’indice de réfraction
40 % acrylamide	Bio-Rad	161-0140	hydrogel
2 % bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142	hydrogel
VA-044 initiateur	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	hydrogel
Acide borique	Sigma-Aldrich	B7901	tampon d’élimination
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Fisher	BP166-5	Tampon
d’élimination hydroxyde de sodium	Fisher	55255-1	tampons
d’azoture de sodium	Sigma-Aldrich	52002-100G	conservateur
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	tampons
Héparine	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	perfusion
Nitrate de sodium	Fisher	BP360-500	perfusion
DAPI	Sondes moléculaires	D1306	coloration nucléaire
99,9 % isoflurane	Phoenix	57319-559-06	anesthésique
Acide hydrocholorique	Fisher	A1445-500	tampons
Plat à fond en verre	Willco	HBSB-5040	Plats Willco
Adhésif réutilisable	Bostick	371351	Blu-Tack
Élastomère de silicium	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Lingette non pelucheuse	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Matrice cérébrale de souris	Roboz	SA-2175	sectionner le tissu
Lames matricielles	Roboz	RS-9887	sectionnement du tissu
Pompe péristaltique	Cole-Parmer	77122-24	pefusion
Microscope confocal à balayage laser	Microscopie	Leica	SP5
Logiciel d’imagerie	Microscopie	Leica	LAS AF