Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

8.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/54026

⸱

9 juin 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

Dans cet article

Résumé

Les xénogreffes de glioblastome multiforme dérivées de patients peuvent être miniaturisées en microtumeurs vivantes à l’aide d’un système de culture de biogel humain 3D. Ce test tumoral 3D in vivo est adapté aux tests de réponse aux médicaments et au profilage moléculaire, y compris l’analyse kinomique.

Résumé

L’utilisation de xénogreffes dérivées de patients pour modéliser les cancers a fourni des informations importantes sur la biologie du cancer et la réponse aux médicaments. Cependant, ils prennent du temps, coûtent cher et demandent beaucoup de main-d’œuvre. Pour surmonter ces obstacles, de nombreux groupes de recherche se sont tournés vers des cultures sphéroïdes de cellules cancéreuses. Bien qu’utiles, les sphéroïdes tumoraux ou les agrégats ne reproduisent pas les interactions cellule-matrice telles qu’elles sont observées in vivo. En tant que telles, les approches de culture tridimensionnelles (3D) utilisant un échafaudage de matrice extracellulaire fournissent un système de modèle plus réaliste pour l’investigation. À partir de xénogreffes sous-cutanées ou intracrâniennes, le tissu tumoral est dissocié en une suspension cellulaire unique semblable aux neurosphères de cellules souches cancéreuses. Ces cellules sont ensuite intégrées dans une matrice extracellulaire d’origine humaine, le biogel humain 3D, pour générer un grand nombre de microtumeurs. Il est intéressant de noter que les microtumeurs peuvent être cultivées pendant environ un mois avec une viabilité élevée et peuvent être utilisées pour les tests de réponse aux médicaments à l’aide de tests de cytotoxicité standard tels que le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) et l’imagerie de cellules vivantes à l’aide de Calcein-AM. De plus, ils peuvent être analysés par immunohistochimie ou récoltés pour le profilage moléculaire, comme le profilage kinomique à haut débit basé sur une puce, qui est également détaillé ici. Les microtumeurs 3D représentent donc un système de modèle polyvalent à haut débit qui peut reproduire plus fidèlement la biologie tumorale in vivo que les approches traditionnelles.

Introduction

Les tumeurs les plus courantes primaires intracrâniennes cérébrales malignes sont de grade III et astrocytomes de grade IV glioblastome (glioblastome ou GBM). Ces tumeurs offrent un mauvais pronostic avec la médiane de survie d' un an entre 12 - 15 mois avec les thérapies actuelles pour GBM aux États - Unis 1-3. multimodales thérapies comprennent la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, y compris le témozolomide (TMZ) et les agents de la kinase ciblée. la signalisation de la kinase est souvent dérégulé dans la GBM, y compris les sous-ensembles de tumeurs avec une amplification ou des mutations d'activation de la croissance du récepteur du facteur épidermique (EGFR), l'augmentation du Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) de signalisation, l'augmentation de phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K), et tumeur supportant une signalisation à travers l' endothélium vasculaire angiogénique Growth Factor Receptor (VEGFR), ainsi que d' autres kinases entraîné voies 4-6. Current in vitro et in vivo dans des modèles perdent souvent ces altérations représentatives 7. En outre, le profilage génétique n'a pas offert les avantages escomptés qui peuvent refléter le fait que les changements génétiques et épigénétiques ne prédisent pas toujours des changements au niveau de l'activité de la protéine, où la plupart kinase agents de ciblage agissent directement, et où les thérapies avec d'autres mécanismes d'action peuvent agir indirectement.

La ligne traditionnelle de cellules immortalisées qui peut être repiqué ad infinitum a longtemps été la norme pour le dépistage des drogues en raison de leur facilité d'entretien et de reproductibilité. Toutefois, ce modèle souffre d'un environnement de croissance élevé en éléments nutritifs (et artificielle) qui sélectionne les cellules qui diffèrent grandement de la tumeur d'origine en croissance rapide. En tant que tel, il y a eu un intérêt considérable dans le développement de systèmes de modèles plus réalistes qui reflètent un système biologique de la tumeur plus complexe est présent chez le patient. xénogreffes de tumeurs développées directement à partir d'une tumeur primaire développée chez la souris ( "xenoline" xénogreffe dérivé du patient ou PDX) disposide système modèle plus représentatif, en particulier dans le cadre de traitements contre le cancer, comme ils se font sentir de prédire de manière plus fiable succès clinique. 8 Malgré la biologie plus réfléchi, ces modèles sont coûteux et sont difficiles à établir et à maintenir. De plus, ils ne se prêtent pas à des études à haut débit. La nécessité de mieux développer des modèles biologiques qui reflètent plus précisément les altérations moléculaires dans les tumeurs primaires et de profil et tester ces modèles en utilisant des mesures directes de l'activité kinase, pas marqueurs substituts génétiques, est clair.

Il est bien reconnu que , contrairement à deux dimensions (2D) des cultures monocouches, 3D ou modèles d'analyse multicellulaires peuvent fournir plus physiologiquement effets pertinents 9-11. culture 3D commune approches impliquent des microsupports de matrice revêtu et la formation de sphéroïde cellulaire. sphéroïdes de tumeur peuvent être générés via l'agrégation cellulaire en utilisant ballon rotatif, plaque pHEMA et la pendaison des techniques de chute. Limitations de tapproches es comprennent: l'incapacité de certaines cellules pour former des sphéroïdes stables, la variabilité de la croissance et les défis avec les types de cellules mixtes. Sinon, beaucoup synthétique (hydrogel, polymère) et d' origine animale Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrice à partir de sarcomes de souris, le collagène bovin) matrices ont été développés pour la culture 3D études 12-14. Matrice de souris EHS est largement utilisée mais connue pour favoriser la croissance et la différenciation cellulaires in vitro et in vivo 15.

Afin de reproduire la biologie de la tumeur en 3D, un système de biomatrice humain a été développé par le Dr Raj Singh et al. 16. La libre facteur biogel humain naturel, la croissance permet échafauds de culture 3D (perles, disques), qui soutiennent la culture à long terme de plusieurs types de cellules. Une série de 3D biogel humaine conceptions de la culture sont mis en place pour étudier la croissance tumorale, l'adhérence, l'angiogenèse et l'invasion des propriétés. Avantages et propriétés de biogel humaine par rapport à commungels de souris EHS sont résumés dans le tableau 1 et le tableau 2.

La source: Amnios humain (tissus Pooled)
libre Pathogen, IRB-exemptés / approuvés
Nature ECM: Non dénaturé Biogel (GLP-production)
Clé
Composants: 		Col-I (38%), la laminine (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), entactine & HSPG (<3%)
Gratuit GF-: Indétectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (non-angiogénique, non toxique)

Tableau 1: Propriétés de Biogel humain par rapport à EHS Gels communs.

Biogel humain gels EHS
Matrice humaine naturelle Matrice de la souris reconstituée
la croissance et la différenciation cellulaire contrôlée Peut promouvoir la croissance cellulaire et la différenciation
l'expression du gène Physiologic l'expression du gène variable
modèle de culture 3D tissus comme modèle de culture à base Plate-

Tableau 2: Avantages de Biogel humain par rapport à EHS Gels communs.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

NOTE: Toutes les évaluations de thérapie xénogreffes ont été effectuées en utilisant un modèle de tumeur orthotopique pour glioblastome sur un protocole approuvé par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels.

1. Isolement des cellules GBM xénogreffes patients dérivés

  1. Préparation des réactifs
    1. Reconstituer collagénase I dans de l'eau stérile à une concentration de 5 mg / ml et stérile filtre. Magasin à aliquotes de 1 ml à -20 ° C (la concentration finale est de 50 pg / ml dans 100 ml de solution d'enzyme).
    2. Dissoudre 100 pg facteur de croissance épidermique (EGF) dans 2 ml stérile Phosphate-Buffered Saline (PBS). Magasin à 100 ul (5 ug / 100 ul) des aliquotes à -20 ° C pour une concentration finale de 10 ng / ml.
    3. Dissoudre 100 pg de FGF-β dans 2 ml de PBS stérile. Magasin à 100 ul (5 ug / 100 ul) des aliquotes à -20 ° C pour une concentration finale de 10 ng / ml.
    4. Ajouter la bouteille de Neurobasal Med suivant l'une de 500 mlia (NBM) pour préparer complète NBM: 10 ml B-27 sans supplément de vitamine A, 5 ml supplément N2, 100 pi EGF, 100 pi (facteur de croissance des fibroblastes FGF) -BASIC, 5 ml d'amphotéricine B, 0,5 ml de gentamycine, 5 ml L-glutamine.
    5. Préparer une solution fraîche d'enzymes en combinant: 98,5 ml de PBS, 1 ml de collagénase-1, 0,5 ml 10x trypsine / EDTA et stériliser par filtration sur filtre de 0,22 um des pores.
    6. Préparer ou obtenir un petit volume stérile du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) / F12 milieu de culture cellulaire avec 7% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 x PBS sans calcium ni magnésium.
  2. tumeur désagrégation
    REMARQUE: Les souris athymiques nu / nu préalablement injecté des cellules tumorales dans le flanc droit et autorisé à partir d'une masse tumorale palpable est nécessaire pour cette procédure. Dans les exemples présentés ici, nous avons utilisé des cellules xénogreffes GBM patients dérivés, JX10 et JX12 17.
    1. Stériliser zone de travail par pulvérisation chlorhexidine à 2% et mis en place la zone de travail d'esprith instruments nécessaires / fournitures , y compris le mandrin jetable, pinces, scalpel, verre boîte de Pétri, solution d'enzyme, PBS, et la chlorhexidine (voir la figure 2A).
    2. Euthanasier souris / souris hébergeant une tumeur au flanc. Objectif pour une vitesse de déplacement / min de 20% de CO 2 en utilisant 30% de CO 2. Après la souris montre un arrêt respiratoire, maintenir CO 2 flux pendant environ 1 min (typiquement 3 min au total). Les souris sont retirés de la chambre et la dislocation cervicale est réalisée comme une confirmation de l'euthanasie secondaire. Pulvériser l'animal avec 3% de chlorhexidine pour assainir la peau.
    3. Tout en maintenant la souris régulière, faire demi-cercle incision de la peau ~ 1,5 cm de la masse tumorale (flanc implanté de tumeur) à l'aide d'un scalpel jetable stérile avec # 11 lame commençant crânienne à la masse de la tumeur et entaillage vers le ventre de la souris et autour de la extrémité caudale.
    4. Refléter la peau sur la masse tumorale en utilisant les doigts avec une légère traction sur l'extrémité caudale de l'incision, puis appuyez sur la peausurface pour élever la tumeur d'avoir le meilleur accès sans toucher la tumeur (voir la figure 2B).
    5. Utilisez dissection avec une pince à doucement la masse tumorale sans paroi péritonéale et de la peau (voir la figure 2C).
    6. masse tumorale de transfert avec une pince à verre stérile boîte de Pétri (NE PAS utiliser des plats en plastique pour éviter la rupture au cours de hachage) et jetez-carcasse et placer ces instruments de côté.
    7. Utilisez nouvel ensemble d'instruments stériles (scalpel avec # 11 lame, pince semi-courbes) pour débrider le tissu tumoral du tissu nécrotique et hôte membraneuse tissu conjonctif tumeur couvrant.
    8. Placer 15 ml solution enzymatique dans un évent-trypsinisation flacon stérile avec une barre d'agitation et de commencer en remuant lentement dans le capot.
    9. Dans un verre boîte de Pétri stérile, laver les tumeurs récoltées 3 - 5 fois avec du PBS stérile pour éliminer l'excès de sang (peut verser ou utiliser une seringue pour les rincer avec le PBS). Inclinez doucement plat et pipette ou aspirer le matériau de lavage. Hacher finely en utilisant deux lames # 11 de scalpel (voir la figure 2D).
    10. Ajouter 14 ml de solution d'enzyme à une tumeur hachée et pipeter doucement vers le haut et vers le bas 2 - 3 fois. Transférer le mélange aéré-trypsinisation flacon et agiter doucement pendant 20 min. Préparer 5 50 tubes coniques ml en ajoutant 1,5 ml de FBS à chaque afin de neutraliser la trypsine dans l'étape 01.02.11.
    11. Au bout de 20 mn, recueillir 14 ml de solution de cellules de ballon trypsinisation et ajouter à un tube avec du FBS. Ajouter une solution enzymatique 14 ml frais dans le ballon et continuer l'agitation.
    12. Centrifugeuse recueilli les cellules à 150 g pendant 8 min à température ambiante et jeter le surnageant. Ajouter 45 ml de NBM complète au culot, mélanger doucement et répétez centrifugation pour rincer sérum. Re-suspendre le culot dans 5ml NBM complète et maintenez sur la glace.
    13. étapes de récolte de cellules répétées pour un total de 5 récoltes, combinant toutes les cellules récoltées dans un tube conique unique sur la glace.
    14. Placer un tamis cellulaire de 40 pm sur la partie supérieure d'un tube conique de 50 ml. Prep til tamis cellulaire en passant de 10 ml de DMEM / F12 + 7% de FBS à travers et puis lavage avec 10 ml de PBS.
    15. Ajouter lentement la suspension cellulaire à la crépine, ce qui permet dégoutte à travers (voir la figure 2 M). Soulevez délicatement l'onglet de la crépine de cellules entre chaque nouvelle addition à briser tout vide et laisser les cellules en suspension de passer librement (voir la figure 2N).
    16. Centrifuger la suspension cellulaire filtré comme ci-dessus. Re-suspendre dans 10 ml complète NBM et compter pour déterminer le nombre total de cellules viables en utilisant 0,04% de bleu trypan et un hémocytomètre. Tenir les cellules sur la glace jusqu'à ce que la génération de microtumor.

2. Tissue Alternate Protocole Désagrégation

  1. Automated dissociateur des tissus et le système de ventilation.
    1. Placer le tube de ventilation dans le dissociateur cellulaire, sélectionnez le programme "Tumor _02_02" et appuyez sur Start et courir pour 32 sec. tube de transfert à la coiffe, dans 37 ° C incubateur pendant 40 min.
    2. Centrifugeuse suspendue-cellules à 150 g pendant 8 min à température ambiante et jeter le surnageant. Alors que centrifugation des cellules, mettre en place des réactifs pour le traitement de la suspension cellulaire. Ajouter 10 ml NBM sans sérum et suspension doucement triturer.
    3. Après centrifugation, obtenir un culot cellulaire contenant ~ 10 - 30 x 10 6 cellules viables (~ 0,3 ml). Re-suspension le culot dans 10 ml NBM sans sérum (voir Figure 2O). Déterminer les cellules viables par dosage d'exclusion (voir étape 3.2.2).

3. Microtumor Generation

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer complète NBM comme dans 1.1.4 et préparer neutralisé haute densité biogel humaine (HuBiogel) (HDHG à 3 mg / ml) par protocole interne. biogel similaires matrices peuvent aussi bien être utilisés.
  2. Microtumor Production et Culture
    1. Obtenir des cellules PDX fraîchement dissociées que la suspension cellulaire unique complète NBM, sur la glace.
    2. Mélanger la cellule suspension avec un volume égal de solution de bleu trypan (0,4% dans du PBS) et d' analyser en utilisant hématimètre pour déterminer le nombre et la viabilité cellulaire par exclusion du bleu Trypan 18. Retirer le volume nécessaire pour générer 50.000 cellules / microtumor où volume = (50.000 cellules / tumeur * # tumeurs) / (cellules viables compte / 1 ml) et placer dans un nouveau tube conique.
    3. Concentrer les cellules par centrifugation à 150 x g pendant 8 min, à la température ambiante. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire avec une solution de HDHG glacée dans un rapport final de 1 cellules partielles en FBS et 4 parties HDHG.
    4. Utiliser une pipette électronique multicanaux pour distribuer 10 pi par broche cellulaire HDHG mélange sur une plaque d'acier 96 broches (avec un revêtement hydrophobe) pour générer microtumeurs (2 mm perles contenant chacune 50.000 cellules).
    5. Placer des billes à l' intérieur de la tumeur 3D incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% de CO 2, humidifiée) pendant 15 min à gélifier les billes.
    6. Après gélification, transférer les microtumeurs (10 μ; L) à une chambre de culture en suspension sur mesure (50 ml) ou une grande boîte de culture de volume (10 cm) contenant complète NBM utilisant la pipette multi-canal électronique et personnalisé pin-appareil.
    7. Après 1 - 2 jours dans le tissu incubateur de culture, transférer microtumeurs sur des plaques de culture à 96 puits contenant / puits en utilisant une grande bouche de distribution pipette et effectuer divers protocoles d'essai et d'analyse 50 ul NBM.
  3. Traitement de la toxicomanie et l'entretien des microtumeurs
    1. Sélectionnez concentrations finales pour le dépistage des drogues.
      NOTE: Si le médicament a connu une efficacité dans la culture 2D, sélectionnez 2x l'IC 50 comme la concentration de la dose moyenne et sélectionner 3 fois des dilutions en série au- dessus et ci - dessous pour un total de 5 niveaux de dose. Par exemple, si le circuit intégré 50 est de 9 pM pour le médicament dans la culture 2D, sélectionner 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM et 162 uM comme concentration finale pour le dépistage des drogues.
    2. Préparer 2x solution médicamenteuse de dosage en complète NBM de diméthyle sulfoxide (DMSO) stock. Diluer la solution de dosage dans le milieu de DMSO 1% pour préparer une 5 dose, dilution en série 3 fois.
    3. Ajouter 50 ul de solution de dosage à l'microtumor puits contenant 50 ul dans des plaques d'essai pour obtenir une concentration finale en DMSO de 0,5%. Répétez l' opération pour chaque répétition (par exemple, 4) à chaque dose de médicament déterminé 3.3.1.
    4. Maintenir les cultures à 37 ° C, 5% de CO 2, humidifié culture tissulaire incubateur pour 1 - 14 jours. cultures deux fois par semaine en actualisant les médias et la solution de médicament comme ci-dessus nourrir.

4. Morphologique et Analyse phénotypique des microtumeurs

  1. Déterminer la morphologie des cellules dans microtumeurs en utilisant une coloration des cellules vivantes standard.
    1. Préparer 1 mM de calcéine-AM dans le DMSO. Aliquoter et conserver à -20 ° C.
    2. A des intervalles de culture désirées (1, 7 et 14 jours), ajouter la solution calcéine-AM préparée dans du PBS (sans Ca / Mg) à la plaque de 96 puits pour 1 pM concentration finale.
    3. Incuber20 min dans un 37 ° C, 5% de CO 2, incubateur humidifié, et de l' image en utilisant un microscope à fluorescence à 2X, 4X et 10X (excitation: 450-490 nm passe-bande, émission: 515 nm passe long, dichroïque 500 nm) .
  2. Microtumor Croissance / Essai de prolifération
    1. Dissoudre la poudre de MTT dans du PBS (sans Ca / Mg) pour préparer 12 mM. Filtre stérile, aliquote et conserver à -20 ° C.
    2. À des intervalles désirés de culture (1, 7 et 14 jours), ajouter 20 pl de solution de MTT à plaque à 96 puits pour un volume de 100 ul de la culture. Incuber pendant 2 heures dans une culture tissulaire incubateur.
    3. Préparer la solution de lyse fraîche de SDS à 10% dans HCl 0,01 M et ajouter le montant égal au volume de culture sur des plaques. Incuber les plaques scellées nuit à 37 ° C incubateur.
    4. Lire l'absorbance à 570 nm en utilisant un lecteur multi-plaque.
  3. Microtumor Préparation de l'analyse Kinomic
    1. Préparer un tampon de lyse par un pré-refroidissement à 4 ° C, puis en ajoutant un rapport 1: 100 de chaque 100x Protein Phosphatase Inhibitor (PPI) et 100x Protein Inhibiteur de protéase (PI). Bien mélanger et garder sur la glace.
    2. Transfert 2 microtumeurs à chacun des trois tube de 1,5 ml microcentrifugeuse. Retirer le surnageant et ajouter 40 ul de tampon de lyse contenant de l'IPP et PI à chaque tube et lyser pendant 30 min à 4 ° C.
    3. échantillons Pipette vigoureusement pour briser perles tumorales. Centrifugeuse à 16.000 xg pendant 10 min à 4 ° C des échantillons et conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse kinomic.

5. Kinomic profilage des microtumeurs

  1. Protein Tyrosine Kinase (PTK) profilage
    1. Réactifs décongeler (10x Protein Kinase (PK) tampon et 2% de sérum albumine bovine (BSA)) à 4 ° tampon C Charge PK (300 ul 10x PK stock tampon dans 2,7 ml de dH 2 O) dans la seringue en position n ° 2 sur le profilage Plate-forme.
    2. Ouvrez le logiciel de dosage de kinase et de charger le fichier de protocole PTK et appuyez sur "START", annoter échantillons dans softwsont programme après puces de numérisation. Placez les jetons SUR DES plate-forme de profilage et de la charge 25 pi de 2% de sérum albumine bovine (BSA) par baie, puis appuyez sur LOAD pour lancer le protocole logiciel contrôlé étape de blocage.
    3. Diluer 6 uM de 100 mM d' ATP disponible avec 54 ul dH 2 O pour faire 10 mM d'adénosine triphosphate (ATP). Lorsque le logiciel commence le 3 ème, et l' étape de lavage final (visible sur l' écran) apportent 15 pg de lysat amené jusqu'à 28 pi avec dH 2 O, mélanger et ajouter au tableau.
    4. Préparer PTK mélange maître (MM) (pour un maximum de 12 échantillons). Ajouter 32,6 ul dH2Û pour reconstituer le dithiothréitol (DTT) et d' ajouter 6 ul de DTT et 60 pl 10x PK solution, PTK-MM1 tube (contenant déjà 60 ul de 10 x BSA).
    5. Attendez jusqu'à ce que 'Load' invite dans le logiciel d'analyse de kinase apparaît puis ajouter 126 ul de PTK-MM1, additif PTK 60 pi et 60 pi de 10 mM d'ATP à MM2 (contient précédemment aliquoté 4,5 ul d'anticorps PY20 FITC) et mélanger.Ajouter 16 ul de ce maître mix PTK à chaque tube de lysat échantillon et pipette mélange 5 fois.
    6. Assurez-verre de couverture est propre, puis ajouter 35 ul lysat / master mix par baie, fermer le couvercle du carrousel, et appuyez sur la touche LOAD.
  2. Sérine / thréonine kinases (STK) Profilage:
    1. réactifs décongeler (10x tampon PK, 10x STK tampon, et 2% de BSA) à 4 ° C. Tampon de charge PK (300 pl dans 2,7 ml dH 2 0) en position de seringue n ° 1, et un tampon 01:10 STK (300 pl dans 2,7 ml dH 2 0) en position de seringue 2 #.
    2. Ouvrez le logiciel de l'ordinateur de dosage de kinase et de charger le fichier de protocole STK et appuyez sur START, annoter des échantillons dans le programme après puces de numérisation. Placez les jetons SUR DES plate-forme de profilage et de la charge 25 pi de BSA à 2% par baie, puis appuyez sur LOAD pour commencer le protocole étape de blocage commandé par logiciel.
    3. Diluer 6 uM de ATP 100 mM avec 54 ul dH 2 O. Pendant final (3 ème) étape de lavage mélange2 pg de lysat et de mettre à 32,6 pi avec dH 2 O, mélanger et ajouter au tableau.
    4. Faire STK master mix: Ajouter 70 ul 10x PK à STK-MM1 tube (contient 7 pi 100x BSA), puis ajouter 42 ul dH 2 O à STK-MM1 tube.
    5. Attendez jusqu'à ce que 'Load' invite dans le logiciel d'analyse de kinase alors: Ajouter 18 pi 10 mM ATP pour STK-MM1, et ajouter 9 pi MM1 à chaque échantillon lysat. Bien mélanger.
    6. Assurez-verre de couverture est propre et ajouter 35 ul lysat / master mix par baie, fermer le couvercle du carrousel, et appuyez sur LOAD.
    7. Au cours final (3 ème) Wash Etape ajouter un anticorps secondaire 1,05 ul STK-FITC à tube de DMAB (contient 3,03 ul STK mélange d'anticorps primaire), ajouter 39,6 ul AB tampon à DMAB, ajouter 356,0 ul dH 2 O à DMAB, ajouter 30 pi à DMAB à chaque tableau, et appuyez sur LOAD .
  3. Analyse des données Kinomic 19,20
    1. logiciel d'analyse ouverte et charger l'image App Analyse. Select dossier d'images contenant des images du tableau entier et code-barres horodatées pour PTK ou STK données, numéro appariés sélectionnez l'article fichier de configuration de réseau (86312 pour PTK et 87102 pour STK), et la charge précédemment générées réseau annotation de fichiers.
    2. Vérifiez gridding correcte de toutes les images, et exécuter l'exposition Time Scaling App. Comparer statistiquement log2 transformé les valeurs d' exposition / de la pente, et valider avec prélavage courbes cinétiques 19-21.
    3. Exécutez un logiciel de prédiction de kinase en amont pour interroger les profils kinomic modifiées entre les conditions de kinases en amont 22,23.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Nous avons montré que le 3D système de culture de Biogel soutient la croissance à long terme et la fonction des types cellulaires multiples. Dans ce projet de collaboration, xenolines de GBM patients dérivés (PDX) sont utilisés pour produire des centaines de microtumeurs. Les cellules dissociées (3 x 10 5) ou des neurosphères (40 - 50) ont été incorporés dans des perles de biogel (2 mm) et après gélification rapide , ils sont mis en culture dans un bioréacteur personnalisé NB-...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les étapes critiques au sein du protocole portent essentiellement sur microtumor génération, ainsi que dosage des médicaments et de l'entretien. Parce que les perles de microtumor sont fragiles et facilement déchiré, un soin extrême est nécessaire dans les deux stades de développement d'un essai et d'entretien. Si une erreur se produit au cours de l'un de ces procédés, l'interprétation expérimentale peut être compromise, ce qui provoque l'extension ou la répétition inutile des expériences ou même...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

R.S. et R.S.S. sont des employés de Vivo Biosciences. J.C.A. est partiellement financé par l’UAB Kinome Core.

Remerciements

Soutenu par subvention du NIH R21 (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor sentence SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) et le contrat SBIR (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase-I  ;Sigma-AldrichCO130
Trypsine EDTA (10x)Invitrogen15400-054  ;
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 SupplémentLife Technologies17502-0481x concentration finale
B-27 Supplément sans vitamine ALife Technologies12587-0101x concentration finale
Recombinant Human FGF-basicLife TechnologiesPHG026610 ng/ml concentration finale
Recombinant Humain EGFLife TechnologiesPGH031510 ng/ml concentration finale
L-GlutamineCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM concentration finale
FungizoneOmega ScientificFG-702.5 µ ; g/ml concentration finale
Pénicilline StreptomycineOmega ScientificPS-20100 U/ml Pénicilline G, 100 µ ; g/ml Concentration finale de streptomycine
GentamicinLife Technologies15750-06050 ng/ml Concentration finale
MTTLife TechnologiesM6494préparé à 5 mg/ml dans du PBS et filtré stérilement, 1 mg/ml dans
un puits SDSFisherBP166pour tampon de lyse MTT, préparé à 10 % dans 0,01  ; M HCl, 5 % dans
le puits HClFisherA144SI-212pour tampon de lyse MTT, préparé à 0,01 M avec FDS, 5 mM dans le puits
Calcein AMLife TechnologiesC14301 mM dans le stock DMSO, 2  ; et micro ; M dans une solution de coloration PBS, 1  ; et micro ; M dans bien
Halt' s Cocktail d’inhibiteurs de la protéine phosphatase  ;Pierce ThermoScientific78420Rapport 1:100 en MPER  ;
Inhibiteur de la protéase protéase de HaltPierce ThermoScientific87786Rapport 1:100 dans le
réactif d’extraction de protéines de mammifères MPER (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231pour la dissolution de la calcéine AM et des composés
Solution saline tamponnée au phosphate sans Ca/MgLonza17-517Qdilué à 1x avec de l’eau ultra-pure MiliQ et filtré stérilement (pour la culture cellulaire)
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec Ca/MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVdiluée à 1x avec de l’eau ultrapure MiliQ (pour le lavage avant fixation)
Protocoleformol tamponné neutre à 10032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
Hubiogel haute densitéVivo BiosciencesHDHG-5
Inhibiteur de la protéine phosphatase de HaltPierce78420
Inhibiteur de la protéine protéasede Halt Pierce87786
Réactif d’extraction de protéines de mammifères (MPER)Thermo Scientific78501
Puce de profilage de la protéine tyrosine kinase (PTK)PamGene86312
Tampon kinase PTKPamGene36000300 & micro ; l 10x PK de stock tampon en 2,7  ; ml dH2O, numéro de catalogue pour le kit de réactifs
PTK ATPPamGene36000Numéro de catalogue pour le kit de réactifs PTK
PY20- Anticorps conjugués FITCPamGene36000Numéro de catalogue pour le kit de réactifs
PTK AdditifPTK PamGene32114
Tube PTK-MM1 (10x BSA)PamGene36000Numéro de catalogue pour le kit
de réactifs PTKPuce de profilage de la sérine/thréonine kinase (STK)PamGene87102
Tampon de kinase STKPamGene32205Numéro de catalogue du kit de réactifs STK
Mélange d’anticorps primaires STK (tube DMAB)PamGene32205Numéro de catalogue du kit de réactifs STK
Anticorps secondaire conjugué FITCTube PamGene32203
STK-MM1 (100x BSA)PamGene32205Numéro de catalogue du kit de réactifs
STK Tampon d’anticorpsSTK PamGene32205Numéro de catalogue du kit de réactifs STK
Équipement
#11 Lames stérilesFisher3120030
#3 Manches de scalpel stérilesFisher08-913-5
Boîtes de Pétri en verre de 100 mmFisher08-748D
Pince semi-courbéeFisher12-460-318
Fiole de trypsinisationFisher10-042-12B
Agitateur magnétiqueFisher14-490-200
Barre d’agitation 3/4"Fisher14-512-125
Passoire à cellules B-D  ;Fisher#352340
B-D 50 ml Tube à centrifugerFisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 logiciel d’analyse kinomique  ;PamGene
Evolve Logiciel d’applicationPamGene
UpKin (prédiction de la kinase en amont)PamGene
gentleDissociateur MACSMiltenyi Biotec130-093-235
Système de culture cellulaire rotatif (RCCS)SyntheconRCCS-Davec 10 ml de HARV jetable
de  % Logiciel de dosage de la kinase

Références

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Biogel humain 3DCulture de microtumeursX nogreffes d riv es de patientsD sagr gation tumoraleFiltration sur tamis cellulaireImagerie de cellules vivantesEssai MTT
Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.