Article de méthode

L'isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

DOI :

10.3791/54036

⸱

13 juin 2016

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1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Surgery, Tohoku University

Dans cet article

Résumé

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Le liquide biliaire est une source précieuse de vésicules/exosomes extracellulaires qui contiennent des biomarqueurs potentiellement importants. Ce protocole représente une méthode robuste pour isoler les exosomes de la bile humaine en vue d’analyses plus approfondies, y compris le profilage des miARN.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

la recherche de Exosome au cours des trois dernières années, a considérablement étendu le champ vers l'identification et la caractérisation de biomarqueurs et de leurs utilisations thérapeutiques.

Il a été démontré récemment exosomes pour contenir microARN (MIRS). Mirs se sont apparus comme biomarqueurs de valeur à des fins de diagnostic. Comme le prélèvement d'échantillons dans les cliniques et les hôpitaux est très variable, miRNA l'isolement de la bile toute varie considérablement. Pour obtenir des profils de miARN robustes, précis et reproductibles à partir d'échantillons de bile recueillies d'une manière simple nécessité l'élaboration d'un protocole de haute qualité pour isoler et caractériser les exosomes de la bile. Le procédé nécessite plusieurs centrifugations et une étape de filtration par une étape finale d'ultracentrifugation pour sédimenter les exosomes isolés. La microscopie électronique, Western blots, cytométrie en flux et l'analyse optique nanoparticule multi-paramètres, le cas échéant, sont des étapes cruciales de caractérisation pour valider la qualité de l'exosomes. Pour l'isolement des miARN de ces exosomes, Smasher le lysat avec un miARN synthétique non spécifique d'une espèce comme Caenorhabditis elegans, à savoir, Cel-miR-39, est important pour la normalisation de l' efficacité d'extraction d'ARN. L'isolement des exosomes à partir du liquide biliaire suivant cette méthode permet au succès miRNA profilage à partir d'échantillons de bile stockées pendant plusieurs années à -80 ° C.

Introduction

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Comme d' autres fluides biologiques, à savoir, le lait maternel, le plasma ou l' urine, la bile contient exosomes, lipides riches vésicules 1-4. Les exosomes peuvent induire ou altérer les fonctions biologiques dans les cellules réceptrices 5, 6, une forme de communication entre les cellules qui pourraient faire partie de leur fonction normale 4, 7-9. Les exosomes peuvent contenir des espèces miRNA qui peuvent fournir une source précieuse de biomarqueurs pour le diagnostic 10. les profils miARN ont gagné une attention considérable ces dernières années en tant que marqueurs diagnostiques et pronostiques pour une variété de maladies 11-14.

miRNA lui-même peut être trouvé dans les fluides biologiques, peut-être libéré par les cellules mortes et la quantité de cellules de hangar peut être fortement influencée par une maladie sous-jacente. Le profil miRNA des exosomes ne reflète pas nécessairement le profil miRNA de la cellule d'origine 6, 10, 15-17, mais exosomes peut porter des signatures miRNA qui pourraient être caractéristique de la CE parentalell aime une cellule tumorale. Exosomes dérivés de tumeur ont été identifiés dans le plasma de patients atteints d' un adénocarcinome du poumon, le cancer de la prostate et d' autres tumeurs 8, 16, 18.

Le but de cette méthode est l'isolement fiable et robuste des exosomes à partir d'échantillons de bile humaine, largement indépendantes de leurs procédures de traitement antérieur. Il a été développé pour utiliser la bile en tant que source fiable d'ARNmi pour le diagnostic potentiel des maladies du canal biliaire , tels que 19 cholangiocarcinome. Il se compose de plusieurs étapes de centrifugation, à des vitesses croissantes afin d'isoler les exosomes et pourrait être appliquée à d'autres fluides biologiques.

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Protocole

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L'obtention de la bile de patients par cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique (CPRE) nécessite l'approbation d'un protocole d'étude sur des sujets humains par le Institutional Review Board. Tous les travaux présentés ici a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université Johns Hopkins.

1. Exosome Isolation de Bile

  1. Effectuer cholangiopancréatographie rétrograde endoscopique (CPRE). Placer le patient en position couchée et intuber.
    1. Passez un duodénoscope à travers la bouche du patient et l'insérer dans la deuxième partie du duodénum et d'identifier la papille majeure.
    2. Sélectivement canuler la bile conduit commun en insérant une triple lumière sphinctérotome pré-chargé avec un 0,035 pouce (0,9 mm) guidage hydrophile.
    3. Avancer le fil guide sous guidage fluoroscopique du canal hépatique gauche depuis l'occasion, il peut être difficile de différencier le canal cystique du canal hépatique droit, puis avancer lesphinctérotome 5 cm dans le canal biliaire pour acquérir une position stable.
    4. Retirez le fil de guidage, joindre une seringue de 10 ml au port guidage à travers le verrou Luer et aspirer la bile en utilisant 10 ml de pression négative.
    5. Retirer la seringue contenant la bile pour procéder à l'ERCP en réinsérant le fil de guidage et l'injection de l'agent de contraste à travers l'orifice d'injection pour opacifier l'arbre biliaire.
    6. Transférez la bile recueillie dans un tube de 15 ml sur la glace et garder sur la glace jusqu'au moment de passer à l'étape de centrifugation.
      Attention: Porter des gants pour vous et les échantillons protéger! Traiter la bile comme une source potentielle d'infection car il peut contenir de l'hépatite A particules virales!
    7. Conserver l'échantillon (s) sur la glace. Soit passer à l'étape 1.2 ou centrifuger à 500 xg à 4 ° C pendant 10 min, puis congeler à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
      Note: Les échantillons conservés de cette façon depuis plusieurs années ont régulièrement été utilisés avec de bons résultats 19.
  2. Transférer 400 pl de la bile dans un microtube et recueillir les cellules et les débris cellulaires par centrifugation à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Retirer le surnageant par pipetage, transférer dans un tube de microcentrifugation frais et centrifuger l'échantillon (s) à 16.500 xg pendant 20 min à 4 ° C pour effacer le surnageant de plus de débris. Jeter les tubes dans les déchets biologiques dangereux. Vous pouvez également faire tourner les échantillons dans une ultracentrifugeuse à la place.
  4. Recueillir le surnageant et le filtrer dans une enceinte de sécurité biologique avec une seringue à travers un 0,2 um polyéthersulfone (PES) filtre à membrane qui a de bonnes vitesses d'écoulement et faible teneur en protéines de liaison pour éliminer toutes les particules de plus de 200 nm à gauche.
  5. Pipet le surnageant filtré à ultracentrifugation tubes et ajouter PBS de sorte que les tubes sont plus de 2/3. Si les tubes contiennent moins liquide que celui, les tubes s'effondreront pendant la centrifugation! Les tubes peuvent être lavés, autoclavés et réutilisés plusieurs fois.
  6. Pellet les exosomes par ultracentrifugation à 120 000 xg pendant 70 min à 4 ° C. Après que l'aspect de centrifugation à la partie inférieure du tube d'ultracentrifugation pour voir parfois de petites pastilles jaunes; ce sont les exosomes.
  7. Jeter le surnageant par décantation soigneusement et désinfecter les déchets en ajoutant l'eau de Javel à une concentration finale de 10% v / v et laissez reposer pendant 20 min.
  8. Pour les expériences en aval, soit traiter la pastille (s) dans un petit volume de la solution appropriée ( par exemple, radioimmunoprecipitation dosage (RIPA) tampon pour l' isolement des protéines, l' ARN tampon de lyse pour miR isolement) ou remettre en suspension dans 50-150 pi de tampon phosphate une solution saline (PBS) , qui peut être stockée soit à -80 ° C pour une utilisation ultérieure (en temps réel réaction quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) ou l' extraction des protéines , etc.) , ou utilisée pour la caractérisation de la préparation d'exosomes par MET ou une analyse optique des nanoparticules .

2. Identification par ExosomeMicroscopie électronique à transmission (TEM) ou CryoEM

  1. Remettre en suspension les vésicules extracellulaires dans 100 ul de PBS par pipetage. Idéalement, utiliser des exosomes qui ne sont pas stockés à -20 ° C ou -80 ° C, en particulier lors de la réalisation de l'isolement pour la première fois.
  2. Adsorber une partie aliquote de 20 ul (environ 2 ug) à 400 mesh Parlodion grilles de cuivre recouvertes de carbone pendant 2 minutes et laisser sécher à température ambiante.
  3. Fixer le exosomes dans 1% (v / v) glutaraldéhyde (EM-grade) pendant 5 min à température ambiante en plaçant soigneusement gouttes sur la préparation séchée.
  4. Laver les grilles à deux reprises avec de l'eau pendant 5 min, puis le contraste VÉ tache avec de l'acide phosphotungstique à 1% (PTA) pendant 30 secondes.
  5. Acquisition d'images avec un microscope électronique avec une tension d'accélération de 80 kV à partir des grossissements de 20,000X et portant à 100,000X lors de la détermination de la taille des particules.
    Note: D'autres préparations comme la superposition sur 200 cuivre ou de nickel grilles formvar revêtues de carbone maille et contraste coloration like 1% ou 2% d'acétate d'uranyle pendant 10 à 15 minutes sont également possibles.
  6. Pour CryoEM, mélanger une aliquote de 20 pi (environ 2 pg) avec 60 Protein ul G or 10 nm (rapport 1: 3). Cela aidera à déterminer le diamètre de exosomes.
  7. Transférer les échantillons sur des grilles de préchauffage déchargée C-plat carbone holey et enlever l'excès de liquide en tamponnant. Congeler les grilles en les plongeant immédiatement dans l'éthane liquide.
  8. Monter les grilles dans un cryoholder dans de l'azote liquide.
  9. Acquérir les images à 200 kV avec des grossissements de 20,000X et 100,000X.

3. Exosome Identification par multi-paramètres Nanoparticules Analyse optique

  1. Remettre en suspension les exosomes isolés dans 100 ul de PBS par pipetage.
  2. Diluer les exosomes dans 600 ul de PBS à plusieurs rapports différents (par exemple 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 et 1: 1200).
  3. Visualisez les exosomes par diffusion de la lumière laser avec l'instrument et des logiciels appropriés en temps réel selon la fabrile protocole Dürer 20.
  4. Augmenter le niveau de l'appareil photo en mode de capture jusqu'à ce que les particules deviennent visibles, puis ajuster la mise au point de rendre les particules semblent lisse.
  5. En mode standard, diminuer la caméra au niveau le plus bas que les particules peuvent encore être vus, si nécessaire ajuster l'obturateur et le gain caméra pour atteindre cet objectif.
  6. Vérifier visuellement pour assurer 20-100 particules sont visibles sur l'écran, sinon rincer l'appareil et régler la dilution dans du PBS.
  7. Réglez ensuite la durée de capture entre 30-60 sec. Après la vidéo est capturée, ajuster les paramètres de traitement jusqu'à ce que toutes les particules sont identifiés sur l'écran et traiter le fichier vidéo.

4. Exosome Caractérisation par Western Blot

  1. Lyser exosomes pastilles de 5/2 ml de bile dans 100 ul de dosage radio-immunoprécipitation glacé (RIPA) tampon avec un inhibiteur de la protéase par pipetage de haut en bas et mélanger soigneusement lysats vigoureusement pendant 30 secau vortex pour solubiliser efficacement les protéines.
  2. Alors que la plupart du temps pas nécessaire, utiliser pulse-sonication des échantillons sur la glace avec 2 impulsions pendant 10 secondes chacune pour assurer la pleine lyse.
  3. Pastiller la matière insoluble par centrifugation à 15 000 xg à 4 ° C pendant 5 min et transférer le surnageant dans un tube propre.
  4. Déterminer la concentration en protéine avec une méthode de choix ( par exemple, l' acide bicinchoninique (BCA), Coomassie, Lowry modifiée, 660 nm , analyse de protéines, etc.) selon le protocole du fabricant. La méthode est pas aussi important tant que la même méthode est utilisée régulièrement pour obtenir des résultats qui peuvent être comparés à travers des expériences.
  5. Charge de 50 ug de protéine par échantillon dans un tampon de Laemmli, après chauffage de l'échantillon à 95 ° C pendant 5 min dans un puits d'un gel de polyacrylamide pour l'électrophorèse (PAGE).
  6. L'électrophorèse des échantillons sur gels PAGE pendant 1,5 heure et à transférer les protéines séparées sur une membrane de nylon.
  7. Bbloquer la membrane (s) avec 5% de lait écrémé dans du tampon Tris salin avec 0,1% de Tween 20 (TBS-T) pendant 1 h, puis incuber avec des anticorps spécifiques exosomes tels que l'anti-CD63 et anti-STG-101 à une dilution de 1: 500 de préférence O / N à 4 ° C.
  8. Laver les membranes avec TBS-T 3 x 10 min, puis incuber avec un lieu, correspondant à l'anticorps secondaire HRP-conjugué dans 5% de lait écrémé dans du TBS-T pendant 1-2 heures à la température ambiante.
  9. Laver la membrane (s) 3 x 5 min avec TBS-T et de détecter les protéines spécifiques avec des réactifs de chimioluminescence selon le protocole du fabricant.
  10. Imager les membranes avec un film ou un système numérique d'imagerie selon le protocole du fabricant.

5. microARN Isolation des exosomes isolés

Remarque: L'isolement des exosomes à partir miARN bile est réalisée à l'aide d'un isolement miARN modifié à base d'un kit disponible dans le commerce, mais tout autre procédé d'isolement d'ARN peut être utilisé ou adapté.

  1. Ajouter 300 &# 181; l lyse / tampon pour la construction du culot exosomes (isolé à partir de 400 ul de la bile), vortex, passer à travers une pipette ou une aiguille / seringue pour lyser complètement les exosomes pour obtenir un lysat homogène.
  2. Ajouter 1/10 (30 pi) volume de miRNA homogénat additif, et bien mélanger par vortex ou en renversant le tube plusieurs fois.
  3. Incuber le mélange pendant 10 minutes sur la glace.
  4. Ajouter un volume d'acide-phénol: chloroforme égal à l'homogénat initial (300 ul).
  5. Ajouter 5 pi 5 fmol / ul cel-miR 39 et vortex pendant 30-60 sec.
  6. Centrifuger pendant 5 min à 10 000 x g à température ambiante pour séparer la phase aqueuse (supérieure) et les phases organiques (en bas).
  7. Aspirer soigneusement la phase supérieure par pipetage et transfert à un nouveau tube tout en notant le volume transféré. Jeter la phase organique dans le conteneur de déchets organiques appropriés.
  8. Pour enrichir pour les petits ARNs ajouter 1/3 volume de 100% d'éthanol à la phase aqueuse récupérée et mélanger soigneusement par tourbillonnement ou en renversant le tusoit plusieurs fois.
  9. Pipeter le mélange lysat / éthanol sur la cartouche filtrante, jusqu'à 700 ul à la fois.
  10. Centrifuger les cartouches pour 15 s à un maximum de 10.000 xg ou appliquer le vide pour passer le mélange à travers le filtre.
  11. Recueillir le filtrat et si le mélange lysat / éthanol dépasse 700 pi, transférer le flux par le biais d'un nouveau tube et répétez la procédure pour recueillir tous les filtrats. Ceux-filtre contient des fractions d'ARN dépourvue de petits ARN et peut être utilisé pour récupérer ces ARN plus grandes.
  12. Ajouter 2/3 volume de RT 100% d'éthanol au filtrat totale et mélanger soigneusement par tourbillonnement.
  13. Pipeter le mélange filtrat / éthanol sur une seconde cartouche de filtre. Comme précédemment le volume maximum qui peut être appliqué à la fois est de 700 ul.
  14. Centrifuger pendant 15 secondes à 10.000 xg ou appliquer le vide comme décrit à l'étape 5.10.
  15. Jeter l'écoulement, et répéter jusqu'à ce que tout mélange filtrat / éthanol a été filtré.
  16. Appliquer 70081; l miRNA Wash Solution 1 à la cartouche filtrante, centrifuger pendant 5-10 sec ou appliquer le vide et jeter le flux continu.
  17. Laver le filtre avec une solution de lavage de 500 pi 2/3 comme cela se fait à l'étape 5.16.
  18. Répétez le lavage une seconde fois avec 500 pi de solution de lavage 2/3 comme dans l'étape 5.16, jeter le accréditive et placer le filtre dans le tube de collecte.
  19. Faire tourner la cartouche filtrante pendant 1 min à 10 000 x g pour éliminer tout liquide résiduel provenant du filtre.
  20. Transférer la cartouche filtrante dans un tube de collecte frais et appliquer 100 pi d'eau chaude gratuite (95 ° C) nucléase au centre du filtre.
  21. Faites tourner les ensembles pour les 20-30 secondes à la vitesse maximale pour récupérer l'ARN.
  22. Recueillir l'éluat et utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C.

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Résultats

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Etant donné que les exosomes sont trop petites pour être détectées par microscopie ordinaire ou cytométrie en flux, la microscopie électronique ou optique de nanoparticules doit être effectuée. L'analyse optique de nanoparticules a l'avantage par rapport à la microscopie électronique qu'il est également quantitative et fournit une distribution granulométrique et la concentration. L'instrument présente un faisceau laser finement focalisé à travers un prisme de verre dans l'échantillon. Le...

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Discussion

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Pour utiliser de manière fiable exosomes isolés de la bile, il est important d'utiliser des méthodes d'isolement de haute qualité compatibles pour obtenir des échantillons de haute qualité en retour. La méthodologie définie dans le présent document est un moyen bien établi pour isoler les exosomes et microARN de la bile humaine. Il met en évidence plusieurs étapes cruciales dans la caractérisation des exosomes isolés qui, à un minimum devrait comprendre la microscopie électronique ou optique de nanoparticules et...

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Déclarations de divulgation

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Aucun des auteurs n’a d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Cette étude a été financée par un prix K08 (DK090154-01) des National Institutes of Health (NIH ; à F.M.S.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 et micro ; m Filtre à membrane en polyéthersulfone (PES)Tubes
Beckman Coulter331374
SW40Ti rotorBeckman Coulter
LM10-HS  ;Logiciel d’analyse
  ;Nanosight
mirVANALife TechnologiesAM1560
Inhibiteur complet de protéaseRoche distribué par Sigma-Aldrich4693116001
Immobilon PSQMillipore, Bedford MAISEQ00010
Anticorps anti-CD63Abcamab59479
Anti-Tsg101Abcamab30871
à ultracentrifugeuse en polyallomère à paroi mince Corning 431229 de suivi des nanoparticules (NTA) Nanosight

Références

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Mots-clés

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