Cutaneous dénervation chirurgicale: une méthode pour tester l'exigence de nerfs dans les modèles murins de la maladie de la peau

Summary

Cet article comprend des protocoles détaillés pour le marquage génétique de la peau de souris, la dénervation chirurgicale, la biopsie cutanée et la visualisation des épithéliums marqués par coloration à la β-galactosidase entière. Ces méthodes peuvent être utilisées pour tester la nécessité de nerfs dans des modèles murins de peau normale et pathologique.

Abstract

Les nerfs somatosensoriels cutanés ont pour fonction de détecter divers stimuli qui agissent sur la peau. En plus de leurs rôles sensoriels établis, des études récentes ont suggéré que les nerfs peuvent également moduler les troubles cutanés, notamment la dermatite atopique, le psoriasis et le cancer. Ici, nous décrivons des protocoles pour tester la nécessité des nerfs dans le maintien d’un organe mécanosensoriel cutané, le dôme tactile (DT). Plus précisément, nous discutons des méthodes de marquage génétique, de récolte et de visualisation des DT par coloration complète, et pour effectuer une dénervation chirurgicale unilatérale sur la peau dorsale de la souris. Ensemble, ces approches peuvent être utilisées pour comparer directement la morphologie de la TD et l’expression génique dans la peau dénervée ou fictive du même animal. Ces méthodes peuvent également être facilement adaptées pour examiner la nécessité de nerfs dans des modèles murins de pathologie cutanée. Enfin, la possibilité d’échantillonner à plusieurs reprises la peau permet de surveiller la progression de la maladie à différents stades et à différents moments après l’initiation.

Introduction

Au cours des dernières années, on a assisté à une prise de conscience croissante de l’influence des nerfs sur des maladies qui ne sont généralement pas considérées comme des neuropathies classiques^1-4. Dans la peau, des preuves expérimentales récentes ont suggéré que les nerfs sensoriels peuvent moduler diverses pathologies allant du psoriasis au cancer^5-9. Cela a été démontré à l’aide de techniques telles que la dénervation chirurgicale et l’inhibition pharmacologique de la fonction neuronale chez les rongeurs. Dans le cas du psoriasis, ces études ont fourni un cadre mécaniste pour comprendre pourquoi les plaques psoriasiques humaines régressen....

Protocol

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été effectués conformément aux règles établies par l'Université du Michigan Unité de médecine de laboratoire animal.

1. Provoquer Recombinaison génétique chez la souris

Note: La Gli1 ^tm3 souche de souris ^Alj / J ^{(/ ERT2 cre)} (Gli1-CreERT2) ¹³ permet le ciblage de la recombinaison génétique tamoxifène induite par TD épithéliums. Traverser cette souche avec B6.129S4-Gt (ROSA) des souris rapporteurs 26Sor ^tm1Sor / J (LacZ) ²² pour....

Results

Par souris exprimant le tamoxifène générant inductible Gli1-CreERT2 et un allèle LacZ rapporteur, il est possible de visualiser les épithéliums de TD et de suivre les destins de ces cellules au cours du temps. La procédure de dénervation entière peut généralement être achevée dans 1 heure par souris et devrait causer de la détresse minimale à l'animal.

Nos études antérieures ont montré que les nerfs sont cruc.......

Discussion

Nerfs remplissent des fonctions cruciales non seulement dans la sensation, mais aussi dans le développement des organes de mammifères, la maintenance et la régénération ^13,24-27. Comme les nerfs ont récemment été impliqués dans les troubles de la peau diverses, les techniques décrites ici peuvent être utilisées pour étudier la nécessité d'innervation dans une variété de modèles de maladies animales. En effet, la technique de dénervation unilatérale permet la comparaison directe de la peau avec soit des ne.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampons de préparation à l’alcool	PDI	B339
AnaSed (Xylazine)	Lloyd	NADA 139-236
Anticorps, anti-kératine 8	Études développementales Hybridoma Bank	Anticorps de rat TROMA-I	, utilisation à une concentration de 1:500
Anticorps anti-kératine 17	Signalisation cellulaire	#4543	Anticorps de lapin, utilisation à une concentration de 1:1 000
Anticorps, anti-Neurofilament	Cell Signaling	C28E10	Anticorps de lapin, à utiliser à une concentration de 1:500
Tampons de préparation à la bétadine	Medline	MDS093917
Carprofène (Rimadyl)	Zoetis
Tondeuse rechargeable sans fil	Wahl	modèle 8900
Huile de maïs	Sigma-Aldrich	C8267
Cryostat	Leica	CM1860
DAPI	ThermoFisher	Scientific D1306	utilisation à une concentration de 1:1 000
Désoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Crème dépilatoire	Nair	N/A
Diméthylforamide	Sigma-Aldrich	319937
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Glutaraldéhyde	Sigma-Aldrich	G5882
ImmEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kétamine HCl	Hospira	NDC 0409-2051-05
Chlorure de magnésium	Sigma	M8266
Micro verre de couverture	VWR	48404-454
Micro lames	VWR	48311-703
10 % Neutre Tamponné Formalin	VWR	BDH0502-4LP
6-0 Sutures en nylon	DemeTECH	NL166012F4P
Octylphényl-polyéthylène glycol	Sigma-Aldrich	I8896
O.C.T. Composé	Sakura Tissue-Tek	4583
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127
Ferrocyanure de	pottasiumSigma-Aldrich	P9387
Ferricyanure de pottasium	Sigma-Aldrich	702587
Phosphate de sodium monobasique	Sigma-Aldrich	P9791
Phosphate de sodium dibasique	Sigma-Aldrich	S5136
Saccharose	Sigma-Aldrich	84097
Tamoxifène	Sigma-Aldrich	T5648-1G
Pince ultra fine	Dumont	0103-5-PO
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
X-gal	Roche	10 651 745 001	Dissolution dans le diméthylforamide pour créer un stock 50x avant utilisation