Article de méthode

Cutaneous dénervation chirurgicale: une méthode pour tester l'exigence de nerfs dans les modèles murins de la maladie de la peau

DOI :

10.3791/54050

⸱

26 juin 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article comprend des protocoles détaillés pour le marquage génétique de la peau de souris, la dénervation chirurgicale, la biopsie cutanée et la visualisation des épithéliums marqués par coloration à la β-galactosidase entière. Ces méthodes peuvent être utilisées pour tester la nécessité de nerfs dans des modèles murins de peau normale et pathologique.

Résumé

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Les nerfs somatosensoriels cutanés ont pour fonction de détecter divers stimuli qui agissent sur la peau. En plus de leurs rôles sensoriels établis, des études récentes ont suggéré que les nerfs peuvent également moduler les troubles cutanés, notamment la dermatite atopique, le psoriasis et le cancer. Ici, nous décrivons des protocoles pour tester la nécessité des nerfs dans le maintien d’un organe mécanosensoriel cutané, le dôme tactile (DT). Plus précisément, nous discutons des méthodes de marquage génétique, de récolte et de visualisation des DT par coloration complète, et pour effectuer une dénervation chirurgicale unilatérale sur la peau dorsale de la souris. Ensemble, ces approches peuvent être utilisées pour comparer directement la morphologie de la TD et l’expression génique dans la peau dénervée ou fictive du même animal. Ces méthodes peuvent également être facilement adaptées pour examiner la nécessité de nerfs dans des modèles murins de pathologie cutanée. Enfin, la possibilité d’échantillonner à plusieurs reprises la peau permet de surveiller la progression de la maladie à différents stades et à différents moments après l’initiation.

Introduction

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Au cours des dernières années, on a assisté à une prise de conscience croissante de l’influence des nerfs sur des maladies qui ne sont généralement pas considérées comme des neuropathies classiques1-4. Dans la peau, des preuves expérimentales récentes ont suggéré que les nerfs sensoriels peuvent moduler diverses pathologies allant du psoriasis au cancer5-9. Cela a été démontré à l’aide de techniques telles que la dénervation chirurgicale et l’inhibition pharmacologique de la fonction neuronale chez les rongeurs. Dans le cas du psoriasis, ces études ont fourni un cadre mécaniste pour comprendre pourquoi les plaques psoriasiques humaines régressent après une perte de la fonction neuronale7,10-12.

Les nerfs cutanés peuvent également affecter l’expression des gènes13,14 et sont essentiels pour la mécanodétection dans la peau normale15. En particulier, les épithéliums à dôme tactile (TD) sont composés d’un patch de cellules épidermiques cylindriques en juxtaposition avec des cellules de Merkel neuroendocrines innervées par l’adaptation lente des fibres nerveuses de type 1 (SA1)16-18. Les TD médient la sensation de toucher léger et il a été démontré qu’ils affichent une activité de voie Hedgehog5,19. Le maintien de la TD dépend de l’innervation20,21, car les nerfs sécrètent des ligands Hedgehog pour maintenir les TD normaux et leurs cellules de Merkel associées19. De plus, l’innervation favorise la formation de tumeurs dépendantes du hérisson à partir de l’épithéliumTD 5. Ensemble, ces études renforcent l’idée que les interactions moléculaires complexes qui se produisent entre les nerfs et les cellules environnantes dans leur niche sont cruciales pour la physiologie normale de la DT ainsi que pour la maladie.

Pour interroger la nature de ces interactions, nous décrivons ici une série de techniques in vivo de manipulation de l’expression génique dans le TD, ainsi que de prélèvement de biopsies cutanées pour la visualisation du TD après traçage de lignée. Enfin, nous décrivons des procédures de dénervation chirurgicale unilatérale, dans lesquelles les nerfs sont retirés d’un côté de la peau dorsale de la souris, tout en laissant le côté controlatéral intact en tant que contrôle interne fictif. Plusieurs semaines après la chirurgie, la peau dénervée et la peau de contrôle simulée sont comparées pour évaluer les changements qui se produisent lorsque les nerfs sont ablatés. Bien que ces techniques soient décrites dans le contexte des DT normaux, la procédure de dénervation a été utilisée pour examiner les besoins en nerfs dans des modèles murins de psoriasis6, de cicatrisation des plaies13 et de tumorigenèse5. Enfin, comme la peau se prête à des biopsies répétées, cela permet de surveiller le devenir à long terme des cellules marquées ou d’évaluer la progression de la maladie à plusieurs points dans le temps.

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Protocole

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Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été effectués conformément aux règles établies par l'Université du Michigan Unité de médecine de laboratoire animal.

1. Provoquer Recombinaison génétique chez la souris

Note: La Gli1 tm3 souche de souris Alj / J (/ ERT2 cre) (Gli1-CreERT2) 13 permet le ciblage de la recombinaison génétique tamoxifène induite par TD épithéliums. Traverser cette souche avec B6.129S4-Gt (ROSA) des souris rapporteurs 26Sor tm1Sor / J (LacZ) 22 pour générer Gli1; ​​animaux LacZ pour visualiser les cellules de TD par l' ensemble du montage coloration ci - dessous.

  1. Préparer une solution de tamoxifène à une concentration de 12,5 mg / ml dans de l'huile de maïs.
    1. Dans un tube de 1,5 ml, ajouter jusqu'à 20 mg de tamoxifène cristallins, puis on ajoute 1 ml d'huile de maïs. collez fermement le tube à un mélangeur à vortex, et le vortex en continu à la valeur la plus élevée à la température ambiante jusqu'à ce que le tamoxifène a complètement dissous (2-4 h), commeconfirmé par l'examen du tube sous un microscope à dissection pour l'absence de particules tamoxifène.
    2. Transférer la solution dans un tube de 15 ml et diluer le tamoxifène à une concentration finale de 12,5 mg / ml avec de l'huile de maïs supplémentaire. Mélanger par tourbillonnement la solution visqueuse pour un supplément de 30 sec. Conserver cette solution pendant 1 semaine à 4 ° C dans l'obscurité.
  2. Injecter la solution tamoxifène par voie intraperitoneale dans Gli1, les souris lacZ, à un volume de 200 pl par 20 g de poids corporel de la souris, pour une dose efficace de tamoxifène 2,5 mg par 20 g de poids de souris.

2. Les biopsies cutanées de récolte

Remarque: En fonction de l'expérience, des biopsies de peau de récolte plusieurs jours à quelques semaines après l'induction du tamoxifène. Pour toutes les chirurgies, suivre les protocoles standards pour la chirurgie des rongeurs, y compris en utilisant des gants stériles, portant un masque ou filet de cheveux chirurgicale, et couvrant l'animal avec un champ opératoire stérile pendant la procédure.

  1. Préparer 10x solution mère anesthésique en mélangeant 90 mg / ml de kétamine et 6,5 mg / ml de xylazine dans l'eau. Diluer cette solution stock 1:10 dans du PBS stérile juste avant l'utilisation, et stocker à température ambiante dans l'obscurité pendant jusqu'à 8 mois.
    1. En variante, anesthésier les souris par inhalation d'isoflurane, en commençant avec une concentration de 4% de gaz avec de l'oxygène pour anesthésier complètement l'animal, puis abaissant ensuite ce à 1-2% pendant toute la durée de la procédure.
  2. Injecter la solution anesthésique par voie intraperitoneale à une dose de 200 pl par 20 g de poids corporel de la souris. Vérifiez que l'animal a atteint le bon plan de la sédation par dosage toe de pincement, et confirmer que le cœur et les taux respiratoires sont normaux (environ 600 battements et 160 respirations par minute, respectivement).
  3. Utilisez une tondeuse électrique pour enlever les poils à partir du site de la biopsie sur la peau dorsale en arrière, en faisant attention de ne pas entailler ou endommager la peau sous-jacente.
  4. Préparer le site chirurgical en essuyant le rasaged zone dans une direction antérieure à postérieure en utilisant bétadine et alcool lingettes. Assurer que toutes les coupures de cheveux sont retirés du site.
  5. Outline le site de biopsie à l'aide d'un marqueur noir, placez l'animal sur un coussin chauffant dans une zone chirurgicale aseptique, et couvrir avec un drap chirurgical stérile (à des fins de démonstration, champ stérile a été omis pour augmenter la visibilité).
    Remarque: Pour obtenir des sections longitudinales des follicules pileux, le bord plus de la biopsie (le bord d'être sectionnée pour l'histologie, ~ 1 cm) devrait fonctionner dans une direction antéro-postérieur (parallèle à la direction des follicules pileux), parasagital à la ligne médiane dorsale (figure 1A).
  6. Utilisez un stérile # 11 scalpel pour faire une excision de pleine épaisseur le long de la zone marquée sans endommager le fascia musculaire sous-jacent.
    Remarque: Le tissu excisé de la peau comprend l'épiderme, le derme, graisse sous-cutanée et pannicule carnosus. Bleeding est généralement minime.
  7. Aplatir til excisé échantillon de peau sur une serviette en papier, derme côté vers le bas, rogner la serviette en papier en excès, et de stocker l'échantillon dans du PBS froid jusqu'à 1 h si d'autres échantillons doivent être prélevés. Lorsque vous êtes prêt, passer aux étapes 3.1 ou 3.2 pour traiter des échantillons pour l'histologie, ou l'étape 4 pour β-galactosidase (LacZ) coloration toute monture.
  8. Suture fermer le site de biopsie en utilisant 6-0 sutures en nylon, dans un motif d'interruption simple, espacées d'environ 3 mm.
  9. Ne retournez pas les souris qui ont subi une chirurgie dans la même cage que d'autres animaux jusqu'à ce que la récupération complète.
  10. Surveillez les animaux immédiatement après la chirurgie jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience, et aussi tous les jours jusqu'à ce que la zone chirurgicale a guéri, généralement à moins de 1 semaine. Utilisez des analgésiques en conformité avec le soin des animaux et de l'utilisation des lignes directrices institutionnelles désignées si les souris présentent des signes de douleur ou de détresse. Retirer les sutures dans les 7-10 jours après la chirurgie.
    Remarque: Si nécessaire, préparer une solution analgésique en diluant carprofène (50 mg / ml Stock solution) 1: 100 dans de l'eau stérile. Injecter la solution par voie sous- cutanée entre les omoplates à proximité de la peau du cou, à une dose de 200 pl par 20 g de poids corporel (5 mg / kg de poids corporel de souris).

3. Les échantillons de procédé pour histologie

Remarque: Pour fixer et traiter le tissu excisé, utilisez la méthode ci-dessous en fonction de l'application.

  1. Pour générer des échantillons histologiques paraffine, fixer la peau dans 3,7% de formaline dans du PBS O / N à la température ambiante et de stocker dans 70% d'éthanol pendant 2 semaines. Retirer la serviette en papier avant de l'intégrer dans la paraffine.
  2. Pour générer des échantillons histologiques congelés, plonger le tissu dans le froid paraformaldéhyde 4% dans du PBS et agiter doucement pendant 1 h. Retirer la solution et laver l'échantillon avec 3 changements de PBS, environ 5 minutes chacun. Ensuite, plonger l'échantillon dans 30% de saccharose dans du PBS pour cryoprotect le tissu ( "naufrage saccharose").
  3. Incuber avec douceur O secouant / N à 4 ° C. Le lendemain, retirez le câble de papierel et rogner l'excès de tissu adipeux du côté dermique de la peau. Intégrer le tissu directement dans OPO et stocker le bloc congelé à -80 ° C.
    Remarque: Après la coupe, soit la paraffine ou les échantillons congelés peuvent être colorés par immunohistochimie pour identifier TDs, les cellules de Merkel et les nerfs en utilisant des anticorps contre la kératine 17, kératine 8 et Neurofilament, respectivement, comme décrit précédemment 5,19.

4. Visualiser les échantillons par Whole-mount LacZ Coloration

  1. Préparer une solution de coloration X-gal.
    1. Combiner 0,94 g de phosphate monosodique et 2,6 g de phosphate dibasique de sodium dans 250 ml d'eau stérile. Ajuster le pH à 7,3. Pour ce faire, on ajoute 0,5 ml de 1 M de chlorure de magnésium, 0,528 g de ferrocyanure de potassium et 0,412 g de ferricyanure de potassium. Ajouter 250 ul de polyéthylène-glycol-octylphényle et de 125 mg de désoxycholate. La solution de base peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois à l'obscurité.
    2. Préparer 50x actions X-gal solutipar l'ajout de diméthylformamide à la X-gal bouteille de réserve pour générer un / ml, solution à 50 mg. Conserver cette solution à -20 ° C dans l'obscurité.
    3. Juste avant l'utilisation, une solution diluée stocks X-gal 1:50 dans la solution de base X-gal pour produire une solution de coloration. Pour de plus petites biopsies (<1 cm 2), aliquoter 1-2 ml de solution de coloration par échantillon.
  2. Fixer l'échantillon de peau recueillis à l'étape 2.7 dans une solution contenant 2% de paraformaldéhyde / 0,2% de glutaraldéhyde dans du PBS froid pendant 30 minutes, en secouant doucement sur la glace. Pour de plus petites biopsies (<1 cm 2), en utilisant 1 à 2 ml d' une solution de fixation par échantillon.
    Remarque: Vous pouvez également fixer des échantillons dans 2-4% paraformaldéhyde seulement, ou 0,5% de glutaraldéhyde seulement. conditions de fixation optimales dépendent du tissu, le degré d'expression et de l'application LacZ.
  3. Retirer la solution de fixateur, et rincer les échantillons avec 3 changements de PBS, 5 minutes chacun, sur un agitateur à température ambiante.
  4. Retirer la serviette en papier sous l'échantillon et couper excess le tissu adipeux du côté du derme de la peau en saisissant la graisse avec une pince de coupe émoussés et avec des ciseaux de dissection.
  5. Immerger l'échantillon dans une solution de coloration X-gal, et incuber à 37 ° CO / N. Expression LacZ sera visible comme une tache bleue sous un microscope à dissection (figure 1B).
    Remarque: Si l'intensité du signal est faible, remplacer la solution de coloration le jour suivant et répéter l'O / N incubation. Si la coloration de fond est trop intense, réduire le temps de coloration, ou incuber l'échantillon à température ambiante au lieu de 37 ° C.
  6. Retirer la solution de coloration et laver les échantillons en 3 changements de PBS contenant 3% de DMSO pendant environ 5 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
  7. Laver les échantillons à 2-3 changements de 70% d'éthanol pendant 5 minutes chacun. Conserver les échantillons dans 70% d'éthanol.

5. dénervation chirurgicale

  1. Anesthetize l'animal comme à l'étape 2.2 et de se raser la peau du dos entier.
  2. Préparer la zone chirurgicale of la peau du dos en utilisant Betadine et tampons imbibés d'alcool, et couvrir l'animal avec un champ opératoire stérile (à des fins de démonstration, champ stérile a été omis pour augmenter la visibilité). Gardez la chaleur animale au moyen d'un coussin chauffant tout en opérant dans une zone chirurgicale aseptique.
  3. Faire une incision en utilisant un scalpel stérile # 11 le long de la ligne médiane dorsale de la base du cou, à environ 0,5 cm au-dessus de la queue.
  4. En utilisant des pinces émoussées, reflètent la peau en douceur sur le côté gauche du flanc pour visualiser le tissu sous-jacent des coussinets adipeux scapulo près du cou juste au-dessus du membre postérieur.
    Remarque: les nerfs cutanés dorsaux apparaissent brins comme blancs qui voyagent caudale à travers le fascia translucide de la paroi du coffre avant de prendre les virages serrés et en entrant le tissu conjonctif lâche sous la peau (Figure 2).
  5. En utilisant des pinces ultra-fines sous un microscope à lumière dissection, enlever les nerfs exclusivement à partir du côté gauche de l'animal situés sur des sites anatomiques T3-12 par la plumaison d'où la courbure des segments à la paroi du coffre à leurs sites dans la peau d'entrée (Figure 2).
    1. Forceps Orient verticalement et enlever les nerfs en saisissant environ 0,5 cm en dessous de leurs sites de pliage et en tirant vers le haut, ce qui provoque le nerf à étirer et à séparer les tissus environnants (figure 2C - E). Soyez prudent pour éviter la rupture des vaisseaux sanguins adjacents.
    2. Continuez jusqu'à ce que tous les nerfs s'étendant à partir de la paroi du coffre à la peau sont enlevés. Ne pas perturber les nerfs dans le fascia dense de la paroi du coffre. Maintenir le tissu humide tout au long de la procédure en appliquant périodiquement des gouttes de solution saline stérile à 0,9%.
    3. Alternativement, enlever les nerfs en saisissant leurs extrémités proximales à proximité de la paroi du tronc avec une pince et coupant avec des ciseaux fins. Ensuite, couper les extrémités distales près de la peau (figures 2F - H). Enfin, retirez le intervening segments nerveux (Figure 2I).
  6. Retirez tous les nerfs du lambeau de peau exposée à l'étape 5.4. Ces fibres comprennent les branches distales des nerfs cutanés dorsaux et apparaissent sous forme de poils de ramification blancs situés de façon sporadique dans le tissu conjonctif sur le côté dermique du lambeau cutané (Figures 2J - K).
    1. Pour supprimer ces fines branches, positionner les pince fine à peu près parallèles à la surface cutanée, saisir les nerfs et cueillent vers le haut pour éviter de perturber les vaisseaux sanguins et la perforation de la peau. Continuez jusqu'à ce que tous les nerfs visibles ont été enlevés.
  7. Utilisation de dissection, refléter la peau sur le côté droit de la dorsale incision médiane, mais ne pas enlever les nerfs. Ce sera le contrôle de la pseudo-opérées controlatéral.
  8. Suturer le long de la ligne médiane dorsale selon un motif interrompu simple pour fermer l'incision. Surveiller l'animal lors de la récupération et de post-opertivement comme démontré précédemment (étapes 2,8-10). Retirer les sutures dans les 7-10 jours après la chirurgie.
  9. Pour évaluer fonctionnellement stable dénervation jusqu'à plusieurs semaines après la chirurgie, enlever les poils de la peau du dos en utilisant une tondeuse électrique.
  10. piquez délicatement la zone de peau dénervé utilisant une aiguille hypodermique, et notez si l'animal répond, généralement en frissonnant ou en tournant la tête. Si la zone de la peau a été stable dénervé, l'animal va présenter peu ou pas de réponse.
  11. L'utilisation d'un marqueur noir, délimiter la zone de non-réponse, ainsi que d'une zone de la taille et l'emplacement similaire sur le côté factice controlatéral.
  12. Collecter des biopsies de ces sites dans les étapes 2.1-2.9 pour l'analyse.
    Remarque: Vous pouvez également l'ensemble du dos dorsale la peau, y compris les régions dénervés et opérés de manière fictive, peut être retiré en une seule feuille pour toute monture coloration, semblable à la manière décrite à l'étape 4.

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Résultats

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Par souris exprimant le tamoxifène générant inductible Gli1-CreERT2 et un allèle LacZ rapporteur, il est possible de visualiser les épithéliums de TD et de suivre les destins de ces cellules au cours du temps. La procédure de dénervation entière peut généralement être achevée dans 1 heure par souris et devrait causer de la détresse minimale à l'animal.

Nos études antérieures ont montré que les nerfs sont cruc...

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Discussion

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Nerfs remplissent des fonctions cruciales non seulement dans la sensation, mais aussi dans le développement des organes de mammifères, la maintenance et la régénération 13,24-27. Comme les nerfs ont récemment été impliqués dans les troubles de la peau diverses, les techniques décrites ici peuvent être utilisées pour étudier la nécessité d'innervation dans une variété de modèles de maladies animales. En effet, la technique de dénervation unilatérale permet la comparaison directe de la peau avec soit des ne...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs tiennent à remercier Autumn Peterson pour son aide avec la photographie de souris, Daniel Thoresen pour son aide avec les souris, et les Drs Nicole Ward et Abdelmadjid Belkadi pour leur aide avec la dénervation chirurgicale. Ces études ont été financées par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (subventions R00AR059796 et R01AR065409) ; le département de dermatologie de l’Université du Michigan ; le programme de bourses en sciences biologiques ; le Centre d’organogenèse ; le Comprehensive Cancer Center de l’Université du Michigan ; et le Fonds de cancérologie John S. et Suzanne C. Munn. S.C.P. a été soutenu par un financement de l’Institut National des Sciences Médicales Générales (subvention T32 GM007315). Ce travail a également été soutenu par le programme de recherche intra-muros des NIH, le Centre de recherche sur le cancer, l’Institut national du cancer.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampons de préparation à l’alcoolPDIB339
AnaSed (Xylazine)LloydNADA 139-236
Anticorps, anti-kératine 8Études développementales Hybridoma BankAnticorps de rat TROMA-I, utilisation à une concentration de 1:500
Anticorps anti-kératine 17Signalisation cellulaire#4543Anticorps de lapin, utilisation à une concentration de 1:1 000
Anticorps, anti-NeurofilamentCell SignalingC28E10Anticorps de lapin, à utiliser à une concentration de 1:500
Tampons de préparation à la bétadineMedlineMDS093917
Carprofène (Rimadyl)Zoetis
Tondeuse rechargeable sans filWahlmodèle 8900
Huile de maïsSigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisherScientific D1306utilisation à une concentration de 1:1 000
DésoxycholateSigma-AldrichD6750
Crème dépilatoireNairN/A
DiméthylforamideSigma-Aldrich319937
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GlutaraldéhydeSigma-AldrichG5882
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000
Kétamine HClHospiraNDC 0409-2051-05
Chlorure de magnésiumSigmaM8266
Micro verre de couvertureVWR48404-454
Micro lamesVWR48311-703
10 % Neutre Tamponné FormalinVWRBDH0502-4LP
6-0 Sutures en nylonDemeTECHNL166012F4P
Octylphényl-polyéthylène glycolSigma-AldrichI8896
O.C.T. ComposéSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127
Ferrocyanure depottasiumSigma-AldrichP9387
Ferricyanure de pottasiumSigma-Aldrich702587
Phosphate de sodium monobasiqueSigma-AldrichP9791
Phosphate de sodium dibasiqueSigma-AldrichS5136
SaccharoseSigma-Aldrich84097
TamoxifèneSigma-AldrichT5648-1G
Pince ultra fineDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001Dissolution dans le diméthylforamide pour créer un stock 50x avant utilisation

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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