Method Article

Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulations transgéniques et l' édition du génome sont essentielles pour tester fonctionnellement le rôle des gènes et des éléments cis -Informations règlementaires. Voici un protocole de microinjection détaillé pour la génération de modifications génomiques (y compris les constructions fluorescentes Tol2 médiées reporters transgène, TALENs et CRISPRs) est présenté pour le poisson modèle émergent, l'épinoche à trois épines.

Abstract

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Le poisson épinoche à trois épines a émergé comme un système puissant pour étudier la base génétique d'une grande variété de morphologiques, physiologiques et phénotypes comportementaux. Les remarquablement divers phénotypes qui ont évolué comme des populations marines adapter à d'innombrables milieux d'eau douce, combinée avec la capacité de traverser les formes marines et d'eau douce, fournissent un système de vertébrés rares dans lesquels la génétique peuvent être utilisés pour cartographier les régions génomiques contrôlant des traits évolué. Excellentes ressources génomiques sont maintenant disponibles, ce qui facilite la dissection génétique moléculaire de changements évolués. Bien que des expériences de cartographie génèrent des listes de gènes candidats intéressants, les manipulations génétiques fonctionnels sont nécessaires pour tester le rôle de ces gènes. La régulation des gènes peut être étudiée avec des plasmides et des taux d'alcoolémie reporteurs transgénique intégré dans le génome en utilisant le système de transposase Tol2. Fonctions de gènes candidats spécifiques et des éléments cis -Informations règlementaires peuvent être évalués en induisant cibléemutations avec Talen et CRISPR / cas9 réactifs de modification du génome. Toutes les méthodes nécessitent l'introduction d'acides nucléiques dans fécondés embryons d'épinoches une cellule, une tâche rendue difficile par le chorion épais d'embryons d'épinoches et relativement petit et mince blastomère. Ici, un protocole détaillé pour la microinjection d'acides nucléiques dans des embryons d'épinoches est décrit pour transgéniques et d'édition du génome applications pour étudier l'expression et la fonction des gènes, ainsi que des techniques pour évaluer le succès de la transgénèse et de récupérer des lignées stables.

Introduction

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Un élément fondamental de comprendre comment la biodiversité se pose est de déterminer les bases génétiques et de développement des changements phénotypiques ont évolué dans la nature. Le poisson épinoche à trois épines, Gasterosteus aculeatus, a émergé comme un excellent modèle pour l' étude de la base génétique de l' évolution. Épinoches ont subi de nombreux changements évolutifs adaptatifs que les poissons marins ont colonisé d' innombrables milieux d'eau douce autour de l'hémisphère nord, ce qui entraîne morphologique dramatique, physiologique, et les changements de comportement 1. Les génomes des individus de vingt- et -un des populations d'épinoches ont été séquencés et assemblés, et une carte de liaison à haute densité a été générée pour améliorer encore l'ensemble 2,3. Expériences de cartographie génétique ont identifié des régions génomiques sous - jacente phénotypes évolué 4-6, et dans quelques cas, les rôles fonctionnels des gènes candidats spécifiques ont été testés 7,8. Un certain nombre de régions génomiques sous - jacentes des changements morphologiques ont été identifiés avec des gènes candidats prometteurs, mais ces candidats n'a pas encore été testé fonctionnellement 9-12. En outre, les épinoches sont des modèles communs pour les études de génétique des populations / génomique 13,14, spéciation 15, le comportement 1, l' endocrinologie 16, écotoxicologie 17, de l' immunologie 18 et parasitologie 19. Les études futures dans chacun de ces domaines bénéficieront de la capacité à effectuer des manipulations génétiques fonctionnels épinoches. En plus de la manipulation de leurs séquences codantes, les rôles des gènes candidats peuvent être évaluées par l' étude de leurs séquences cis -Informations règlementaires et fonctionnellement en augmentant, diminuant ou en éliminant l' expression du gène candidat. Microinjection et transgénèse méthodes épinoches sont bien établies 7,8,20 et ont d' abord été développés en utilisant une méganucléase à médiationméthode 21 décrite en medaka 22. La méthode de microinjection modifiée présentée ici a été optimisé pour les deux transgénèse Tol2 médiée et récemment mis au point des réactifs de modification du génome, y compris TALENs et CRISPRs.

Les modifications apportées aux éléments de cis sont considérés comme essentiels à l' évolution morphologique, comme les changements de cis peuvent éviter les conséquences pléiotropiques négatifs des mutations 23 codage. Par conséquent, le test et la comparaison des séquences cis putatifs -Informations règlementaires est devenu un objectif central d'un nombre croissant d'études sur l' évolution. En outre, la plupart des variantes de maladies humaines sont des variantes réglementaires 24,25, et des systèmes modèles de vertébrés sont cruellement nécessaires pour étudier la fonction de l' élément cis et logique règlementaires. Les poissons qui fertiliser leurs embryons à l' extérieur dans un grand nombre offrent des systèmes de vertébrés puissants pour étudier cis - régulation. Le système de transposon Tol2, dans lequel étranADN gn être intégré dans le génome est flanqué de Tol2 transposase sites et liaison co-injecté avec Tol2 transposase ARNm, fonctionne avec une grande efficacité pour intégrer avec succès le plasmide construit dans les génomes de poisson 26 - 28. En règle générale, un activateur potentiel est cloné en amont d'un promoteur de base (tels que hsp70l 29) et le gène rapporteur fluorescent tel que EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou mCherry dans un squelette Tol2 et injecté avec transposase ARNm 26. Observation d'expression du rapporteur fluorescent, soit dans des embryons ou des enfants avec des transgènes intégrés de manière stable injecté, fournit des informations sur la régulation spatio-temporelle de l'expression génique entraînée par l'activateur putatif. Dans d'autres expériences, des amplificateurs validés peuvent être utilisés pour entraîner une surexpression spécifique du tissu de gènes d'intérêt.

Pour l' analyse des régions plus grandes cis -Informations règlementaires, de haute qualité à grande insert genombibliothèques ic utilisant chromosomes bactériens artificiels (BAC) ont été construits pour les deux marins et d' eau douce épinoches 30. Ces taux d' alcoolémie peuvent être recombineered pour remplacer un gène avec un gène rapporteur fluorescent dans le contexte d'un grand (150-200 kb) 31 région génomique. Le rapporteur fluorescent est ensuite exprimé dans un modèle spatio-temporelle tel que déterminé par des séquences régulatrices au sein du BAC. Pour les études dans les poissons, les sites Tol2 peuvent être ajoutés à la BAC pour faciliter l' intégration génomique 32,33. Dans les stades ultérieurs du développement , lorsque l' hybridation in situ est techniquement difficile, l'affichage fluorescent de BAC peut être utilisé pour étudier les profils d'expression des gènes, comme cela a été montré pour épinoche protéines morphogénétiques osseuses 6 (BMP6) 20. En outre, les modèles d'expression fluorescents dans un individu peuvent être suivis au fil du temps, qui ne peut être accompli avec l' hybridation in situ. Un TA peut également être utilisé pour ajouter un additional copie d'une région génomique pour augmenter la posologie d'un gène d'intérêt.

Pour l'étude de la fonction des gènes, l' édition du génome est un domaine en expansion explosive qui peut être utilisé pour produire des modifications ciblées à des séquences génomiques dans une grande variété d'organismes 34. Transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talens) sont, nucléases spécifiques de séquence modulaires initialement isolées à partir d' agents pathogènes des plantes qui peuvent être conçus avec précision pour se lier directement à une séquence génomique de choix et de générer un double brin casser 35,36. Cluster régulièrement intercalées répétitions palindromiques courtes (CRISPR) / systèmes CAS ont été initialement trouvés dans les bactéries et utilisent un ARN guide et la protéine cas9 pour générer une pause dans une séquence d'ADN cible complémentaire au guide 37. La réparation ultérieure de la double rupture du brin créé par les deux TALENs et CRISPRs laisse souvent derrière une petite insertion ou la suppression, ce qui peut perturber la fonction de la séquence cible35-37. En épinoches, TALENs ont été utilisés pour perturber l' expression des gènes en ciblant un activateur de 20, et les deux TALENs et CRISPRs ont réussi à produire des mutations dans des séquences (données non publiées) de codage. Un protocole détaillé pour la génération de CRISPRs pour une utilisation chez le poisson zèbre peut être utilisé comme guide pour développer CRISPRs pour épinoches 38.

Et des expériences transgéniques génome de montage nécessitent l'introduction d'acides nucléiques dans un embryon d'une des cellules nouvellement fécondé. En introduisant l'outil de transgène ou le génome d'édition au début du développement, le nombre de cellules filles génétiquement modifiées dans l'embryon est maximisée. embryons injectés sont ensuite visuellement criblés pour fluorescence ou moléculairement criblées pour des modifications du génome. Si les cellules qui contribuent à la lignée germinale sont ciblés avec succès, le transgène ou la mutation peuvent être transmises à un sous-ensemble de la progéniture, même lorsque la létalité post-injection est élevée. Les poissons de mosaïque peuvent être ou par croisemententrecroisés et leur progéniture tamisé pour récupérer les allèles mutants ou un transgène intégré de manière stable d'intérêt. Ce protocole décrit les méthodes pour introduire des transgènes et des réactifs de modification du génome dans des embryons d'épinoches une cellule et le suivi des modifications génomiques réussies.

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Protocol

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Tous les travaux de poisson a été approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Californie à Berkeley (numéro de protocole R330).

1. Préparer Nucleic Acids pour injection

  1. Tol2 plasmide transgénèse (Adapté de Fisher 26).
    1. Couper 10 ug transposase plasmidiques (PCS-Tp) 39 avec 10 U Notl dans un tampon fourni pendant 1 heure à 37 ° C à linéariser.
      Remarque: Les accords de transfert de matériel peuvent être nécessaires pour obtenir des plasmides Tol2.
    2. Extraire le plasmide coupé 25 avec un mélange de phénol 1: 24 chloroforme: alcool isoamylique et précipité avec de l' éthanol , de l' acétate de sodium , selon les protocoles standards 40. Resuspendre plasmide dans l'eau sans RNase 50 pi.
      Remarque: Phénol-chloroforme doit être utilisé dans une hotte et les déchets doivent être éliminés correctement selon les directives institutionnelles.
    3. Mise en place d'une réaction de transcription sp6 selon les instructions du fabricant.
    4. Utilisez un isol d'ARNKit ation pour nettoyer la réaction de transcription selon les instructions du fabricant; resuspendre ARN dans de l'eau 50 uL RNase.
    5. Supprimer un aliquote de 1 ul de l'ARN. Chauffer à 65 ° C pendant 5 min pour dénaturer les structures secondaires, puis refroidissez immédiatement sur la glace. Congeler restante réaction de transcription à -80 ° C.
    6. Exécutez l'aliquote de l'ARN sur un gel à 1% d'agarose dans 0,5x TAE (base Tris, l'acide acétique, l'acide éthylènediaminetétraacétique) tampon en cours d'exécution avec une taille standard de l'ARN dans une voie. Le produit attendu est de 2200 pb; jeter si> 5% de l'ARN total apparaît dans un frottis inférieur à 2.200 pb, ce qui indique une dégradation extensive (Figure 1).
    7. Quantifier l'ARN en utilisant un spectrophotomètre à 260 nm. Diluer à 350 ng / ul dans aliquotes d'eau et de stocker 1 pl RNase-free à -80 ° C (bon pour au moins deux ans).
    8. Clone Tol2 plasmide rapporteur (par exemple, en utilisant pT2HE 8 ou plasmides du kit Tol2 41) avec cis- Élément régulateur d'intérêt. En bref, la PCR amplifient une séquence d'ADN génomique d'intérêt avec des amorces contenant des sites de restriction présents dans le plasmide, la digestion du produit de PCR et le vecteur avec l'enzyme (s), ligaturé l'insert dans le vecteur, et à transformer le plasmide obtenu dans E. compétente coli 40. Isoler le plasmide avec un kit qui comprend un rinçage à l'endotoxine selon le protocole du fabricant.
    9. Effectuer une seconde purification du plasmide Tol2 avec un kit de purification PCR selon le protocole du fabricant. Eluer dans 30 l'eau libre de RNase-ul.
      Remarque: Le rendement de cette étape peut être faible (parfois moins de 50% du plasmide d'entrée).
    10. Diluer plasmidique à ~ 125 ng / ul dans l'eau sans RNase.

figure-protocol-1
Figure gel d'ARNm 1. transposase. Transcription Purifié réaction proconduit (1 pi) a été chauffé à 65 ° C, refroidi sur de la glace, et sur un gel d'agarose à 1% avec 0.5x TAE tampon fonctionnant à 100 V. Les dimensions de l'échelle d'ARN en kilobases (kb) sont indiqués sur la gauche . La pleine longueur de l'ARNm transposase est une bande brillante à ~ 2,2 kb. Une petite mais acceptable quantité d'ARNm dégradé ou incomplet est visible ci - dessous 2,2 kb. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. BAC transgénèse (Voir Suster 32,33 pour les techniques BAC recombineering)
    1. Préparer BAC de E. coli en utilisant un kit de purification BAC selon le protocole du fabricant. Utilisez précipitation à l'éthanol pour récupérer l' ADN avec une extraction de sodium norme acétate-éthanol 40 et l' ADN de resuspendre à ~ 250 ng / ul dans l' eau sans RNase.
    2. Préparer transposase ARNm comme dans la section 1.1.
  2. Mutation induction avec TALENs (Voir Cermak
  3. Utilisez l'application basée sur le Web pour concevoir TALENs pour le gène d'intérêt 42. Si possible, la conception TALENs de perturber un site de coupure d'enzyme de restriction pour faciliter l'analyse moléculaire.
  4. Clone Talens et préparer des plasmides pour la transcription qui suit le protocole 35 publiés.
  5. Transcrire TALEN ARNm avec une réaction de transcription sp6 selon les instructions du fabricant et de nettoyer l'ARNm comme décrit pour transposase dans la section 1.1.4. Quantifier avec un spectrophotomètre et diluer à 200 ng / ul dans RNase eau libre. Exécutez TALEN ARNm sur un gel pour assurer qu'elle est la bonne taille et ne se dégrade pas comme décrit à l'étape 1.1.6.
  6. Concevoir une paire d'amorces de PCR pour amplifier environ 100 au 200 pb entourant la séquence cible TALEN en utilisant un outil de conception d'amorce et la séquence d'ADN cible 43. Commandez l'enzyme de restriction appropriée pour tester les lésions au niveau du site cible basé sur l'étape 1.3.1.
  • CRISPR transgénèse (Voir Talbot et Amacher 38 pour la conception et la préparation de CRISPRs):
    1. Conception et préparer CRISPRs et cas9 ARNm selon le protocole 38, et commande appropriée des amorces de vérification et des enzymes de restriction comme décrit à l' étape 1.3.4.

    • 2. Préparer les réactifs d'injection

    1. Utilisez borosilicate Capillaires pour préparer Needles comme décrit ci-dessous.
      Remarque: ces capillaires ne sont pas les capillaires standards utilisés pour microinjection zebrafish, et sont constitués d'un verre plus épais et plus fort qui est essentiel pour percer l'épinoche chorion difficile.
      1. Toujours porter des gants en nitrile ou en latex lors de l'extraction des aiguilles, et ne permettent pas d'aiguilles pour contacter les huiles de la peau ou de la peau.
      2. Déterminer les paramètres de micropipette tirant empiriquement par des essais de rampe en suivant les instructions du fabricant de l'extracteur micropipette. Par exemple, avec une boîte de filaments, les paramètres suivants ont été dissuadentextrait pour être optimal: (Heat = 515, Pull = 60, vitesse = 60, Delay = 85, pression = 500). Ces paramètres produisent une aiguille qui se rétrécit fortement à environ 12 ° pendant environ 2 mm, puis une longue extension qui se rétrécit à environ 2 ° C pendant ~ 6 mm (figure 2).
        Remarque: Les paramètres appropriés varieront par extracteur et le filament, et aveuglément à l'aide d'un programme sans déterminer les premiers paramètres grâce à des tests de rampe peuvent détruire de façon permanente le filament de l'extracteur, ce qui est difficile et coûteux à remplacer.
      3. Suivez les instructions du fabricant pour tirer au moins 4 aiguilles micropipette de verre borosilicate avec les paramètres déterminés 2.1.2.
      4. aiguilles Stocker verticalement dans le récipient de stockage capillaire avec l'extrémité pointue vers le bas.
      5. Avant d'injecter, placez pot de stockage capillaire sur la glace pour refroidir les aiguilles. Ajouter un morceau de serviette en papier humide dans le pot pour éviter l'évaporation une fois que les aiguilles sont remplis.
    2. Fertiliser Eggs (TousÉtapes réalisées à la température ambiante)
      1. Bande d' embrayage d'oeufs de épinoche femelle gravide en pressant doucement l'abdomen et caressant dans une direction avant vers l' arrière pour pousser les œufs à travers le cloaque et dans un plat de 35 x 10 mm 2 Petri. Ajouter un morceau humide de serviette en papier d'un côté de la boîte de Petri (ne touchant pas les oeufs) afin de créer chambre d'humidité. Placer le couvercle sur boîte de Pétri afin oeufs restent humides.
      2. Euthanize mâle épinoche à 0,025% Tricaine-S tamponnées avec du bicarbonate de sodium à 0,1%.
      3. Couper ouvrir l'abdomen, enlever les testicules et macérer dans 250 ul solution de Hank (voir Westerfield 44 pour le protocole complet pour la préparation de la solution de Hank).
      4. Fertiliser au plus 100 oeufs avec une solution de sperme de 50 pi et remuer doucement avec la pointe de la pipette pour assurer tous les œufs sont fécondés. Si l'embrayage est> 100 oeufs, fertiliser la moitié des oeufs plus tard pour faire en sorte que tous les embryons sont à un stade d'une cellule au moment de l'injection. Les œufs peuvent être laissés non fécondéà la température ambiante pendant une heure, et le sperme dure généralement pendant 1-7 jours à 4 ° C dans une solution de Hank.
      5. Garder les embryons couverts de boîte de Pétri couvercle après la fécondation pour éviter le dessèchement. Autoriser 20-25 min pour la première cellule à émerger et gonfler (préparer le matériel d'injection pendant ce temps).
      6. Remplir un plat 150 mm x 15 mm Petri avec de l'eau de l'épinoche. (Pour faire de l'eau de l'épinoche, d'abord préparer le bicarbonate de sodium à 10% dissous dans de l'eau déminéralisée. Ensuite, ajouter 3,5 g artificielle eau de mer mélange et 0,217 ml de 10% de bicarbonate de sodium par 1 L d'eau déminéralisée, et remuer / agiter vigoureusement pour dissoudre le sel.)
    3. Préparer la solution d'injection (alors que les œufs sont fertilisants)
      1. Préparer la solution d'injection selon le tableau 1 et le magasin sur la glace.
        Note: les concentrations de certains acides nucléiques ont été augmentés de ceux publiés pour zebrafish en raison de l'augmentation du volume de la blastomère épinoches.
    Réactif injection Tol2 injection BAC injection TALEN L' injection CRISPR
    Tol2 ARNm 350 ng 350 ng - -
    ADN 150-200 plasmidique ng 200-300 ng BAC - -
    TALEN ARNm - - 200 ng de chacun -
    ARN guide CRISPR - - - 200 ng
    cas9 ARNm - - - 400 ng
    PBS de 0,5% de phénol rouge inDulbecco 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul
    RNAse eau libre 5 ul 5 ul 5 ul 5 ul

    Tableau 1:. Réactifs d'injection Tous les mélanges doivent être préparés à un volume total sur 5 pi et stockés sur de la glace.

    1. Remplissez Needles (On Ice; Laisser au moins 10 min pour Aiguilles à remplir).
      1. Remblai au moins trois aiguilles par pipetage solution injectable de 0,5 pi sur l'extrémité émoussée haut de l'aiguille tandis que les aiguilles sont suspendus verticalement dans un bocal de stockage capillaire. Veillez à ce que la baisse reste sur le dessus et ne coule pas sur le côté et éviter les bulles.
      2. Après que le liquide rouge a surtout drainé à l'extrémité pointue de l'aiguille, ajouter un autre 0,5 pi à l'extrémité émoussée de l'aiguille et le laisser égoutter.

    3. Préparer Inject Rig et aiguille pour microinjection

    Remarque: Ces étapes cune habitude être fait après la fertilisation des œufs.

    1. Allumez la lumière de transillumination pour le microscope à dissection et placer une plaque de verre ~ 13 cm x 13 cm sur la base de la lumière de microscope avec 15 cm de plâtre lame sur le dessus de la plaque de verre 7 vu. Orienter la scie perpendiculaire à l'appareil d'injection avec les indentations tournées vers le support d'aiguille.
    2. Allumez l'alimentation en air et d'assurer la pression est réglée à ~ 200 kPa du régulateur.
    3. Allumez le boîtier de commande et régler les paramètres. Réglez la pression à ~ 150-175 kPa. Régler la durée d'injection à 180 msec.
    4. Desserrez le porte-aiguille, insérer une aiguille introduite dans le support jusqu'à la résistance du support en caoutchouc peut se faire sentir, et serrer jusqu'à ce que la main.
    5. Ajustez l'angle de l'aiguille à environ 45 °.
    6. Utilisez les commandes micromanipulateur pour régler l'aiguille de sorte que la fin est centrée dans le champ de vision. Zoom pour ~ 40X et se concentrer sur la pointe de l'aiguille, qui ne devrait pas être en contactle verre ci-dessous.
    7. casser doucement la pointe de l'aiguille en le saisissant avec des pinces d'horloger. Idéalement, ne se cassent pas perpendiculairement, mais plutôt à un angle de 60 ° ~. Pause près de la pointe (pas plus de 2-3 largeurs forceps loin de la fin, la figure 2).

    figure-protocol-2
    Figure 2. aiguilles de microinjection Unbroken et cassées. L'aiguille du haut est intacte et la pointe de l'aiguille en bas a été rompu avec une pince (flèche). Les aiguilles sont remplies d'une solution contenant 0,05% de rouge de phénol. Barre d' échelle = 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    1. Appuyez sur la pédale d'injection à plusieurs reprises pour vérifier si l'aiguille est cassée. Après quelques coups, de minuscules gouttelettes rouges devraient commencer à sortir de til se termine. Sinon, essayez casser l'aiguille légèrement plus élevé.
    2. Si l'aiguille a une bulle d'air, augmenter l'unité de pression et appuyez sur la pédale plusieurs fois rapidement pour travailler la bulle sur.
    3. Régler la pression Retour:
      1. Utilisez la pipette de transfert jetable pour placer quelques gouttes d'eau de épinoches sur la plaque de verre.
      2. Abaissez doucement l'aiguille dans l'eau.
      3. Augmenter la pression jusqu'à ce qu'un faible courant de liquide rose émerge de l'aiguille (indiquant une pression positive).
        Remarque: S'il n'y a pas assez de pression, l'aiguille se dresser le cytoplasme par action capillaire. S'il y a trop de pression, le volume d'injection peut être par inadvertance trop grand.
      4. Dégager l'aiguille dans la mesure du possible, de sorte qu'il ne sera pas endommagé lors de la préparation des embryons (voir ci-dessous).
    4. Vous pouvez également régler la pression à un réglage de la pression plus élevée de sorte qu'un fort courant constant de liquide sort de l'aiguille wpoule il est immergé dans l'eau. Puis, en appuyant sur la pédale pour injecter devient inutile; Cependant, l'injection doit être effectuée rapidement pour éviter une injection.
      Note: Ne pas essayer cette technique lors de l'apprentissage d'abord à injecter.

    4. microinjection

    1. Environ 25 min après la fécondation, utiliser deux embouts 10 ul de pipettes pour éliminer 5-10 embryons de l'embrayage et le transfert à la plaque de verre.
    2. Toujours en utilisant les embouts de pipettes, séparer délicatement les embryons dans des indentations individuels de la lame de scie. Faites attention à ne pas percer les embryons.
    3. En utilisant une pipette de transfert avec l'extrémité coupée de sorte embryons épinoches se tenir à l'intérieur, ajouter de l'eau de l'épinoche suffisant pour couvrir les embryons, laissez l'eau pendant 3-5 secondes, puis retirez l'excès d'eau avec la pipette, en laissant un petit volume de revêtement de l'eau chaque embryon.
      Remarque: Trop d'eau va provoquer les chorions durcir et de briser l'aiguille, mais un petit volume d'eau est nécessaire pour soulever le chOrion loin de la cellule et le jaune (figure 3A - B).
    4. En commençant par le plus embryonnaire loin, faites glisser la plaque de verre et de zoomer afin que le premier embryon remplit environ 25% du champ de vision.
    5. Abaissez l'aiguille dans le champ de vision, puis utilisez la pointe de la pipette 10 pi à tourner doucement l'embryon pour identifier le blastomère, un grain légèrement jaune bosse, soulevé de cytoplasme au - dessus du jaune (figure 3B), puis tourner de telle sorte que blastomère est directement perpendiculaire à l'extrémité de l'aiguille (tout en gardant l'embryon dans l'encoche de la lame de scie, la figure 3C).
      Note: les gouttelettes de jaune peuvent se déplacer que l'embryon est mis en rotation, il ne faut pas les utiliser comme un cadre de référence pour l'emplacement du blastomère.
    6. Abaissez l'aiguille dans le cytoplasme, mais ne poussez pas à travers le jaune sous-jacent. Appliquer une pression lentement et uniformément quand perçant le chorion pour éviter de casser l'aiguille. Si lacoudes aiguille sévèrement, se rétractent et essayez à nouveau dans un endroit légèrement différent.
    7. Enfoncer la pédale 3-4 fois pour injecter de telle sorte qu'un bol rouge avec des bords légèrement diffus remplit environ ~ 8/1 du diamètre du cytoplasme (voir la figure 3D).
      1. Évitez l' obtention d' un bolus rouge avec des arêtes vives qui ne commencent pas à diffuser, ce qui indique l' injection dans le jaune sous le cytoplasme (Figure 3E).
      2. Si une tache de couleur rose-rouge vif se diffuse rapidement, insérer l'aiguille à la suite de percer le blastomère.
      3. Si le bolus d'injection devient jaune instantanément, tourner l'embryon pour assurer la blastomère a été ciblé et injecter à nouveau (figure 3F).

    figure-protocol-3
    Figure 3. Apparition d'embryons d'épinoches avant et après l' injection. Tous les embryons sont issus de the perspective de regarder vers le bas à travers le microscope (sauf pour C 'et G). (A) avant l' addition d' eau, les embryons fécondés ont une apparence homogène avec des gouttelettes d'huile flottant à proximité de la partie supérieure du jaune d' oeuf. (B) Après addition d' eau, la houle chorion, révélant un blastomère qui fait saillie à partir du jaune d' oeuf et qui est visible dans le profil. (C) La rotation de l'embryon , de sorte que l'aiguille pénètre perpendiculairement à la chorion et blastomère. (C ') vue latérale d'une aiguille qui a perforé le chorion avec la pointe dans le cytoplasme. (D) Injection dans les résultats de cytoplasme dans une tache rouge avec des bords diffus qui se fanent au fil du temps. (E) Injection dans le jaune sous - tend les résultats du cytoplasme dans une tache rouge avec des bords définis. (F) l' injection dans le jaune d' oeuf en regard des résultats du cytoplasme d'un décalage de couleur induite par le pH du rouge au jaune. (G) latéralvue des résultats d'injection, avec Xs plus de lieux d'injection sous-idéal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    1. Utilisez les commandes micromanipulateur pour rétracter l'aiguille, en utilisant la pointe de la pipette 10 ul de maintenir enfoncée l'embryon si elle colle à l'aiguille.
    2. Après la rétraction de l'aiguille, faites glisser la plaque de verre pour aligner le prochain embryon avec l'aiguille.
    3. Après l'injection tous les embryons, utiliser la pipette de transfert pour ajouter de l'eau pour les embryons, puis les recueillir dans la pipette de transfert et dans 150 mm plat Petri plein d'eau de épinoches.
    4. Sécher la plaque de verre avec une serviette en papier pour éviter d'accumuler trop d'eau.
    5. Distribuer des embryons frais sur la scie et répétez les étapes 4.4 à 4.10.
    6. Gardez ~ 10% des embryons que les contrôles non-injecté pour veiller à ce que les embryons se développent normalement et non-injecté à utiliser comme contrôles de type sauvage pour til dosages moléculaires décrits ci-dessous.

    5. Soins post injection

    1. Incuber embryons dans des boîtes de Pétri à 18 ° C après l' injection jusqu'à l' éclosion 10. Après l' éclosion, les larves arrière dans les aquariums comme décrit 10.
    2. Verser doucement hors de l'eau d'épinoches un jour après l'injection et le remplacer par l'eau d'épinoches frais. Remplacer avec de l'eau fraîche épinoches au moins tous les deux jours après.
    3. Vérifiez les embryons morts ou malformés quotidienne. Retirer ces embryons pour prévenir la carie de contaminer l'eau.

    6. Analyse des résultats d'injection

    1. Pour l'injection de reporters fluorescents, surveiller les embryons par jour dans une pièce sombre en utilisant une dissection microscope à fluorescence avec un GFP ou un filtre DP (selon le transgène fluorescent). modèles anatomiques record de l'expression des gènes avec des photographies numériques et / ou des descriptions écrites et la tabulation du nombre de poissons avec différents expresdomaines sion (figures 4 et 5).
      Note: épinoches ont autofluorescents, les cellules étoilées pigmentaires qui sont visibles sous les filtres de GFP à partir de 4 jours après la fécondation (dpf).
      1. Pour générer des lignées stables, sauver les embryons avec une fluorescence détectable et grandir à l' âge adulte , comme décrit 10.
      2. Outcross injecté poissons adultes à poissons sauvages en utilisant la procédure de fécondation in vitro dans le décrit à la section 2.2 et de la descendance de l' écran pour la fluorescence comme décrit dans l' étape 6.1 pour chercher la progéniture fluorescente, ce qui indique la transmission du transgène réussie.
      3. Pour visualiser la fluorescence dans les larves écloses, nage libre, ajouter 500 ul de 0,8% Tricaine à l'antenne 150 mm Petri pour anesthésier les poissons et attendre jusqu'à ce que l'arrêt de poissons de passer à l'image. Rincer immédiatement à plusieurs reprises avec de l'eau de l'épinoche frais suivants l'observation et l'imagerie.
      4. Eventuellement, pour préserver la fluorescence pour plus d'imagerie, euthanasier larves0,025% (250 mg / L) Tricaine tamponné avec du bicarbonate de sodium à 0,1% et fixer pendant 4 heures à 4% de paraformaldehyde dans 1x tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C. Conserver dans 1x PBS pendant jusqu'à deux semaines.
        Remarque: fond auto-fluorescence augmente au fil du temps.
    2. Diagnostic PCR / digestion génotypage pour Mutation induction avec CRISPRs ou TALENs - Best Effectuée à 2 jours après la fécondation.
      1. Utilisez une pipette de transfert pour placer 10 embryons injectés (2 dpf, toujours en chorions) dans les 10 premiers puits d'un puits 12 PCR tube de bande. Placer le poisson de contrôle non injecté dans les deux derniers puits.
      2. Retirer l'eau épinoche excès.
      3. Ajouter 50 ul de tampon de lyse (Tris 10 mM , pH 8,3, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,3% de Tween-20 et 0,3% de NP-40) à chaque puits.
      4. La place bouchons sur les tubes et incuber à 95 ° C pendant 20 minutes dans un thermocycleur.
        Remarque: Le jaune devient blanche et caoutchouteux après l'étape d'ébullition.
      5. Retirer les couvercles et utilisez un article différentune pointe de pipette 1,000 ul macérer l'embryon dans chaque tube.
        Remarque: les débris blanc recueillera au fond du tube.
      6. Ajouter 2,5 pi de 10 mg / ml de proteinase K à chaque puits.
      7. Remplacer les couvercles et incuber à 55 ° C pendant 1 heure pour digérer les protéines, suivi par 95 ° C pendant 20 min pour inactiver protéinase K. Conserver à -20 ° C pour éviter la croissance de moisissures.
      8. Faire la PCR en utilisant une polymerase haute fidélité en suivant les instructions du fabricant. Utilisez le lysat embryon comme matrice d'ADN.
        Remarque: Veillez à retirer le liquide du haut du tube pour le modèle d'ADN, en évitant toute chorion visible ou débris jaune au fond du tube.
      9. Mélanger le produit de PCR dans un volume égal d'un mélange maître d'enzyme de restriction contenant un tampon spécifique de l'enzyme 1x et 0,25 enzyme ul par échantillon. Toujours enregistrer la moitié du produit de PCR uncut pour doser sur un gel pour confirmer les produits de PCR sont de la taille prévue. Incuber la PCR mélangé avec l'enzyme dans les conditions appropriées pourl'enzyme de restriction.
        Remarque: Certaines enzymes peuvent nécessiter d'autres rapports d'enzyme au produit un tampon de PCR; ajuster la concentration de tampon si les contrôles non-injecté ne montrent pas une digestion complète.
      10. Après la digestion, les produits sur un gel d'agarose à 1% à côté d'une échelle de taille de l'ADN pour confirmer les tailles de produit attendu.
        Note: les bandes non coupés dans les embryons injectés indiquent la présence de lésions moléculaires (figure 6) et les contrôles non - injecté doivent être entièrement digérés pour interpréter les résultats.
      11. Pour confirmer les lésions, découper des bandes non coupées à partir de gels d'agarose et purifier l'ADN avec un kit d'extraction de gel. Utiliser le séquençage Sanger, de préférence en utilisant une amorce de séquençage interne aux amorces de PCR pour confirmer lésions. En F 0 injecté embryons, un mélange de lésions sera probablement présente, ce qui provoque la qualité du Sanger lu à se dégrader à proximité du site cible.
      12. Pour produire une ligne stable, enregistrer tous les embryons injectés de embrayages qui dépistage positif pour les lésions moléculaires. gramer jusqu'à poissons, outcross, puis cribler une partie de F 1 embryons pour lésions moléculaires comme décrit dans les étapes 6.2.1 à travers 6.2.11. Si les porteurs hétérozygotes sont identifiés, la croissance F restants 1 embryons à l' âge adulte et d' identifier les individus hétérozygotes en utilisant l' ADN extrait d'un clip de la nageoire caudale.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Pour les transgènes de gènes rapporteurs qui ont une activité d'activateur, une injection réussie se traduira, l' expression cellulaire spécifique du transgène (figure 4A, 4C). Poissons injectés peuvent alors être par croisement pour produire des lignées stables (exemple d'une lignée stable de BAC représenté sur la figure 4B). Injecter l'ADN dans des embryons d'épinoches se traduit généralement par une létalité beaucoup plus élevé que l'...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Injecter une cellule embryons d'épinoches pour la transgénèse ou l'édition du génome présente trois principaux défis. Tout d'abord, par rapport à des embryons de poisson zèbre, l'épinoche embryonnaire chorion est difficile et souvent casser les aiguilles. Ce problème peut être partiellement résolu en utilisant plus épais et plus forts micropipettes de verre et d' injection perpendiculaire au chorion (voir Protocole, Figure 2). Veiller à ce que le moins d'eau possible est ajouté a...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ce travail a été financé en partie par le NIH R01 # DE021475 (CTM), une formation prédoctorale Grant 5T32GM007127 NIH (PAE), et une Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Nous remercions Kevin Schwalbach pour effectuer BAC recombineering et les injections, Nick Donde pour générer des données de séquençage Sanger CRISPR et Katherine Lipari des commentaires utiles sur le protocole d'injection.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Stéréomicroscope avec transilluminationLeicaS6e/ KL300 LED
    Micromanipulateur manuelApplied Scientific InstrumentationMM33Marzhauser M33 Micromanipulateur
    Système d’injecion de pressionInstrumentation scientifique appliquéeMPPI-3
    Unité de contre-pressionApplied Scientific InstrumentationBPU
    Kit de support de micropipetteApplied Scientific InstrumentationMPIP
    Support de base magnétiqueApplied ScientificInstrumentation Base magnétique
    PédaleApplied Scientific InstrumentationFSW
    Plaque de fer (base magnétique)NarishigeIP
    Flaming/Brown MicropipettePuller Sutter InstrumentP-97
    Pipettes de transfert jetablesFisher13-711-7M
    0,5 % de rouge de phénol en DPBSSigma  ;P0290injection tracer
    #5 forceps, biologie dumoxel  ;Outils de science fine11252-30pour casser l’aiguille
    Pot de stockage de micropipettesWorld Precision InstrumentsE210tient les aiguilles
    6", 6 dents par pouce scie à cloison sèche en plâtreLenox20571 (S636RP)tenir les œufs pour injection
    13 cm x 13 cm plaque de verren’importe quelle quincaillerie-Capillaires
    en verre borosilicaté, 1,0 mm OD/0,58 mm ID  ;World Precision Instruments1B100-F4*verre plus dur que les capillaires d’injection de poisson-zèbre
    150 x 15 mm BoîtePétri Fisherélever des embryons d’épinoches
    Boîte de Pétri de 35 mm x 10 mmFisher08-757-100Aœufs de stockage pré-injection
    Instant Ocean SaltInstant OceanSS15-10
    Bicarbonate de sodiumSigmaS5761-500G
    Méthanesulfonate de tricaïne/MS-222Western Chemical IncMS222Anesthésie/euthanasie des poissons
    Kit de transcription Sp6AmbionAM1340Pour la transcription des TALEN et des transposases ARNm
    RNkit de nettoyage facileQiagen74104purifier la transposase ou l’ARN TALEN
    QiaKit de nettoyageQiagen28104pour injection
    Protéinase K 20 mg/mlAmbionAM2546pour la préparation de l’ADN
    Nucleobond BAC 100 kitClontech740579pour la préparation de l’ADN BAC
    NotINEBR0189L
    Phusion polyméraseFisherF-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kitQiagen12943contient un tampon de rinçage d’endotoxines
    QIAQuick Extraction de gelQiagen28704  ;pour le séquençage des mutations induites
    Phénol :chloroforme :Alcool isoamyliqueSigmaP2069-100ML
    Acétate de sodiumSigmaS2889-250G
    Éthanol (grade de biologie moléculaire)SigmaE7023-500ML
    AgaroseSigmaA9539
    50x Tampon Tris-acétate-EDTAThermoFisherB49
    0.5-10 Kb Échelled’ARNThermoFisher15623-200
    Nanodrop  ; SpectrophotomètreThermo ScientificNanodrop 2000
    ParaformaldéhydeSigma158127-500G
    10x PBSThermoFisher70011-044
    1 kb Plus Échelle d’ADNThermoFisher10787-018
    Chlorure de potassiumSigmaP9541-500G
    Chlorure de magnésiumSigmaM8266-100G
    NP-40ThermoFisher28324
    Tween 20SigmaP1379-500ML
    Tris pH 8.3TeknovaT1083
    Tube PCR 12 bandesThermo ScientificAB-1113
    de FB0875714 rapide des plasmides PCR

    References

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