Évaluation des myofilaments Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilité sous-jacente cardiaque Excitation-contraction Couplage

Résumé

Cet article décrit un protocole qui évalue les changements de sensibilité du myofilament Ca²⁺ pendant la contraction dans des myocytes cardiaques isolés à partir du cœur de rat. Associée à l’électrophysiologie cardiaque, aux niveaux de cytosol systolique/diastolique Ca²⁺ et à la contraction/relaxation, cette mesure est impérative pour soutenir les mécanismes médiant le couplage excitation-contraction cardiaque chez les cœurs sains et malades.

Résumé

L'insuffisance cardiaque et des arythmies cardiaques sont les principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde entier. Cependant, le mécanisme de la pathogenèse et de dysfonctionnement du myocarde dans le cœur malade reste à être pleinement clarifié. Des preuves convaincantes récentes démontrent que les changements dans la sensibilité du myofilament Ca affectent Ca intracellulaire ²⁺ activités de l' homéostasie et canaux ioniques dans les myocytes cardiaques, les mécanismes essentiels responsables du potentiel d'action cardiaque et la contraction dans les cœurs sains et malades. En effet, les activités des canaux ioniques et des transporteurs sous - jacents potentiels d'action cardiaques (par exemple, Na ^+, Ca ²⁺ et K ⁺ et des canaux ²⁺ échangeur Na ⁺ -Ca) et le ^{Ca2 +} intracellulaire des protéines (par exemple , la manipulation., Les récepteurs de la ryanodine et Ca ^{2 +} -ATPase dans réticulum sarcoplasmique (SERCA2a) ou phospholambane et sa phosphorylation) sont classiquement mesurée Evalumangé les mécanismes fondamentaux de cardiaque excitation-contraction (CE) de couplage. Les deux activités électriques dans la membrane et les changements Ca2 ⁺ intracellulaires sont les signaux de déclenchement de couplage CE, alors que myofilament est l'unité fonctionnelle de contraction et de relaxation, et la sensibilité ^de myofilament Ca est impératif dans la mise en œuvre de la performance myofibrille. Néanmoins, peu d' études intègrent la sensibilité ^de myofilament Ca dans l'analyse fonctionnelle du myocarde sauf si elle est l'objet de l'étude. Ici, nous décrivons un protocole qui mesure sarcomère shortening / re-allongement et le intracellulaire niveau Ca ²⁺ en utilisant Fura-2 AM (de détection ratiométrique) et d' évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques de coeurs de rats. L'objectif principal est de souligner que la sensibilité myofilament Ca doit être pris en considération dans le couplage CE pour l' analyse mécaniste. enquête approfondie sur isur les canaux, les transporteurs d'ions Ca ²⁺ intracellulaire, la manipulation et la sensibilité ^de myofilament Ca qui sous - tendent myocytes contractilité dans les cœurs sains et malades fournira des informations précieuses pour la conception de stratégies plus efficaces de translation et de valeur thérapeutique.

Introduction

Excitation-contraction cardiaque (EC) de couplage est le schéma fondamental pour analyser les propriétés mécaniques du myocarde, à savoir la fonction contractile du cœur ^1,2. Couplage C'est initiée par dépolarisation de la membrane secondaire par rapport à l'activité des canaux ioniques sarcolemmiques (par exemple le canal Na ⁺ voltage-dépendants, qui peut être mesurée par des techniques de patch-clamp). L' activation subséquente de type L voltage-dépendants canaux ^{Ca2 +} (LTCCs) et influx de Ca ²⁺ par LTCCs déclencher la masse de Ca ²⁺ libération par le biais des ré....

Protocole

Le protocole est en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par les Instituts nationaux de la santé des Nations Unies (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996). Elle a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université nationale de Séoul (approbation IACUC no .: SNU-101213-1).

1. Préparation du tampon (tableau matériel et équipement)

1. Préparer 300 ml de solution d'isolation fraîches le jour de l'expérience (en mM: NaCl 135; KCl, 5,4; _MgCl2, 3,5; glucose 5; HEPES, 5, Na ₂ HPO _4,<....

Résultats

myocytes LV sont isolés des coeurs de rats normaux et hypertendus. Myocytes en forme de tige avec des stries claires (représentant sarcomères) et des contractions stables en réponse à une stimulation de champ sont considérés comme les myocytes optimales et sont sélectionnés pour les enregistrements (figure 2A). Dans l'exemple représenté en F igure 2A, une Fura 2 heures LV myocytes est chargé en position horizontale et l'ouverture de la caméra est.......

Discussion

Ici, nous décrivons les protocoles pour évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca en simple myocytes cardiaques isolés et soulignons l'importance de mesurer ce paramètre aux côtés de propriétés électrophysiologiques, intracellulaires Ca ^{2 +} transitoires, et la dynamique des myofilaments. En effet, les enregistrements d'une ou deux des paramètres ne peuvent pas expliquer les mécanismes sous-tendant la contraction cardiaque et la relaxation. A la différence des procédés clas.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 semaines
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Corée)	AHN901	Code d’assurance :645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4  ;	Sigma	71649
Albumine fœtale bovine	Sigma	A7906
Collagénase de type 2	Worthington	LS004177
Protéase	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Sondes moléculaires	F1221
Pluronic F127 Solution à 20 % dans du DMSO	Invitrogen	P3000MP
Bain d’eau agitée	Chang Shin	Modèle scientifique : C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Constructeur expérimental	Acquisition et analyse des données de couplage EC dans les myocytes
Myocytes Calcium & Système d’enregistrement de contractilité	IonOptix Ltd
Bain d’eau circulante	BS-Tech	BW2-8
Microscope à fluorescence myocytaire	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Détection vidéo	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & Interface système	IonOptix	FSI700
Source lumineuse d’excitation	IonOptix	mSTEP
Lampe ARC à haute intensité Alimentation	Cairn Recherche
Contrôleur de roue à filtres	IonOptix	GB/MUS200
Stimulateur	numérique Systèmes médicaux Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Solution d’isolation (pH : 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5,4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3,5
Taurine	Sigma		CB2742654 Concentration (mmol) 20
Na2HPO4  ;	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0,4
Solution de stockage (pH : 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5,4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5,5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0,2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Pyruvate de sodium	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Solution de perfusion (solution Tyrode, pH : 7,4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141,4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0,33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5,5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1,8  ;   ;   ;   ;   ; Pour le chargement en Fura 2AM, les concentrations de CaCl2 sont de 0,25 mM et 0,5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Concentration de Mannitol	Sigma	M4125	(mmol) 14,5
Solution de collangenase 1
Solution d’isolement (30 mL)
Albumine fœtale bovine (solution BSA 5 ml)			Concentration (mmol) 1,67 mg/mL
Collagénase de type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protéase	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0,1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0,05 mM
Collangenase Solution 2
Solution d’isolement ( 20 ml)
Albumine fœtale bovine (solution BSA 3,3 mL)			Concentration (mmol) 1,67 mg/mL
Collagénase de type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0,05 mM
Solution
Solution d’isolement ( 40mL)
Concentration d’albumine fœtale bovine	Sigma	A7906	(mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM

BSA