Conception et développement d'aptamères-or à base de nanoparticules colorimétriques Assays pour In-the-champ Applications

Résumé

La conception et le développement d'un test nanoparticule colorimétriques aptamère-or pour la détection de petites molécules pour des applications dans le terrain a été examiné. En outre, une application smart-colorimétriques dispositif (app) a été validée et le stockage à long terme de l'essai a été mis en place pour une utilisation dans le domaine.

Résumé

La conception et le développement d'une nanoparticule aptamère-or (AUNP) dosage colorimétrique pour la détection de petites molécules pour des applications dans le terrain a été examiné. des essais de couleurs à base cible de AUNP sélective ont été développés dans des milieux contrôlés preuve de concept en laboratoire. Cependant, ces régimes n'ont pas été exercée à un point de défaillance pour déterminer leur utilisation pratique au-delà des paramètres de laboratoire. Ce travail décrit une approche générique pour concevoir, développer et dépanner un dosage colorimétrique aptamère-AUNP pour les petits analytes de molécules et en utilisant le test pour les paramètres dans le terrain. L'essai est avantageuse car aptamères adsorbées passiver les surfaces de nanoparticules et de fournir un moyen de réduire et d'éliminer les fausses réponses positives aux analytes non cibles. Transitioning ce système pour des utilisations pratiques nécessaires définissant non seulement la durée de vie de l'essai aptamère-AUNP, mais établir des méthodes et des procédures d'extension à long terme capabil de stockageITIES. En outre, l'une des préoccupations reconnues avec lecture colorimétrique est le fardeau imposé aux analystes d'identifier avec précision les changements souvent subtiles dans la couleur. Pour diminuer la responsabilité sur les analystes dans le domaine, un protocole d'analyse de la couleur a été conçue pour remplir les fonctions d'identification de couleur sans la nécessité d'effectuer cette tâche sur les équipements de qualité laboratoire. Le procédé pour créer et tester le protocole d'analyse des données est décrit. Cependant, pour comprendre et influencer la conception des essais aptamères adsorbées, les interactions associées à l'aptamère, cible et AuNPs nécessitent une étude plus approfondie. Les connaissances acquises pourrait conduire à adapter les aptamères pour une meilleure fonctionnalité.

Introduction

La colorimétrie est l'une des techniques les plus anciennes utilisées dans la chimie analytique. Pour cette technique, une détermination qualitative ou quantitative de l'analyte est effectuée en fonction de la production d'un composé coloré ^1. En règle générale, des dosages de couleurs utilisent des réactifs qui subissent un changement de couleur en présence de l'espèce d'analyte, ce qui se traduit par un changement de couleur observable ou détectable dans le spectre de la lumière visible. Colorimétrie a été utilisé dans la détection de cibles allant des atomes, des ions et des petites molécules à des molécules biologiques complexes , tels que les acides désoxyribonucléiques (ADN), des peptides et des protéines ^2-4. Pour les deux dernières décennies, les nanomatériaux ont révolutionné le domaine des tests de détection, en particulier avec des essais à base de couleurs ^5-6. En combinant les propriétés chimiques et physiques uniques des nanomatériaux avec un élément de reconnaissance sélective de la cible, tels que des anticorps, des aptamères d'oligonucléotides ou des aptamères peptidiques, a conduit à la résurgence in la conception et le développement de tests de détection colorimétriques ^7.

les nanoparticules métalliques ont une propriété de changement de couleur dépendant de la taille démontrée, qui a été exploité dans la conception de nombreux essais colorimétriques. Les nanoparticules d'or (AuNPs) sont d' un intérêt particulier en raison d'un changement de couleur rouge-à-bleu distinctif, lorsque la solution dispersée de particules est amené à agréger ^8, généralement par l'addition précise de sel. La capacité de contrôler le passage de la dispersion (rouge) (bleu) des états agrégés a conduit à la création de capteurs colorimétriques pour ionique faible moléculaire, un peptide, une protéine, et des cibles cellulaires ^2-4,9. Un grand nombre de ces capteurs utilisent des aptamères que le motif de reconnaissance de la cible.

Les aptamères sont l' ADN ou de l' acide ribonucléique (ARN) des molécules sélectionnées parmi un groupe aléatoire de 10 ¹² -10 ¹⁵ séquences différentes ^10-11. Le processus de sélection identifie re cibleéléments cognitifs avec des affinités de liaison du régime de nanomoles, et l'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) est le procédé le plus communément appelé ^12-13. Les avantages d'aptamères à base d'oligonucléotides pour des applications de détection comprennent la facilité de synthèse, la modification chimique contrôlable, et la stabilité chimique ^14-15.

Une approche pour la création d'un dosage colorimétrique combine les nanomatériaux avec des éléments de reconnaissance, consiste à combiner ces deux espèces par l'adsorption physique de molécules d'ADN-aptamère aux surfaces AUNP. Par liaison cible aptamères, les aptamères subit un changement structurel ^16-18 qui modifie l'interaction de l'aptamère avec la surface AUNP, ce qui conduit à une réponse de couleur rouge au bleu ¹⁹ inductible par l'addition de sel. Cette caractéristique étonnante de AuNPs fournit un mécanisme de réponse colorimétrique observable pour les appareils à base aptamères qui peuvent être utilisés pour désigner essais colorimétriques pour différents analytes.

des essais de couleurs conçus à l'aide non-covalentes, aptamères ADN physiquement adsorbées sur les surfaces AUNP ont le stigmate d'être une faible plate-forme de capteur en raison de problèmes avec la robustesse, une propension à l'échec en dehors des paramètres de laboratoire contrôlées, et le manque d'informations disponibles pour une utilisation dans la pratique paramètres. Cependant, le dosage colorimétrique à base aptamère AUNP présente un intérêt en raison de la simplicité de fonctionnement et de la réponse de couleur observable. Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la conception, le développement, l'exploitation, la réduction de la surface liée réponse faux positif, et le stockage à long terme de l'ADN-AUNP essais colorimétriques à base en utilisant la cocaïne comme l'analyte représentatif. En outre, nous avons proposé cette adsorbé aptamère approche d'essai (Figure 1) comme étant avantageuse en raison de la simplicité et la facilité d'utilisation qui a entraîné moins d' étapes que l'approche conventionnelle pour ces ass aptamère-AUNPays. Pour ce dosage, l'aptamère a été ajouté aux AuNPs, qui ont été autorisés à adsorber à la surface pendant une période de temps prolongée. Un avantage supplémentaire de cette approche a été la réduction de la réponse aux molécules d'analyte non-cibles liées aux interactions de surface AUNP. Toutefois, la réduction de la réponse faussement positifs a été au détriment de la sensibilité du test. Par conséquent, un équilibre entre la protection de surface et de l'analyte accessibilité est nécessaire pour maintenir le bon fonctionnement du test. En outre, un défaut majeur de l'analyse des essais de couleurs par des moyens autres que l'instrumentation est que les résultats sont souvent subjectifs et ouverts à l'interprétation de l'analyste à l'analyste, en particulier lors de la tentative de différencier les différences subtiles de couleur. A l' inverse, il y a un certain nombre de problèmes avec rendant l' instrumentation de laboratoire à base utilisable en dehors du laboratoire, tels que la disponibilité de la puissance, l'aspect pratique avec la portabilité, etc. Dans ce travail, un protocole d'analyse de la couleur a été développé pour more portabilité et d'éliminer une partie de la conjecture souvent associée à essai à base de l' interprétation des couleurs ^20-21. Par rapport aux approches précédentes, cet effort efforcé de pousser ces essais à leurs limites pour des applications au-delà des paramètres de laboratoire.

Protocole

1. Synthèse via Citrate Réduction des nanoparticules d'or (AUNP) et caractérisation

1. Nettoyer un Erlenmeyer (500 ml) et une grande barre d'agitation avec 5 ml d'acide nitrique concentré et 15 ml d'acide chlorhydrique concentré dans le capot de la sécurité chimique.
   1. Mouiller toute la surface du flacon avec le lavage à l'acide, rincer le ballon avec de l'eau sans nucléase, et laisser le ballon à sécher.
2. Ajouter 100 ml de 1 mM d'or (III), le chlorure; utiliser une feuille de papier d'aluminium pour recouvrir la partie supérieure de l'acide nettoyé Erlenmeyer de chaleur et avec une agitation continue sur une plaque chaude jusqu'à ébullition.
3. Ajouter 10 ml de citrate de sodium 38,8 mM. La couleur passe du clair / gris, rouge bleu / noir, et enfin foncé sur plusieurs minutes. Continuer à mélanger avec la chaleur pendant 10 min.
4. Permettre à la suspension AUNP refroidir à température ambiante et on ajoute 110 pi de diéthylpyrocarbonate (DEPC) sous agitation continue.
5. Couvrir l'ensemble du flacon avecune feuille d'aluminium et de permettre le traitement DEPC à incuber pendant une nuit. Stockez tous AuNPs dans l'obscurité, dans des conteneurs de stockage d'ambre ou recouverts de papier d'aluminium.
6. Autoclave la suspension AUNP, refroidir à température ambiante, et filtrer à travers une membrane d'acétate de cellulose de 0,22 um des pores. Rangez la, solution stock AUNP autoclavé filtré dans l'obscurité à 4 ° C.
   NOTE: Le traitement par DEPC, la stérilisation par autoclave, et le stockage à 4 ° C permettra d'améliorer la durée de vie de l'essai aptamère-AUNP. Stockage de cette manière permettre le dosage de rester fonctionnel pendant plus de 2 mois.
7. Calculer la concentration AUNP en obtenant l' absorption Ultra Violet-Visible à 520 nm, et utiliser le coefficient d'extinction (Ɛ) 2,4 x 10 ⁸ L mol ^-1 cm ^-1 avec la loi de Beer en calculant la concentration (c). La concentration a été déterminée comme étant de 10 nm avec une taille de 15 nm, déterminée par diffusion dynamique de la lumière.
   NOTE: Les concentrations varient from de lot à lot. Diluer stocks AUNP avec de l'eau sans nucléase que nécessaire pour maintenir la 10 nM AUNP suspension souhaitée.

2. ADN aptamère, tampon, de solutions et de dosage Préparation

1. Acheter ou synthétiser des séquences aptamères en utilisant la chimie standard phosphoramidite ²² de liaison de la cocaïne qui suit:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Purifier les aptamères utilisant dessalage norme ^23. Reconstituer oligonucléotides dans l'eau sans nucléase à soit 100 uM ou mM solutions 1 boursiers. Aliquoter et conserver à -20 ° C pendant plusieurs mois.
3. Préparer des stocks d' achat ou de 1 M stérile 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) , pH 7,4, 100 mM de chlorure de magnésium (MgCl _2), et 1 M de chlorure de sodium (NaCl).
4. Préparer 50 ml de tampon sans nucléase l'eau wiconcentrations e de HEPES 20 mM, MgCl2 ₂ mM, pH 7,4 et conserver à la température ambiante pendant des mois.
5. Incuber l'ADN avec la solution mère de AUNP (10 nM) pendant 3-4 heures à la température ambiante et de protéger de la lumière. Varier le volume de AuNPs que désiré pour fournir suffisamment de l'échantillon pour les tests à effectuer (2,5-7,5 ml).
   1. Ici, utiliser des densités de chargement de 90, 120, 150 et 180 molécules d'ADN / AUNP dans ce travail. Varier le volume et les concentrations d'ADN en conséquence. Syntoniser la couverture d'ADN non souhaitées afin de réduire la surface liée AUNP réactions de couleur des analytes non cibles.
      NOTE: L'augmentation de la couverture de l'ADN permettra de réduire la sensibilité du test. Les densités de charge sont calculées à partir de la connaissance de la concentration du stock AUNP, et en calculant le nombre total de AuNPs présents dans le volume désiré destiné à être utilisé dans des expériences. Si les densités de couverture réels sont souhaitées, des protocoles existent pour obtenir ces valeurs ^7. La couverture d'ADN a été déterminée en utilisant une 50 kDa mcolonne de coupure de spin olecular de poids pour séparer l'ADN AUNP lié de l'ADN libre. Les AuNPs sont trop gros pour passer à travers la colonne de spin, tandis que l'ADN libre va passer facilement. L'étape suivante consiste à quantifier l'ADN libre recueillies à l'aide de mesures d'absorbance ou d'un seul brin colorant ADN fluorescent.
6. Ajouter un volume égal de HEPES 20 mM, MgCl2 ₂ mM, tampon à pH 7,4 et à placer l'échantillon à 4 ° C dans l'obscurité pendant une nuit. Le dosage aptamère AUNP était en HEPES 10 mM, MgCl2 ₁ mM, pH 7,4 (tampon de dosage).

3. Sel Titration et dosage Setup

1. Déterminer la concentration initiale de sel nécessaire pour induire la réponse couleur d'analyse par titrage de sel avec l'ébauche d'essai. Ajouter 20 ul de méthanol (blanc) à 180 aliquotes ul de dosage aptamère-AUNP dans une plaque de 96 puits. Titrer les échantillons avec l' augmentation des volumes de solution mère de NaCl (1 M ou 2 M) et de déterminer le point d'équivalence (Figure 2 NOTE: Le dosage peut être adapté à des volumes plus petits en maintenant le rapport du methanol à blanc (ou de l'analyte dissous) à aptamère AUNP le même dosage.
   1. Ici, déterminer le volume de NaCl nécessaire pour provoquer le moindre changement de couleur par observation visuelle. La concentration de départ de l'essai était de 75 mM et 130 mM pour MN4 et MN6 respectivement, à une densité de couverture / AUNP 60 molécule d'ADN.
      NOTE: Pour une détermination quantitative de la concentration initiale de sel, le point médian de la courbe de titrage est un bon point de départ. En outre, les concentrations utilisées varient en fonction de l'aptamère, les densités de couverture d'ADN, de la performance au jour le jour, et le lot à lot.
2. L'optimisation de la réponse de l'essai, ajouter 20 ul de molécules d'analyte dilués dans du methanol à 180 ul d'aliquotes de dosage aptamère AUNP dans une plaque à 96 puits à température ambiante. ajouter immédiatement la concentration en NaCl déterminé à l'étape précédente pour initier la réponse de couleur de dosage.
   NONTE: Utiliser une pipette multicanaux pour effectuer des expériences multiples simultanément.
3. Obtenir le plus grand changement de couleur possible en augmentant ou en diminuant la concentration de NaCl, et en comparant la réponse de la cible à la réponse en blanc. Utiliser la concentration en NaCl qui fournit la plus grande différence de réponse.
4. Observer ou mesurer la réponse de dosage 150 sec après addition de NaCl. Analyser l'absorbance à 650 nm et 530 nm en utilisant un spectromètre ou d'obtenir une photo numérique de la caméra de la réponse d'essai (voir la section 4 pour la photo protocole d'analyse).
   NOTE: Un lecteur de microplaques a été utilisé pour obtenir les mesures pour ce travail.
5. Tracer les résultats que le rapport de l' absorbance obtenue à 650 nm et 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ en fonction de la concentration en analyte. Normaliser la réponse d'essai au signal vide comme cela a été fait dans ce travail.

4. Photo et image numérique d'analyse de protocole couleur Analyse

1. Prepare les échantillons d'essai comme décrit (sections 3.2-3.3). Placer la plaque de 96 puits sur un transilluminateur.
   NOTE: Un transilluminateur de laboratoire standard est généralement trop lumineux pour obtenir des images numériques utilisables pour cette analyse. Ces transilluminateurs provoquent régulièrement espacés "lignes sombres" à apparaître dans l'image numérique en raison de l'intensité de la source lumineuse. Faire un transilluminateur à partir d'une diode électroluminescente (LED) boîte à lumière sur la base et un morceau de plastique opaque fonctionne bien.
2. Obtenir les photos de la plaque de 96 puits à 150 sec après addition de NaCl, importer les images dans le logiciel d'analyse d'images, et de calculer les (RVB) valeurs de rouge, vert et bleu moyen, en utilisant une technique d'étalement progressif, comme indiqué dans l' équation 1 ^24:
   (1)
3. Convertir les valeurs RVB de (sRGB) espace couleur RGB standard pour le diagramme de chromaticité (CIExyY) espace de couleur, en utilisant les équations ²⁴ suivantes:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Convertir les valeurs RVB exponentielles aux valeurs RVB linéaires en utilisant l' équation 2. La matrice spécifiée dans l' équation 3 est utilisée pour calculer les coordonnées X, Y et Z des valeurs de l'espace chromatique CIE ^24.
5. Calculer les x et y chromaticité valeurs en utilisant l' équation 4 représentant la couleur moyenne des pixels dans la zone sélectionnés pour l' analyse ^24.
6. Effectuer l'analyse dans chaque puits et tracer les valeurs de chrominance pour générer une courbe d'étalonnage (Figure 4). Obtenir l'erreur standard en analysant la couleur des différentes zones du même puits.

5. Congélation aptamères-AUNP Assay pour le stockage à long terme

1. Préparer les composants de dosage aptamères-AUNP comme décrit dans les sections 2.4 et 2.5. Préparer des solutions séparées contenant 1 g / ml tréhalose et 1 g / ml de saccharose dans de l'eau sans nuclease pour rendre la solution cryogène.
   REMARQUE: Les fortes concentrations de trehalose et le saccharose ont été utilisés pour réduire le facteur de dilution pour la préparation du dosage pour la congélation. Chauffer les solutions de sucre sur une plaque chauffante dans un bécher d'eau pour dissoudre complètement les sucres avant utilisation.
2. Préparer une solution contenant 19,2 mg / ml tréhalose et 4,8 mg / ml de saccharose avec le / dosage 60 AUNP MN4-ADN à un volume final de 200 ul dans des tubes de 1,5 ml de microcentrifugation. Les concentrations finales de solution de cryogène variera avec une couverture d'ADN.
   NOTE: Les échantillons à congeler ne doit pas dépasser 300 pi. Les volumes plus importants ne peuvent pas geler correctement.
3. Flash congeler les échantillons en utilisant un congélateur C -146 ° C ou de l'azote liquide. Conserver les échantillons congelés jusqu'à utilisation. Le stockage peut être dans un -80 ° C ou -20 ° C, une fois la congélation instantanée est terminée.
4. Pour ce travail, laisser les échantillons dans le -146 ° C congélateur surnuit et puis transfert à un -20 ° C congélateur pour le stockage à long terme.
   NOTE: Le flash gel peut provoquer l'aptamère-AuNPs d'agréger. Tester l'intégrité du processus de congélation en contrôlant le profil d'absorbance et en le comparant à un échantillon non congelé. Si l'agrégation est observée, augmenter la quantité de solution de cryogène pour compenser ce problème.
5. Décongeler les échantillons à la température ambiante et utiliser assez seulement échantillons nécessaires à l'expérimentation. Obtenir les spectres d'absorption des échantillons décongelés et de comparer les spectres de référence d'un échantillon dégelé traité de solution de cryogène. Mesurer l'absorbance de 400 nm à 700 nm.
6. Effectuer le titrage de sel (section 3.1), tester l'essai (section 3.2), et tracer les résultats (sections 3.3 et 3.4) comme décrit précédemment.

Résultats

L'objectif principal de ce travail était de développer et étudier la stabilité et la robustesse de l'aptamère base AUNP essais colorimétriques pour une utilisation sur le terrain. Comme l'a souligné dans une publication précédente, deux stratégies distinctes pour la création de l'essai ont été étudiés ^7. Les essais ont été appelés le aptamères Assay gratuit et adsorbées aptamères Assay. Le test a été adsorbées aptamère plus attrayant pour les besoins d'un test de détection uti...

Discussion

Au cours de la dernière décennie, les nanoparticules à base de dosages colorimétriques ont été développés pour la détection de cibles comprennent de petites molécules, l' ADN, les protéines et les cellules ^2-4. Les analyses qui utilisent l'ADN-aptamères avec des nanoparticules ont gagné l'intérêt. En général, ces essais colorimétriques sont réalisées en mélangeant l'ADN aptamère avec des molécules d'analytes , puis on ajoute à ^9-10 AuNPs. Cependant, ces essais ont été utilisés d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure d’or(III) hydrate	Sigma	254169	La pureté de 99,999 % est importante et les solutions étaient renouvelées à chaque fois
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	Nous avons constaté que le fabricant influence fortement les tests AuNP, et les solutions étaient à chaque fois renouvelées
Synergie	Bio-TEK	HT	N’importe quel spectromètre d’absorbance fonctionnera, mais un lecteur de plaques permet une analyse de plusieurs échantillons
Tampon 4-(2-hydroxyéthyle)piperazine-1-acide éthanassulfuronique (HEPES), 1  ; M stérilisée	Amresco	J848	N’importe quelle marque stérilisée conviendra
Corning, système de filtrage de 250 ml, 0,22  ; & micro ; Acétate de cellulose de m	Pêcheur	430767	D’autres membranes ont été identifiées pour éliminer les AuNPs
Spectrophophotomètre UV	Varian	Cary 300  ;	N’importe quel spectromètre d’absorbance fonctionnera
Chlorure de magnésium hexahydraté	Fluka	63068	&ge ; 98 % n’importe quelle marque conviendra
ADN	IDT	Coutume	L’ADN a été purifié avec une colonne de désalage, des techniques de purification plus avancées peuvent être utilisées
Procaïne chlorhydrate	ACROS	AC20731-1000	99 % des stocks de 1 mg/ml de méthanol ont été préparés
Acide chlorhydrique	Pêcheur	A144S-500	36,5-38,0 % avec d’autres marques fonctionneront
Cocaïne chlorhydrate	Lipomed	COC-156-HC-1LM	Nous avons constaté que le fabricant influence fortement les tests AuNP
Acide nitrique	Pêcheur	A509-SK212	65 % avec d’autres marques conviendront
Solution de chlorure de sodium, qualité bioréactif 5 M	Sigma	S5150-1L	Les solutions stériles faites à partir de solide fonctionnent
Pyrocarbonate diéthyle	Sigma	D5758-25 mL	&ge ; 97 % n’importe quelle marque conviendra
Chlorhydrate d’ecgonineméthylester	Lipomed	COC-205-HC-1LM	Nous avons obtenu le contrôle EME auprès du même fabricant que la cible de cocaïne
Tubes microcentrifuge, Axygen Scientific, non stériles, 1,7  ; Ml	VWR	10011-722	Nous avons constaté que le fabricant influence fortement les tests AuNP, et les tubes ont été autoclavés en interne
Eau sans nucléase
méthanol