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Article de méthode

Un modèle de souris de Retinal Ischémie-reperfusion Grâce à une élévation de la pression intraoculaire

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DOI :

10.3791/54065

⸱

14 juillet 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un procédé d'induction de la rétine lésion d'ischémie-reperfusion par une pression intra-oculaire élevée chez les souris. Rétinal lésion d'ischémie-reperfusion par une pression intra-oculaire élevée permet de modéliser des pathologies humaines caractérisées par l'oxygène compromise et la fourniture des nutriments dans la rétine, ce qui permet aux chercheurs d'étudier les mécanismes cellulaires et des traitements potentiels pour des maladies humaines de l'unité neuro-vasculaire rétinien.

Résumé

Retinal ischémie-reperfusion (I / R) est un processus physiopathologique contribuant à des dommages cellulaires dans plusieurs affections oculaires, y compris le glaucome, la rétinopathie diabétique et les occlusions vasculaires rétiniennes. modèles murins de I / R blessures fournissent des idées importantes dans les mécanismes et les stratégies de traitement pour I blessures / R humain, en particulier en ce qui concerne les dommages neurodégénérative dans l'unité neurovasculaire rétinienne. Présenté ici est un protocole pour induire rétinienne I / R blessures chez les souris par élévation de la pression intraoculaire (PIO). Dans ce protocole, la chambre antérieure oculaire est canulée avec une aiguille, à travers laquelle coule le goutte à goutte d'un réservoir de solution saline élevée. L'utilisation de cette goutte à goutte pour élever la PIO au-dessus de la pression artérielle systolique artérielle, un praticien arrête temporairement le flux sanguin rétinien interne (ischémie). Lorsque la circulation est rétablie (reperfusion), par le retrait de la canule, de graves dommages cellulaires ensuive, ce qui entraîne en fin de compte dans la neurodégénérescence de la rétine. stud récentes démontrent l'inflammation, la perméabilité vasculaire, et la dégénérescence des capillaires comme des éléments supplémentaires de ce modèle. Par rapport aux méthodes I / R rétiniennes alternatives, telles que la ligature artérielle rétinienne, rétinienne I / R blessures par PIO élevée offre des avantages dans sa spécificité anatomique, tractability expérimentale, et l'accessibilité technique, se présentant comme un outil précieux pour l'examen de la pathogenèse et le traitement neuronal dans l'unité neuro-vasculaire rétinien.

Introduction

Rétinal ischémie-reperfusion (I / R) caractérise de nombreuses pathologies rétiniennes humaines, y compris le glaucome, la rétinopathie diabétique et les occlusions vasculaires rétiniennes 1. Dans rétinienne I / R, réduction du flux sanguin (ischémie) dans la vascularisation rétinienne crée un état ​​d'hypersensibilité rétinienne à l' oxygène et d' autres nutriments, précipitant oxydatif sévère et lésions inflammatoires lorsque la circulation est ensuite rétablie (reperfusion) 2. La rétine neurale apparaît particulièrement vulnérable à ces changements, avec la neurodégénérescence rétinienne étant peut-être le trait le plus saillant de dommages I / R-induite. Présenté ici est un protocole pour la modélisation des blessures rétinienne I / R chez la souris. Cette technique permet aux chercheurs d'examiner les mécanismes potentiels et les stratégies de traitement pour les maladies humaines de l'unité neurovasculaire rétinienne.

Introduite en 1952 par les chirurgiens qui cherchent à comprendre les conséquences neurodégénératives de l' anémie chirurgicale 3, rodent rétinienne I / R par élévation de la pression intraoculaire (PIO) a été rétablie en 1991 dans le but de normaliser les paramètres neurodégénératives après lésion ischémique 4. En utilisant le goutte à goutte d'un réservoir de solution saline pour augmenter IOP au-dessus de la pression artérielle systolique, ces études ont démontré que la canulation oculaire sous pression était suffisante pour suspendre la circulation rétinienne et d'initier ainsi la dégénérescence neuronale. Des efforts plus récents utilisant rétinienne I / R par PIO élevée ont commencé à élaborer les mécanismes sous - jacents I / induite par R-neurodégénérescence rétinienne 5-12. Plusieurs groupes ont rapporté des changements pathologiques supplémentaires , y compris l' inflammation 13,14, 15,16 perméabilité vasculaire et capillaire dégénérescence 14,17. Pris ensemble, ces études ont établi rétinien I / R blessure par une PIO élevée en tant que modèle de la maladie neuro-vasculaire de la rétine de façon plus générale.

Caractériser les mécanismes de I / R blessures est essentielle pour l'étude de vamaladie scular. Retinal I / R blessures par une PIO élevée est l' un des nombreux modèles de lésion induite par l' hypoxie, y compris les blessures I / R dans le poumon 18, le cœur, le cerveau 19 20, le foie, les reins 21 22, et de l' intestin 23. Ces modèles ont été primordiale dans l'avancement de notre compréhension de la maladie vasculaire et ses remèdes cliniques. En étendant l'étude des processus I / R aux tissus oculaires, rétinienne I / R blessures en PIO élevée contribue à brosser un tableau plus complet de ces conditions connexes.

Correspondant étroitement avec les conditions cliniques neurodégénératives dans la rétine, la rétine I / R blessures par PIO élevée présente un outil précieux pour les chercheurs intéressés à explorer la pathogénie ischémique. Le protocole décrit ici est ciblé, traitable, et accessible. Il est bien complété par points de terminaison dans la dégénérescence neuronale, comme la quantification des neurones de la rétine, la mesure de l'épaisseur rétinienne, et r électrophysiologiquenregistrement de la fonction des neurones de la rétine. Ce modèle a prouvé son utilité dans l'avancement de l'enquête neurovasculaire, et il montre la promesse de gagner le statut en tant que protocole fondamental dans la recherche en médecine visuelle.

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Protocole

Déclaration éthique: Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices énoncées par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins.

Nota: Les souris utilisées pendant le tournage sont C57BL / 6 de Jackson, bien que d'autres souches ou espèces de rongeurs peuvent également être utilisés. Lors de l'utilisation d'autres souches ou espèces, il faut savoir que des doses d'anesthésie et de blessures timeline peuvent varier. Il est important d'adapter les conditions I / R pour accueillir la souche, des espèces et des variations expérimentales.

1. Préparer le cocktail Anesthésie

  1. Combiner 1,25 ml de kétamine, 0,625 ml de xylazine, 0,375 ml acépromazine et 22,75 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate dans un tube à centrifuger de 50 ml.
    NOTE: Pour le reste du manuscrit, cette solution sera désigné comme le cocktail.
  2. Filtrer le cocktail dans un nouveau tube de centrifugation stérile de 50 ml en utilisant une seringue de 60 ml et un filtre de 0,20 um. Étiquette et la date de cette nouvelle tuêtre.
  3. envelopper complètement le tube de cocktail dans une feuille d'aluminium pour empêcher la dégradation induite par la lumière de l'anesthésique.
    NOTE: Le cocktail peut être conservé à température ambiante et réutilisé jusqu'à la date d'expiration de son ingrédient première date d'expiration.

2. Préparer l'anesthésie Booster

  1. Dans un tube de centrifugation de 50 ml, mélanger 4 ml de kétamine et 16 ml de tampon phosphate salin.
    NOTE: Cette solution sera désormais désigné comme le rappel.
  2. Filtrer le servomoteur dans un nouveau tube de centrifugation stérile de 50 ml en utilisant une seringue de 60 ml et un filtre de 0,20 um. Étiquette et la date de ce nouveau tube.
    NOTE: Le rappel peut être conservé à température ambiante et réutilisé jusqu'à la date d'expiration de son ingrédient première date d'expiration.

3. Préparer le bloc opératoire

  1. Réglez la température ambiante entre 18 ° C et 21 ° C.
  2. Allumez la table d'opération, et d'ajuster sa chaleur de surface à la highetempérature st.
  3. Couvrir toutes les surfaces de travail avec underpads chirurgicales.
  4. Disposer une cage vide ou un autre récipient sur la table chirurgicale pour se réchauffer.
  5. Organiser une échelle et un tagger de l'oreille sur le plan de travail.

4. Préparer la solution saline équilibrée avec Héparine de sodium

  1. Ajouter 0,5 ml d'héparine sodique pour 500 ml IV flacon de solution saline équilibrée (HBSS).
  2. Insérez l'extrémité pointue de l'ensemble primaire prepierced tube Y place dans la bouteille de 0,1% de l'héparine sodique.

5. Mettre en place le pôle IV

  1. Accrochez la bouteille de 0,1% l'héparine sodique de l'extension de pôle IV, et enclenchez ouvrir le couvercle du filtre à air sur l'ensemble primaire prepierced tube Y-site.
  2. Élever la bouteille d'héparine de sodium à 0,1% à 163 cm (120 mm Hg). Mesurer la hauteur de la table au sommet de la goutte d'héparine de sodium.
  3. Retirez toutes les bulles d'air dans la tubulure IV en effleurant manuellement le jeu primaire prepierced tube Y-site.

6. Mettre en place l'héparine de sodium goutte à goutte

  1. Connecter le jeu primaire prepierced tube Y-site pour le collecteur à cinq soupapes.
  2. Connectez calibre 30 ½ pouces aiguilles à collecteur à cinq ports à l'aide de Luer mâle luer raccords de tubes mâles.
  3. Insérer chacune des aiguilles de calibre 30 ½ pouces dans son propre segment de 10 pouces de tube de calibre 30.
  4. Utilisation de hémostatiques, briser les pointes d'aiguille de nouvelles de calibre 30 ½ aiguilles pouces et insérer leurs extrémités franches dans le tube de calibre 30. Stérilité ou la désinfection des pointes d'aiguilles seront nécessaires pour l'étape 8.3.
  5. En utilisant du ruban, disposer les tubes de calibre 30 avec des aiguilles de telle sorte que les tubes connectés aux ports intérieurs sont positionnés au-dessus des tubes raccordés aux orifices extérieurs. Cette disposition permettra d'éviter l'emmêlement du tube pendant la chambre antérieure cathétérisme.
  6. Mettre en marche l'écoulement d'héparine de sodium à 0,1% par rapport au collecteur à cinq soupapes et à chaque orifice individuel.
    1. Veiller à ce que le 0,1%héparine sodique coule fortement pour chaque port. Si un port coule faiblement, remplacez le port ou l'effacer avec de l'air à partir d'une seringue stérile.
    2. Permettre à l'héparine sodique à 0,1% à l'écoulement pour 2 - 3 min pour éliminer les bulles d'air des tubes de calibre 30 et 5 soupapes multiples.
  7. Éteignez tous les ports sur le collecteur 5 soupapes.

7. Préparer les souris pour la chirurgie

  1. Apportez les souris à la suite chirurgicale. Fournir des bouteilles d'eau pour chaque cage, afin d'empêcher la déshydratation des animaux pendant la chirurgie.
  2. Noter le poids de chaque souris.
  3. Injecter chaque souris par voie intrapéritonéale avec 0,02 ml cocktail par gramme de poids corporel.
  4. Tag et noter le nombre de chaque souris.
  5. Placez toutes les souris dans le récipient vide sur la table d'opération. 5-10 min pour permettre à toutes les souris pour obtenir une anesthésie profonde telle que confirmée par l'absence de la réponse de retrait de la pédale de pincement de l'orteil.
  6. Pour chaque souris, administrer une goutte deTROPICAMIDE dans chaque oeil pour dilatation de la pupille et la lubrification à court terme.
  7. Pour chaque souris, administrer une goutte de Proparacaine dans chaque oeil pour l'anesthésie locale et la lubrification à court terme.
  8. Disposer les souris dans l'ordre de anesthetization de telle sorte que la première souris à anesthésier sera la première souris pour être canulée.
  9. Autoriser 2 min pour l'oeil environ gouttes pour prendre effet.
  10. Préparer droites morceaux de 4 pouces de ruban adhésif en tirant fermement sur la bande. Mettez de côté un morceau de ruban adhésif pour chaque souris.
    NOTE: Ne pas tirer fermement sur la bande se traduira par le curling de la bande.

8. Cathétériser la Chambre Anterior

  1. Arranger la première souris sous le microscope chirurgical et focaliser le microscope sur la cornée préférée.
    NOTE: Le cathétérisme peut être effectuée sur les deux yeux. chirurgiens dominants de droite peuvent i trouvert plus facile à cathétériser l'œil gauche, tandis que les chirurgiens dominants de gauche peuvent préférer la droite.
  2. Activer le premier orifice d'héparine de sodium à 0,1% par rapport au collecteur à cinq soupapes.
  3. Sous le microscope chirurgical, utilisez une paire de pinces pour proptose doucement l'œil. Insérer l'aiguille de canule de calibre 30 dans la chambre antérieure à peu près à mi-chemin entre les fibres de zonule et le sommet de la cornée.
    1. Prenez soin de ne pas rayer ou perforer l'iris, lentille, ou surface cornéenne intérieure.
    2. Évitez pénétrer la cornée une seconde fois.
    3. L'utilisation d'une torsion mouvement doux pour surmonter la friction entre la canule et la cornée, insérez la canule profondément dans la chambre antérieure.
  4. Utilisez une bande de ruban adhésif pour fixer le tube de calibre 30 à la table. Pour minimiser le mouvement de la canule insérée, appuyez sur le tube de calibre 30 contre la table tout en atteignant pour la bande.
  5. Notez l'heure de début de la chirurgie.
  6. Utilisation du microscope, vérify qu'aucune fuite est apparente. Si une fuite est présente, le déplacement du fluide sera visible à proximité de l'oeil.
  7. confirmer visuellement distension oculaire en observant que l'œil I / R est plus grand que l'oeil controlatéral. Ensemble, l'absence de fuite et la présence d'une distension oculaire montrent une élévation de la pression intra-oculaire avec succès.
  8. Appliquer hypromellose aux deux yeux. Hypromellose sert à lubrifier la cornée et de phoques microfuites. Renouveler hypromellose au besoin (environ toutes les 30 minutes) pour la lubrification soutenue.
  9. Répétez l'étape 8 jusqu'à ce que tous les animaux ont été canulée.

9. Moniteur d'anesthésie

  1. Utilisez le pincement de l'orteil, l'observation visuelle des moustaches, ou l'observation visuelle de la queue pour vérifier que chaque souris reste anesthésié. Si une souris démontrer une réponse de la pédale de retrait, secousses moustaches, ou le mouvement de la queue, procéder immédiatement à l'étape 9.2.
  2. Si une souris commence à se réveiller pendant la chirurgie, ascenseurla queue pour injecter 0,05 ml booster intrapéritonéale dans le bas-ventre derrière la souris. Laisser 1 - 2 min pour le rappel pour prendre effet.
  3. Si une souris nécessiter une sédation supplémentaire, répétez l'étape 9 si nécessaire.

10. Retirez la canule de la chambre antérieure

  1. Pour chaque animal, après 90 min se sont écoulées, tirez doucement la canule de la chambre antérieure.
  2. Retirez le ruban de la souris à partir de la table d'opération, en prenant soin de ne pas perturber le tube de canule d'animaux adjacents.
  3. Graisser les deux yeux avec de la gelée lubrifiante.
  4. Comme canules ultérieures sont enlevés, arranger la souris dans le récipient vide sur la table chirurgicale pour récupérer de la chirurgie. Ne pas éteindre le feu de la table chirurgicale.
  5. Autoriser, au minimum, 2 - 3 h pour la récupération sur la table chirurgicale chauffée. Observer les souris fréquemment jusqu'à ce qu'ils aient complètement récupéré de l'anesthésie.

11. Nettoyer l'équationATION

  1. Désinfecter les canules en utilisant des lingettes alcoolisées.
    NOTE: D'autres méthodes de désinfection ou de stérilisation, tels que l'autoclavage, peut être substitué.
  2. Expulser à 0,1% d'héparine sodique provenant du collecteur 5 soupapes, des aiguilles de calibre 30, un tube de calibre 30 et des canules en utilisant une seringue de 60 ml rempli d'air.
  3. Rincer le collecteur 5 soupapes, des aiguilles de calibre 30, un tube de calibre 30 et des canules en utilisant une seringue de 60 ml remplie d'eau distillée.
  4. Expulsera l'eau distillée à partir du collecteur 5 ports, des aiguilles de calibre 30, un tube de calibre 30 et des canules en utilisant une seringue de 60 ml rempli d'air.
  5. Après la désinfection des canules et de rinçage de l'appareil de tube, stocker cet équipement pour la réutilisation.
  6. Store, jeter, ou désactiver tous les autres équipements. Laissez la chaleur de la table chirurgicale.

12. Retour Toutes les souris à leur domicile Cages

  1. Après les souris se réveillent de la chirurgie (après 2 - 3 h), retourner chaque animal à sa cage. Fournir de la nourriture en gel pour chaque cage. Retour toutes les cages à leurs chambres désignées.
  2. Eteignez le feu de la table chirurgicale. Jeter tous les déchets, et essuyez la suite chirurgicale.

13. Effectuer l'évaluation rétinienne

  1. Le cas échéant, recueillir des rétines pour l'analyse histologique ou souris s'adapter sombre pour l'enregistrement électrorétinogramme.

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Résultats

Les effets neurodégénératifs de la rétine I / R par PIO élevée sont généralement évalués en utilisant deux approches standard. NeuN immunomarquage des noyaux neuronaux a révélé une perte de cellules neuronales significative après I / R insulte (Figure 1). En bref, les yeux énucléés 7 jours après I / R ont été fixés dans le paraformaldehyde, étiqueté avec le marqueur des cellules neuronales NeuN, et toute-monté. Les images ont été capturées en utilisant la microscopie con...

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Discussion

Retinal I / R blessures par une PIO élevée a prouvé son utilité dans la modélisation des dommages cellulaires et le dysfonctionnement, en particulier la neurodégénérescence, dans l'unité neurovasculaire rétinienne rongeur. Cette procédure fournit un tissu de commande robuste et est facilement accessible en termes de sophistication technique. Il a été noté dans ce domaine et d' autres modèles de blessures I / R que l' augmentation de la pression et la durée de l' ischémie peut augmenter la gravité des ble...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche des National Institutes of Health (EY022383 et EY022683; EJD) et subvention de base (P30EY001765), imagerie et Microscopie Core Module.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Héparine sodique injectable, USPAbraxis Pharmaceutical Products1 000 USP/ml
BSS Solution d’irrigation stérileAlcon Laboratories, Inc.9007754-0212
Balance de poche numérique SC-2 kgAmerican Weigh Scales, Inc.SC-2 kg
Tropicamide Ophthalmic Solution USP 1 %Bausch + Lomb1 % (10 mg/ml)
Chlorhydrate de proparacaïne Solution ophtalmique USP, 0,5Bausch + Lomb0,5 % (5 mg/ml)
INTRAMEDIC Tube en polyéthylèneBecton Dickinson and Company427400Diamètre intérieur : 427400
30 G 1/2 Aiguilles PrecisionGlideBenton Dickinson and Company
BC Seringue TB de 1 ml, pointe mince avec aiguille biseautée intradermique, 26 g x 3/8Benton Dickinson and Company309625
BD Seringue Luer-Lok TipBenton Dickinson and Company309653
Microscope Zeiss OPMI Visu 200/S8Carl Zeiss AG000000-1179-101
Seringue stérileCorning Inc.CLS4312240,20 et micro ; m
Durasorb UnderpadsCovidien103823 x 24 pouces
AlcoolPrep Covidien68182 plis,
Medium Student Dumont #5 ForcepsFine Science Tools91150-20
Hartman HemostatsFine Science Tools13002-10
Primary Set, Macrobore, Prepierced Y-Site, 80 InchHospira12672-28
Saline tamponnée au phosphate pH 7,4 (1x)Invitrogen10010-049500 ml
Eau distilléeInvitrogen15230-204500 ml
C57BL/6JSouris The Jackson Laboratory664
AnaSed Injection : Solution stérile de xylazineLLOYD, Inc.20 mg/ml
Gelée lubrifiante, soluble dans l’eau bactériostatiqueMediChoiceSachet de 3 grammes
NAMIC Manchon de surveillance de la pression angiographiqueCollecteur Navilyst Medical, Inc.70039355Collecteur à 5 soupapes avec sept ports femelles
Goniosoft, hypromellose 2,5 % émollient ophtalmique Solution : hydroxypropylméthylcelluloseOCuSOFT, Inc.2,5 % (25 mg/ml)
Ketaset CIII : Chlorhydrate de kétaminePfizer, Inc.100 mg/ml
Trans-Pal I.V. Support  ;Pryor Products372Équipé d’une extension en acier inoxydable de 60 cm fabriquée à la maison
Acépromazine : Injection de maléate d’acépromazine, USPVet One10 mg/ml
de chirurgie V-Top/Hydraulique réglableVSSI100-4041-21
Raccord de tube Luer Mâle à Luer MâleWarner Instruments64-1579
de 500 ml  %305106 Table

Références

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