Imagerie intravitale de neutrophiles Amorçage Utilisation de IL-1ß conduit promoteur-DsRed Souris Reporter

Résumé

Ce protocole actuel utilise des rapporteurs fluorescents, le marquage in vivo et des techniques d’imagerie intravitale pour permettre la surveillance du processus dynamique d’amorçage des neutrophiles chez les animaux vivants.

Résumé

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine humaine et sont rapidement recrutés pour des sites inflammatoires. Amorçage est un événement critique qui améliore la fonctionnalité phagocytaire des neutrophiles. Bien que des études approfondies ont dévoilé l'existence et l' importance de neutrophiles amorçage lors de l' infection et des blessures, des moyens de visualisation de ce processus in vivo ont été indisponibles. Le protocole fourni permet de surveiller le processus dynamique de neutrophiles amorçage chez les animaux vivant en combinant trois méthodes: 1) Signal rapporteur DsRed - utilisé comme une mesure d'amorçage 2) in vivo étiquetage des neutrophiles - réalisé par injection de l' antigène anti-lymphocyte fluorescence conjugué 6G (Ly6G) anticorps monoclonal (mAb) et 3) l'imagerie confocale intravitale. Plusieurs étapes critiques sont impliqués dans ce protocole: la souris inflammation induite par l'oxazolone-cutanée de l'oreille, la sédation appropriée des animaux, des injections répétées de mAb anti-Ly6G et prevention de la dérive de mise au point lors de l'imagerie. Bien que quelques limitations ont été observées, telles que la limite de temps d'imagerie continue (~ 8 h) chez une souris et la fuite de l'isothiocyanate de fluorescéine-dextran de vaisseaux sanguins dans l'état inflammatoire, ce protocole fournit un cadre fondamental pour l'imagerie intravitale de le comportement apprêté neutrophile et la fonction, qui peut être facilement étendu à l'examen d'autres cellules immunitaires dans les modèles d'inflammation de la souris.

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants et de courte durée en circulation. Ils sont rapidement recrutés pour les sites d'infection ou d'une blessure, où ils servent phagocytes comme professionnels par la libération d'oxygène et d' azote intermédiaires réactifs ainsi que des granulés contenant des peptides et des protéases ¹ antimicrobiens. Au cours de leur recrutement, les neutrophiles sont "apprêtées" par divers agents , y compris les produits microbiens, chemoattractants et cytokines inflammatoires, entraînant nettement amélioré la fonctionnalité phagocytaire arrivée à un site d'inflammation ^2. Les mécanisme....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées en conformité avec les instituts nationaux de directives de santé et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Toledo.

1. phénotypage de pIL1-DsRed Souris

NOTE: Offspring sont générés par l'élevage des souris pIL1-DsRed hétérozygotes souris de type sauvage (WT) C57BL6. Trois à quatre semaines vieux chiots sont considérés comme prêts pour le phénotypage. Saignements Submandibulaire de souris suit un protocole établi avec des modifications mineures ^23.

1. Isolement....

Résultats

Criblage des souris pIL1-DsRed est effectuée sur la base du signal de fluorescence de DsRed phénotypiques produite par les leucocytes du sang périphérique en utilisant la cytométrie de flux. Stimulation par le LPS est connu pour induire la production d' IL-1β dans les cellules myéloïdes , y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques ^26-28. Ainsi, les leucocytes isolés sont incubés avec LPS pendant 4 heures avant de cytométrie en flux analyse. Ensu.......

Discussion

Le but de cette étude est de développer une technologie pour surveiller le processus de neutrophiles amorçage chez les animaux vivants, qui n'a pas encore été remplies par les techniques actuellement disponibles. Pour atteindre cet objectif, trois méthodes établies sont exécutées: 1) l' induction d' une inflammation cutanée chez des souris IL-1 ß reporter DsRed promoteur-driven comme une mesure de l' amorçage, 2) marquage in vivo des neutrophiles avec de faibles doses de fluorescence conjugué an.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Héparine sodique	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
Tampon de lyse ACK	Lonza	10-548E
Sérum fœtal bovin	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Chlorhydrate de kétamine	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acépromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Crème dépilatoire	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anticorps anti-souris Ly6G	BioLegend	127610
Seringue à insuline U-100 avec aiguille 28 G	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Kit de perfusion papillon (aiguille 27 G)	BD	387312
FACSCalibur cytomètre	BD Logiciel CellQuest
Pro BD
Microscope confocal	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging