Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l'ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

Summary

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Abstract

Les études génétiques basées sur la population et la famille aboutissent généralement à l’identification de variantes génétiques statistiquement associées à une maladie clinique ou à un phénotype. Pour de nombreuses maladies et traits, la plupart des variantes ne sont pas codantes et sont donc susceptibles d’agir en impactant des mécanismes subtils, comparativement difficiles à prévoir, contrôlant l’expression des gènes. Nous décrivons ici une approche stratégique générale visant à hiérarchiser les variants non codants et à les cribler pour leur fonction. Cette approche implique une hiérarchisation computationnelle à l’aide de bases de données génomiques fonctionnelles, suivie d’une analyse expérimentale de la liaison différentielle des facteurs de transcription (TF) aux allèles à risque et non risque. Pour l’analyse des variants génétiques, un oligonucléotide d’ADN synthétique (oligonucléotide) est utilisé pour identifier les facteurs dans le lysat nucléaire des cellules pathologiques ou les cellules pertinentes pour le phénotype. Pour l’EMSA, les oligonucléotides avec ou sans facteurs nucléaires liés (souvent des TF) sont analysés par électrophorèse non dénaturante sur un gel de polyacrylamide tris-borate-EDTA (TBE). Pour le DAPA, les oligonucléotides sont liés à une colonne magnétique et les facteurs nucléaires qui se lient spécifiquement à la séquence d’ADN sont élués et analysés par spectrométrie de masse ou par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium réducteur (SDS-PAGE) suivie d’une analyse par transfert de Western. Cette approche générale peut être largement utilisée pour étudier la fonction des variantes génétiques non codantes associées à une maladie, un trait ou un phénotype.

Introduction

Des études de séquençage et de génotypage à base d'études, y compris l'ensemble du génome des études d'association (GWAS), des études de locus candidat, et profond de séquençage, ont identifié de nombreuses variantes génétiques qui sont statistiquement associés à une maladie, trait, ou d'un phénotype. Contrairement aux prévisions initiales, la plupart de ces variantes (85-93%) sont situées dans des régions non codantes et ne changent pas la séquence d'acides aminés des protéines ^1,2. L' interprétation de la fonction de ces variantes non codantes et déterminer les mécanismes biologiques qui les relient à la maladie associée, trait ou un phénotype a révélé d....

Protocol

1. Préparation des solutions et réactifs

1. Commandez des sondes ADN d'oligonucléotides personnalisés pour une utilisation dans EMSA et DAPA.
   1. Pour réduire la protéine liaison non spécifique, concevoir des oligos courts (entre 35-45 paires de bases (pb) de longueur) ^30, et placer la variante d'intérêt dans le centre flanqué de sa séquence génomique endogène 17 pb. Pour oligos EMSA, ajoutez un 'fluorophore 5. Pour oligos DAPA, ajouter une balise 5 'de la biotine.
   2. Commander à la fois le brin sens et son complément inverse brin. Sinon, l'ordre duplex (pré-recuites) oligos. Lorsque vous nommez les oligos, fonder la....

Results

Dans cette section, les résultats représentatifs de ce qui les attend sont fournies lors de l'exécution d'un EMSA ou DAPA, et la variabilité en ce qui concerne la qualité de lysat est caractérisé. Par exemple, il a été suggéré que le gel et les échantillons de protéines de décongélation plusieurs fois peut entraîner une dénaturation. Afin d'explorer la reproductibilité de l'analyse EMSA dans le contexte de ces cycles "gel-dégel", deux 35 oligos pb différentes à une variante génétique ont.......

Discussion

Bien que les progrès dans les technologies de séquençage et de génotypage ont grandement amélioré notre capacité à identifier les variants génétiques associés à la maladie, notre capacité à comprendre les mécanismes fonctionnels impactés par ces variantes est à la traîne. Une source importante du problème est que de nombreuses variantes associées à la maladie sont situés dans n sur le codage des régions du génome, qui affectent probablement plus difficiles à prédire-mécanismes qui contrôlent l'expression des g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucléotides d’ADN personnalisés			d’ADN intégrées
Chlorure de potassium	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, pour tampon CE
HEPES (1 M)	Fisher Scientific	15630-080	Pour tampon CE et NE
EDTA (0,5 M), pH 8,0	Life Technologies	R1021	Pour CE, NE et tampon de recuit
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, pour tampon NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0	Invitrogen	BP1756-100	Pour tampon de recuit
Phosphate salin tamponné (1x)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, pour lavage cellulaire
DL-Dithiothreitol solution (1 M)	Sigma	646563	Agent réducteur
Inhibiteur de protéase Cocktail	Thermo Scientific	87786	Prévient le catabolisme des TFs
Inhibiteur de la phosphatase Cocktail  ;	Thermo Scientific	78420	Empêche la déphosphorylation des TF
Nonidet P-40 Substitut	IBI Scientific	IB01140	NP-40, pour l’extraction nucléaire
Kit de dosage des protéines BCA	Thermo Scientific	23225	Pour la mesure de la concentration en protéines
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contient tous les tampons EMSA nécessaires TBE
Gels, 6 %, 12 puits	Invitrogen	EC6265BOX	pour tampon
EMSA TBE (10x)	Thermo Scientific	B52	pour EMSA
FactorFinder Kit de démarrage	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contient tous les tampons DAPA nécessaires
Licor Odyssey CLx	Licor		Scanner recommandé pour DAPA/EMSA
Antibiotique-Antimycotique	Gibco	15240-062	Contient 10 000 unités/ml de pénicilline, 10 000 et micro ; g/ml de streptomycine, et 25 & micro ; g/ml de Fungizone® ; Sérum fœtal bovin antimycosique
	Gibco	26140-079	FBS, pour milieu de culture
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contient de la L-glutamine et 25 mM HEPES