Article de méthode

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l'ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

DOI :

10.3791/54093

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21 août 2016

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1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Résumé

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Les études génétiques basées sur la population et la famille aboutissent généralement à l’identification de variantes génétiques statistiquement associées à une maladie clinique ou à un phénotype. Pour de nombreuses maladies et traits, la plupart des variantes ne sont pas codantes et sont donc susceptibles d’agir en impactant des mécanismes subtils, comparativement difficiles à prévoir, contrôlant l’expression des gènes. Nous décrivons ici une approche stratégique générale visant à hiérarchiser les variants non codants et à les cribler pour leur fonction. Cette approche implique une hiérarchisation computationnelle à l’aide de bases de données génomiques fonctionnelles, suivie d’une analyse expérimentale de la liaison différentielle des facteurs de transcription (TF) aux allèles à risque et non risque. Pour l’analyse des variants génétiques, un oligonucléotide d’ADN synthétique (oligonucléotide) est utilisé pour identifier les facteurs dans le lysat nucléaire des cellules pathologiques ou les cellules pertinentes pour le phénotype. Pour l’EMSA, les oligonucléotides avec ou sans facteurs nucléaires liés (souvent des TF) sont analysés par électrophorèse non dénaturante sur un gel de polyacrylamide tris-borate-EDTA (TBE). Pour le DAPA, les oligonucléotides sont liés à une colonne magnétique et les facteurs nucléaires qui se lient spécifiquement à la séquence d’ADN sont élués et analysés par spectrométrie de masse ou par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium réducteur (SDS-PAGE) suivie d’une analyse par transfert de Western. Cette approche générale peut être largement utilisée pour étudier la fonction des variantes génétiques non codantes associées à une maladie, un trait ou un phénotype.

Introduction

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Des études de séquençage et de génotypage à base d'études, y compris l'ensemble du génome des études d'association (GWAS), des études de locus candidat, et profond de séquençage, ont identifié de nombreuses variantes génétiques qui sont statistiquement associés à une maladie, trait, ou d'un phénotype. Contrairement aux prévisions initiales, la plupart de ces variantes (85-93%) sont situées dans des régions non codantes et ne changent pas la séquence d'acides aminés des protéines 1,2. L' interprétation de la fonction de ces variantes non codantes et déterminer les mécanismes biologiques qui les relient à la maladie associée, trait ou un phénotype a révélé d....

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Protocole

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1. Préparation des solutions et réactifs

  1. Commandez des sondes ADN d'oligonucléotides personnalisés pour une utilisation dans EMSA et DAPA.
    1. Pour réduire la protéine liaison non spécifique, concevoir des oligos courts (entre 35-45 paires de bases (pb) de longueur) 30, et placer la variante d'intérêt dans le centre flanqué de sa séquence génomique endogène 17 pb. Pour oligos EMSA, ajoutez un 'fluorophore 5. Pour oligos DAPA, ajouter une balise 5 'de la biotine.
    2. Commander à la fois le brin sens et son complément inverse brin. Sinon, l'ordre duplex (pré-recuites) oligos. Lorsque vous nommez les oligos, fonder la....

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Résultats

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Dans cette section, les résultats représentatifs de ce qui les attend sont fournies lors de l'exécution d'un EMSA ou DAPA, et la variabilité en ce qui concerne la qualité de lysat est caractérisé. Par exemple, il a été suggéré que le gel et les échantillons de protéines de décongélation plusieurs fois peut entraîner une dénaturation. Afin d'explorer la reproductibilité de l'analyse EMSA dans le contexte de ces cycles "gel-dégel", deux 35 oligos pb différentes à une variante génétique ont.......

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Discussion

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Bien que les progrès dans les technologies de séquençage et de génotypage ont grandement amélioré notre capacité à identifier les variants génétiques associés à la maladie, notre capacité à comprendre les mécanismes fonctionnels impactés par ces variantes est à la traîne. Une source importante du problème est que de nombreuses variantes associées à la maladie sont situés dans n sur le codage des régions du génome, qui affectent probablement plus difficiles à prédire-mécanismes qui contrôlent l'expression des g.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Nous remercions Erin Zoller, Jessica Bene et Lindsey Hays pour leur contribution et leur orientation dans le développement du protocole. MTW a été soutenu en partie par le NIH R21 HG008186 et une subvention Trustee Award de la Fondation de recherche de l’hôpital pour enfants de Cincinnati. ZHP a été soutenu en partie par T32 GM063483-13.

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Oligonucléotides d’ADN personnalisésd’ADN intégrées
Chlorure de potassiumFisher ScientificBP366-500KCl, pour tampon CE
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Pour tampon CE et NE
EDTA (0,5 M), pH 8,0Life TechnologiesR1021Pour CE, NE et tampon de recuit
Chlorure de sodiumFisher ScientificBP358-1NaCl, pour tampon NE
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Pour tampon de recuit
Phosphate salin tamponné (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, pour lavage cellulaire
DL-Dithiothreitol solution (1 M)Sigma646563Agent réducteur
Inhibiteur de protéase CocktailThermo Scientific87786Prévient le catabolisme des TFs
Inhibiteur de la phosphatase Cocktail  ;Thermo Scientific78420Empêche la déphosphorylation des TF
Nonidet P-40 SubstitutIBI ScientificIB01140NP-40, pour l’extraction nucléaire
Kit de dosage des protéines BCAThermo Scientific23225Pour la mesure de la concentration en protéines
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910Contient tous les tampons EMSA nécessaires TBE
Gels, 6 %, 12 puitsInvitrogenEC6265BOXpour tampon
EMSA TBE (10x)Thermo ScientificB52pour EMSA
FactorFinder Kit de démarrageMiltenyi Biotec130-092-318Contient tous les tampons DAPA nécessaires
Licor Odyssey CLxLicorScanner recommandé pour DAPA/EMSA
Antibiotique-AntimycotiqueGibco15240-062Contient 10 000 unités/ml de pénicilline, 10 000 et micro ; g/ml de streptomycine, et 25 & micro ; g/ml de Fungizone® ; Sérum fœtal bovin antimycosique
Gibco26140-079FBS, pour milieu de culture
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Contient de la L-glutamine et 25 mM HEPES
Technologies http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry

Références

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  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

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Mots-clés

Liaison des facteurs de transcriptionPr paration de lysat nucl aireConception de sondes oligonucl otidiqueslectrophor se sur gel EMSABilles de streptavidine DAPAAnalyse par Western BlotLiaison all le sp cifique

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