Article de méthode

Stripe Assay pour étudier l'activité attractive ou répulsive d'un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

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DOI :

10.3791/54096

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19 juin 2016

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1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

Dans cet article

Résumé

Les molécules de guidage axonal régulent la migration neuronale et la navigation ciblée des cônes de croissance. Nous présentons une méthode puissante, le stripe assay, pour évaluer la capacité des molécules de guidage à attirer ou à repousser les neurones. Dans ce protocole, nous démontrons le test de bande en montrant la capacité de FLRT2 à repousser les neurones de l’hippocampe en culture.

Résumé

Les axones en croissance développent une structure très mobile à leur extrémité, appelée cône de croissance. Le cône de croissance entre en contact avec des signaux environnementaux extracellulaires pour naviguer dans la croissance axonale. La nétrine, la fente, la sémaphorine et les éphrines sont des molécules de guidage connues qui peuvent attirer ou repousser les axones lors de la liaison aux récepteurs et corécepteurs de l’axone. Les récepteurs activés initient diverses molécules de signalisation dans le cône de croissance qui modifient la structure et le mouvement du neurone. Ici, nous décrivons le protocole détaillé d’un test de bande pour évaluer la capacité d’une molécule de guidage à attirer ou à repousser les neurones. Dans cette méthode, des neurones dissociés de l’hippocampe de souris E15.5 sont cultivés sur des boîtes enrobées de laminine traitées avec des bandes alternées d’ectodomaine de fibronectine et de protéine transmembranaire riche en leucine 2 (FLRT2) et de protéine de région cristallisable (Fc) de fragment d’immunoglobuline G (IgG). Les axones et les corps cellulaires ont été fortement repoussés des régions de bandes recouvertes de FLRT2 après 24 h de culture. L’immunomarquage avec tau1 a montré que ~90 % des neurones étaient répartis sur les bandes recouvertes de Fc par rapport aux bandes recouvertes de FLRT2-Fc (~10 %). Ce résultat indique que FLRT2 a un fort effet répulsif sur ces neurones. Cette méthode puissante est applicable non seulement aux neurones primaires cultivés, mais également à une variété d’autres cellules, telles que les neuroblastes.

Introduction

L' orientation Axon est le processus par lequel les neurones nouvellement formés envoient des axones à leur cible au cours du développement du système nerveux 1,2. axones en développement portent une structure très mobiles à leur extrémité appelée cône de croissance. Le cône de croissance détecte les signaux extracellulaires pour naviguer le chemin de l'axone. Molécules d'orientation, telles que fente, sémaphorine et ephrines, peuvent attirer ou repousser les axones en fonction de leur interaction avec des récepteurs appropriés et co-récepteurs sur l'axone 1,3,4. Les récepteurs activés transfèrent des signaux au cône de croissance qui affectent son organisation du cytosquelette pour axone et la croissance cône mouvements.

Diverses méthodes ont été mises au point pour évaluer l'action des molécules répulsives et attractives. Chemo-attractants et insectifuges peuvent être administrés dans le milieu de croissance / culture avec une concentration de gradient (par exemple., La chambre de Dunn ou u-slides) 5,6, dans un endroit très concentré par des micro-pipette (par exemple., essai tournant) 7 ou à une concentration homogène par application de bain (par ex., le dosage de l' effondrement du cône de croissance) 8,9.

D' autres procédés comprennent un essai de rayure ou de l' impression par microcontact (uCP), dans lequel un chimio-attractant ou répulsive est appliquée sur la surface d'une plaque de substrat 10 à 12. Thestripe essai a été initialement développé par Bonhoeffer et ses collègues en 1987 pour analyser la cartographie topographique dans le poussin système rétino-tectal 13. La méthode originale nécessitait un système de vide pour des protéines d'enveloppe sur des membranes Nucleopore polycarbonate en utilisant des matrices et des rayures maillés. Dans les versions ultérieures, les protéines recombinantes ont été imprimées directement sur ​​la surface d'une plaque de culture dans un motif rayé en utilisant fente étroite matrices de silicium 14,15. Récemment, divers groupes de recherche ont appliqué avec succès ce test de bande à l'analyse des activités de molécules de guidage axonal 16-21.

Ici, nous présentons le protocole détaillé pour un essai de bande qui mesure l'attraction ou la répulsion des molécules de guidage axonal pour les neurones hippocampiques dissociées. En particulier, cette méthode peut être appliquée dans des conditions de laboratoire très peu équipés. Pour ce dosage, des bandes alternées d'un substrat marqué de manière fluorescente et une protéine de contrôle sont générés sur une boîte en matière plastique en utilisant une matrice de silicium avec des fentes 90 um et recouvertes de laminine. Dans notre démonstration, dissociées les neurones hippocampiques de souris E15.5 ont été cultivées sur des bandes de ectodomaine recombinant de la fibronectine et la leucine-riche en protéines 2 transmembranaire (FLRT2) et le contrôle de la protéine Fc 21 alternance. Après 24 h de la culture, à la fois les axones et les corps cellulaires des neurones ont été fortement repoussés par les bandes de FLRT2. Coloration avec un anticorps anti-Tau1 ~ a révélé que 90% des neurones ont été distribués sur les régions Fc revêtues, par rapport à environ 10% sur la FLRT2-Fc, ce qui indique que FLRT2 a une forte répulsionfonction pour les neurones hippocampiques 21.

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Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'École de médecine de l'Université Hamamatsu.

1. Préparation des matrices

  1. Faire bouillir 4-8 matrices de silicone dans un micro-ondes ou sur une plaque chauffante pendant 5 minutes et laissez-les sécher complètement pendant 1 h sous flux laminaire (côté rayé vers le haut).
    Remarque: Les procédures suivantes doivent être effectuées sous flux laminaire.
  2. Souffler de l'air comprimé ou d'utiliser du ruban adhésif transparent pour enlever toute la poussière du côté rayé des matrices. Gardez le côté rayé propre afin qu'il puisse adhérer fermement à la surface de la plaque.
  3. Placez délicatement les matrices sur des boîtes en plastique de 6 cm en appuyant avec un doigt (une matrice par plat, côté bande vers le bas). Évitez les bulles d'air entre la matrice et le plat. Marquer la position des bandes sur le côté inférieur de la boîte de culture.
  4. Si la matrice ne parvient pas à joindre, répéter de l'étape 1.2.

2. Stripe Generation et laminine revêtement pour Neuron Culture

  1. Préparer une protéine recombinante marquée par fluorescence (25 pi chacun pour injection [étape 2.2] ou 100 ul chacun pour le procédé de mise en place [étape 2.2.1]) en mélangeant la protéine Fc-étiquetée (10 à 50 ug / ml) et une dye- fluorescente un anticorps anti-Fc humain conjugué (1 à 3, le rapport: 30 à 150 pg / ml) dans un tampon phosphate salin (PBS). Ensuite, laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante.
  2. En utilisant une seringue de 22 G, l' injection de 25 ul de la protéine recombinante préparée dans l'étape précédente (2,1) à travers le petit trou sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E).
    1. En variante, placer 100 pi de la protéine recombinante dans la fente supérieure de la matrice et aspirer environ la moitié de la solution du petit trou (flèches sur la figure 1A, 1C et 1E), de sorte que la protéine recombinante reste dans les régions rayées.
  3. Incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.
  4. Placer 300 ul de PBS dans la fente supérieure (figure 1B) et aspirer du petit trou situé sur le côté de la matrice (flèches sur la figure 1A, C et E) pour éliminer les protéines recombinantes seules. Ne pas aspirer le PBS complètement, parce que les protéines vont sécher. Répéter deux fois cette étape. (3 fois au total)
  5. Retirez délicatement la matrice et placer immédiatement ~ 100 ul de protéine de contrôle (10-50 pg / ml; Fc) pour couvrir la zone rayée entier, créant un revêtement alternatif. Ensuite, laisser incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire.
  6. Après lavage de la surface de la boîte à trois reprises avec du PBS, enduire ~ 100 pi de 20 pg / ml de laminine dans du PBS.
    Remarque: laminine doit être décongelé sur de la glace pour empêcher la solidification.
  7. Laisser incuber le plat pendant 1 h à 37 ° C dans l'incubateur de culture cellulaire.
  8. Laver la surface de la boîte à trois reprises avec PBS et ajouter la culture medium. Placer le récipient revêtu de milieu de culture dans un incubateur à CO2 à 5% à 37 ° C jusqu'à utilisation.

3. La culture hippocampique Neurones de E15.5 embryons de souris

  1. Euthanasier mère par dislocation cervicale et d'isoler trois E15.5 embryons.
  2. Couper la peau et le crâne sagittale sur la ligne médiane de la tête avec des ciseaux, et retirer le cerveau à l'aide d'une petite cuillère. Transférer le cerveau soigneusement dans une boîte de Petri de 60 mm contenant 3 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
  3. L' utilisation d' un scalpel, découper les hémisphères , y compris le cortex, l' hippocampe et le striatum (figure 2A). Puis, disséquer la région hippocampique en retirant soigneusement les méninges, et transférer les tissus hippocampiques disséqués à un tube centrifuge de 15 ml contenant 2 ml de solution HBSS, sur la glace (figure 2B-C). Collecter 6 hippocampes de 3 embryons dans le tube, qui sont suffisantes pour la culture de neurones dans 8 plats.
  4. Remplacer le Hla solution BSS avec une solution de trypsine / EDTA (2 ml) et on incube le tube à 37 ° C pendant 15 min dans un bain d'eau.
    Remarque: Aspirer HBSS sans centrifugation et ne décante la solution HBSS en inclinant le tube.
  5. Neutraliser l'activité de la trypsine en ajoutant 500 pi de sérum de fœtus bovin (FBS).
  6. Centrifuger le mélange à 100 g pendant 5 min. Eliminer le surnageant et on lave le culot avec 2 ml de milieu de culture. Répétez cette étape une fois de plus.
  7. Pipet les hippocampes de haut en bas 10 fois dans un milieu de culture à l'aide d'une pointe de 1000 pi avec un grand trou (coupe-tip) de dissocier le tissu.
  8. Passez à une base régulière (uncut) pointe de 1000 pi et pipeter le tissu dissocié de haut en bas pour obtenir une suspension à cellule unique.
  9. Séparer les cellules individuelles en les faisant passer à travers un tamis à mailles cellule-80-100 pm.
  10. Centrifuger la suspension cellulaire unique filtré à 150 g pendant 5 min.
  11. Retirer le surnageant par aspiration et resuspendre le pellet (neurones) dans 2 ml de milieu de culture.
  12. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre avec une coloration au bleu trypan pour déterminer la densité et la viabilité. Ensuite, la plaque de 10.000 neurones dans 150 ul de milieu de culture pour chaque ensemble de stripes.The suspension doit être soigneusement placé pour couvrir la région de bande entière.

4. Visualisation des organes et des axones par immunofluorescence cellulaires en utilisant un anticorps anti-Tau1

  1. Après 24 h de culture, aspirer le milieu sans perturber les cellules adhérentes, et fixer les neurones avec pré-chauffé 4% de paraformaldehyde (PFA) / 4% de saccharose / PBS à température ambiante pendant 15 min.
  2. Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Si vous le souhaitez, utiliser un stylo hydrofuge pour dessiner un cercle autour de la région rayée pour diminuer la quantité d'anticorps nécessaire.
  3. Perméabiliser les neurones avec 0,3% de Triton X-100 / PBS pendant 5 min.
  4. Incuber les neurones avec une solution de blocage contenant 3% de sérum d'âne et 0,1% de Triton X-10030 min suivi d'une incubation avec un anticorps anti-Tau1 (1: 200) dans le sérum d'âne à 1% / 0,1% de Triton X-100 / PBS O / N à 4 ° C.
  5. Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Incuber les neurones avec un anticorps IgG anti-souris conjugué à un fluorophore dans 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS pendant 30 min.
  6. Laver la surface de la plaque 3 fois avec du PBS. Couvrir la région rayée avec un 18 mm verre de couverture x 18 mm en utilisant 50 pl de antifade solution. éviter les bulles d'air, qui interfèrent avec la formation d'image.
  7. Obtenir des images fluorescentes avec un microscope à fluorescence en utilisant le système approprié, par exemple, x10 objectif, jeux de filtres pour la GFP et RFP, et le temps d'exposition de 1000 msec (Figure 3).

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Résultats

Neurones hippocampiques dissociées de souris E15.5 ont été étalées et cultivées pendant 24 h sur des bandes de contrôle marquées par fluorescence Fc (figure 3A-C) ou FLRT2-Fc (Figure 3D-F) en alternance avec Fc non marqué contrôle. Dans les deux cas, les neurones ont été agrégées et ont étendu leurs axones sous forme de faisceaux. Sur le contrôle des bandes Fc / Fc, les neurones ont été distribués uniformément sur ​​les bandes marquées par fluorescence e...

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Discussion

Ce protocole décrit un test de bande qui utilise une protéine recombinante et les neurones dissociés de l'hippocampe de souris E15.5. Ce dosage permet d'observer l'efficacité des réactions de répulsion, attirant ou neutre de neurones à une protéine recombinante d'intérêt placé dans un motif rayé. Un avantage majeur de ce protocole est le procédé simple pour produire des bandes, dans lequel la protéine est directement imprimée sur la surface d'une boîte en matière plastique, par rapport à la méthode t...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (23700412, 25122707 et 26670090 à S.Y.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à centrifuger de 15 mlViolamo  ;1-3500-01
Paraformaldéhyde (PFA) à 4 %Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Anticorps IgG anti-humain pour chèvreThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Anticorps IgG anti-souris pour âneThermo ScientificA-21203Dilution 1/500
Anticorps anti-Tau1ChemiconMAB3420Dilution 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481Possibilité d’utiliser d’autres milieux de montage
Supplément B27Thermo Scientific17504-044Dilution 1/50
Albumine sérique bovineSigma01-2030-2
Passoire à cellules 100 umBD Falcon352360
Machine de centrifugationKubota2410
Verre de couverture 18mmx18mmMatsunami18x18 mm N° 1
Stylo DAKODAKOS2002Stylo hydrofuge alternatif
Scalpel jetableFeather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Microscope fluorescentNikonE600
Pince n° 5Outils de science fine11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Dilution 1/100
Hamilton SeringueHamilton805N22 gauge, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
IgG humaines, Fc FragmentJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
Thermo Neurobasal Scientific21103-049
Sérum d’âne normalJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Pénicilline-StreptomycineThermo Scientific15070-063Dilution 1/100
Boîte de culture en plastique, 60 mmThermo Scientific150288
Matricesen siliconeDisponible et disponible à l’achat auprès du Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
StéréomicroscopeOlympusSZ61
Pointe, 1000 uLWatson125-1000S
Ruban adhésif transparentTesa57315Du ruban adhésif alternatif peut être utilisé
Triton X-100SigmaT8787
Bleu trypan, 0,4 %Bio-Rad145-0013
Trypsine/EDTAThermo Scientific25300-054
Milieude culture Neurobasal supplémenté en B27, GlutaMAX et pénicilline-streptomycine.

Références

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Mots-clés

Guidage axonalr pulsion prot iqueprot ine FLRT2neurones dissoci srev tement la laminineimmunomarquage Tau1culture cellulaireliaison prot ique

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