L'isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l'intestin grêle Lymphocytes murine

Résumé

La caractérisation quantitative des lymphocytes intestinaux suscite un intérêt croissant en raison de la reconnaissance croissante du fait que ces cellules jouent un rôle essentiel dans diverses maladies intestinales et systémiques. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler des populations de cellules uniques de différents compartiments de l’intestin grêle pour une caractérisation ultérieure de la cytométrie en flux.

Résumé

Les intestins - qui contiennent le plus grand nombre de cellules immunitaires de tout organe dans le corps - sont constamment exposés à des antigènes étrangers, à la fois microbienne et alimentaire. Compte tenu de la compréhension croissante que ces antigènes luminal contribuent à façonner la réponse immunitaire et que l'éducation des cellules immunitaires dans l'intestin est critique pour un certain nombre de maladies systémiques, on a accru l'intérêt pour la caractérisation du système immunitaire intestinal. Cependant, de nombreux protocoles publiés sont laborieux et prend du temps. Nous présentons ici un protocole simplifié pour l'isolement de lymphocytes à partir propria de l'intestin grêle lamina couche intraépithéliales et les plaques de Peyer qui est rapide, reproductible et ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux. Bien que le protocole met l'accent sur l'intestin grêle, il est également adapté à l'analyse du côlon. De plus, nous mettons en évidence certains aspects qui peuvent avoir besoin d'optimisation supplémentaires en fonction de la ques scientifique spécifiquetion. Cette approche se traduit par l'isolement d'un grand nombre de lymphocytes viables qui peuvent ensuite être utilisés pour l'analyse par cytométrie de flux ou d'autres moyens de caractérisation.

Introduction

La tâche principale de l'intestin grêle est souvent considérée comme la digestion et l' absorption des nutriments ^1. Bien que cette fonction métabolique est évidemment essentiel, de l'intestin grêle a un rôle tout aussi important dans la protection de l'hôte à partir du barrage continu des antigènes environnementaux trouvés dans la lumière ^2. Le tractus intestinal sépare le monde extérieur (par exemple., Antigènes luminal) à partir de l'environnement interne de l'hôte avec une couche épithéliale qui est seulement une couche cellulaire unique épaisse. En tant que tel, le système immunitaire de l'intestin grêle a la formidable tâche d'équilibrer son seuil pour la réactivité, ce qui permet des antigènes étrangers provenant de l'alimentation et commensaux microbes d'entrer dans la muqueuse avec un minimum, le cas échéant, la réponse immunitaire lors du montage d'une réponse robuste contre les agents pathogènes envahisseurs et d'autres antigènes "nuisibles". Réponses immunitaires excessives ou inappropriées à ces antigènes peuvent conduire à une maladie pathologique (par exemple., Inflammamaladie tory de l' intestin, diabète de type I, la sclérose en plaques) et doit être évitée ^3-6.

Dans l' ensemble, le tractus gastro - intestinal est considéré comme représentant le plus grand organe immunitaire dans le corps, contenant plus de 70% de toutes les cellules sécrétrices d'anticorps ^7. Le système immunitaire de l' intestin grêle est composé de 3 compartiments principaux - la lamina propria (LP), la couche intraépithéliale, et les plaques de Peyer (PP) - que chacun contient un groupe distinctif de lymphocytes ^2. Les lymphocytes LP (LPLs) sont principalement des cellules avec des cellules ~ 20% B TCRap ⁺ T; lymphocytes intraépithéliaux (LIE) contiennent très peu de cellules B avec plus de cellules TCRγδ ⁺ T que les cellules TCRap ⁺ T; et PPs, qui sont les organes lymphoïdes secondaires embarqués dans le petit-intestinal mur, contiennent ~ 80% de cellules B. Bien que chacune de ces régions anatomiques a des fonctions légèrement distinctes et les bases ontologiques, ils fonctionner dans ahla mode armonized pour protéger l'hôte contre les insultes pathogènes.

En outre, il est de plus en plus l' appréciation que le microbiote est un facteur déterminant pour le développement du système immunitaire intestinal, avec l' augmentation de la reconnaissance de la relation entre les microbes spécifiques apparenté et l'ontogenèse des particuliers lignées cellulaires ^8,9. En outre, étant donné que l' éducation du système immunitaire intestinal affecte les réponses immunitaires dans des sites anatomiquement éloignés (par exemple., L' arthrite, la sclérose en plaques, la pneumonie), il est devenu clair que le développement du système immunitaire intestinal est pertinent pour plus de processus de la maladie que précédemment reconnu ^{10 -12.} En tant que tel, l'intérêt pour l'évaluation quantitative du système immunitaire intestinal a étendu au-delà des interactions hôte-pathogène pour inclure désormais les interactions hôte-commensal et la pathogenèse de nombreuses maladies systémiques ainsi.

Compte tenu de la variabilité des méthodes actuelles dans leisolement des lymphocytes intestinaux, un procédé qui est optimisé pour le rendement, de la viabilité et l'uniformité tout en équilibrant le temps nécessaire est de plus en plus critique. Les protocoles qui impliquent des gradients de Percoll sont le temps et de main - d'œuvre et potentiellement plus sujettes à l' erreur humaine, conduisant à un rendement variable et la viabilité ^13. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l'isolement et la caractérisation des lymphocytes de tous les compartiments 3 immunitaire de l'intestin grêle. De plus, l'intérêt croissant porté par des altérations induites par les microbes dans le système immunitaire des muqueuses, on comprend les étapes qui peuvent être utilisés pour permettre la transmission horizontale des micro-organismes entre la souris pour évaluer la façon dont ces modifications affectent quantitativement le système immunitaire intestinal.

Protocole

Toutes les études ont été menées en cours d'examen et les lignes directrices strictes selon le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à la Harvard Medical School, qui répond aux normes vétérinaires établies par l'American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).

1. Transmission horizontale des bactéries via Co-logement (en option)

1. Pour minimiser la contamination exogène (en particulier en cas d'utilisation des souris gnotobiotique), pratiquer une technique aseptique lors de l'assemblage des cages stériles jetables, en utilisant la nourriture et de l'eau qui ont tous deux été autoclavé.
2. Utilisez des poinçons de l'oreille ou des étiquettes pour marquer individuellement âgées de 6 semaines C57BL / 6 qui abritent différents microbiotes et loger eux dans la même cage. Étant donné que les souris sont coprophages et mangent pelotes fécales du sol de la cage, les microbes seront naturellement transmises horizontalement entre les souris.
3. souris Co-maison pour ≥1 semaine pour laisser le temps pour le transfert microbien et le changement immunologique avant l'analyse.

2. Préparation d'une suspension cellulaire unique de la couche intraépithéliale Petit-intestinal et la lamina propria

1. Préparation des solutions
   1. Préparer des milieux d'extraction (par l'intestin grêle): 30 ml de RPMI + 93 ul de 5% (p / v), dithiothréitol (DTT) + 60 ul d'EDTA 0,5 M + 500 ul de sérum foetal bovin (FBS). Ajouter le TNT immédiatement avant utilisation.
   2. Préparer les médias de digestion (par l'intestin grêle): 25 ml de RPMI + 12,5 mg dispase + 37,5 mg de collagénase II + 300 pi de FBS. Ajouter la dispase et de la collagénase immédiatement avant utilisation.
   3. Pour toutes les incubations effectuées à 37 ° C, des solutions Préchauffer à 37 ° C.
2. Euthanize la souris par asphyxie au _CO2 suivie d' une dislocation cervicale.
3. Placez la face dorsale de la souris vers le bas et pulvériser l'abdomen avec 70% d'éthanol. Utilisez des ciseaux pour effectuer une laparotomie en coupant successivement la peau et le fascia puis péritonéale le long de la ligne médiane ventrale from la symphyse pubienne du processus xiphoïde, exposant ainsi la cavité péritonéale.
4. Utilisez des ciseaux pour séparer de l'intestin grêle de l'estomac par sectionnant le sphincter pylorique. Retirez délicatement le petit intestin du péritoine, taquinant le gras mésentérique.
   1. Pour supprimer complètement le petit intestin, faire une deuxième coupe à la jonction iléo-caecale. Placer le petit intestin isolé à froid ( par exemple., 4 ° C) , RPMI contenant 10% de FBS pour maximiser la viabilité cellulaire.
5. Retirez délicatement les gros morceaux de graisse à l'aide des pinces incurvées. Faites preuve de prudence pour éviter de déchirer le tissu intestinal lui-même tout en essayant d'enlever la graisse.
6. Pour supprimer le contenu intestinal, rincer délicatement les intestins avec 15 - 20 ml de PBS froid à l'aide d'une aiguille d'alimentation 18 G fixée à une seringue.
7. Utilisez des ciseaux pour exciser PPs, et les placer dans RPMI froid contenant 5% de FBS. PPs sont situés sur le côté antimésentérique du petit intestin et apparaissent comme un blanc multi-lobuléeMasse. En fonction de la souche spécifique, une souris a typiquement 8 - 12 PPs.
8. Couper l'intestin grêle dans 3 - 4 segments de pouce.
9. Retirer le gras résiduel en roulant chaque segment de l'intestin grêle sur une serviette en papier humidifié avec RPMI, en utilisant un scalpel terne pour taquiner la graisse loin du tissu.
10. Tourner le tissu à l'intérieur par canulation les segments intestinaux avec des forceps incurvés et de saisir l'extrémité distale du tissu. Ensuite, utilisez une paire de pinces droites pour enlever délicatement le segment de tissu de la pince incurvées (commençant à l'extrémité proximale), ce qui entraîne dans le tissu étant inversé.
11. Placez les segments de tissu dans une tasse contenant 30 ml de milieu d'extraction et une barre d'agitation. Fixer le couvercle sur la coupe, et on agite à 500 tours par minute pendant 15 minutes à 37 ° C; agitation devrait être vigoureuse mais non turbulent.
12. Après incubation, utilisez une passoire en acier pour séparer les morceaux de tissu à partir du surnageant contenant l'épithélium, qui devrait apparaître nuageux. Ce surnageant contient iLes lymphocytes ntraepithelial qui peuvent être analysées plus en profondeur, le cas échéant, en procédant à un filtrage de l'échantillon dans les étapes 2,18 - 2,23.
13. agiter manuellement les morceaux de tissu dans RPMI pour laver milieux d'extraction résiduels.
14. Placez le tissu sur une serviette en papier et le retourner bout sur bout à plusieurs reprises pour faciliter l'élimination du mucus résiduel qui n'a pas été libéré par le milieu d'extraction.
15. Placer les fragments de tissu dans un tube de 1,5 ml avec 600 ul de milieu de digestion.
16. Utilisez des ciseaux pour hacher le tissu jusqu'à ce que les pièces ne collent aux ciseaux et la solution semble homogène. Cette étape est essentielle pour assurer la digestion enzymatique complète du tissu.
17. Ajouter de l'intestin grêle haché dans une tasse contenant 25 ml de milieu de digestion. Agiter à 500 tours par minute pendant 30 minutes à 37 ° C. A mi - chemin à travers la digestion (ie., À 15 min), pipeter de haut en bas avec une pipette sérologique pour aider à briser les gros morceaux de tissu.
18. Filtre tissu digéré (ou epithElial couche de l'étape 2.12 si IELs de traitement) à travers une cellule de tamis 100 pm dans un tube de 50 ml. Rincer le filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
19. Centrifuger la solution filtrée à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
20. Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
21. Filtrer les cellules remises en suspension à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Rinçage filtre avec 20 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
22. solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
23. Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS.

3. Préparation d'une suspension cellulaire unique à partir des plaques de Peyer

1. Transfert excisé PPs à une tasse avec 25 ml de milieu de digestion et une barre d'agitation. couvercle sécurisé, et un essorage à 500 tours par minute pendant 10 minutes à 37 ° C.
2. Filtre digéré PPs à travers un tamis de 40 um de cellules dans un tube de 50 ml. Si un amas remadans, les presser à travers le tamis en utilisant l'extrémité plate du piston d'une seringue de 1 ml.
3. Rinçage filtre avec 10 ml de RPMI contenant 10% de FBS.
4. solution Centrifugeuse filtré à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C.
5. Décanter soigneusement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de RPMI contenant 2% de FBS.

4. Coloration de surface pour la cytométrie de flux

1. Aliquoter volume approprié de cellules (par exemple., 200 pi de LPLs) dans une plaque à fond rond de 96 puits.
2. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
3. Resuspendre les cellules dans 90 ul de RPMI contenant 2% de FBS et une dilution 1: 100 d'anticorps anti-CD16 / 32 (bloc Fc). Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
4. Ajouter 10 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
5. Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant parinversant la plaque.
6. (Facultatif) cellules tache avec la viabilité de colorant, si désiré, en suivant le protocole du fabricant.
7. Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1% de formaline pour fixer les cellules. Incuber pendant 1 heure dans l'obscurité à 4 ° C.
8. Ajouter 200 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
9. Resuspendre les cellules dans 250 ul de PBS. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter surnageant en retournant la plaque.
10. Resuspendre les cellules dans 200 ul de PBS. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux.

Résultats

L' analyse par cytométrie de suspensions de cellules isolées de l' intestin grêle lymphocytes devrait donner une population discrète de cellules qui ont des caractéristiques similaires avant et dispersion latérale comme splénocytes (Figures 1A et 1B). Les lymphocytes peuvent commencer à mourir si le tissu ne soit pas maintenu à 4 ° C au cours des premières étapes de l'isolement, ce qui entraîne dans la population de lymphocytes ayant une dispersion inférieure vers l' ava...

Discussion

Nous présentons un protocole pour l'isolement et le flux de caractérisation cytométrie de petits lymphocytes-intestinaux, y compris le LPLs, IELs, et les lymphocytes dans le PPs. Pour ceux intéressés à évaluer comment les changements dans le microbiote affectent le système immunitaire de l'intestin grêle, nous détaillons les étapes simples impliqués dans la transmission horizontale des organismes entre les souris hébergeant différentes microbiotes. Bien que ce protocole se concentre sur l'intestin grêle, la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Gants stériles	Kimberly-Clark	555092
cage stérile pour souris	Innovive	MS2-AD	contient un couvercle, un fond de cage et une litière alpha-dri
Distributeur en métal	Innovive	M-FEED
Bouteille d’eau	Innovive	M-WB-300
Porte-cartes	Innovive	CRD-HLD-H
Rongeur autoclavable chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medium 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Ambion	AM9262
Fetal Bovin Serum (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	la concentration dans le protocole est basée sur un niveau d’activité de 1,878 U/mg
de collagénase, type II  ;	Invitrogen	17101-015	la concentration dans le protocole est basée sur un niveau d’activité de 245 U/mg
Ciseaux de dissection	Roboz	RS-5882
Aiguille d’alimentation (18 G, longueur 2")	Roboz	FN-7905
Seringue 10 ml	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Scalpel jetable (15 lames)	Miltex	4-415
Pince courbe	Roboz	RS-5211
Pince droite	Roboz	RS-5132
Gobelets polyvalents, 120 ml	VWR	89009-662
Barre d’agitation	VWR	58949-062
Plaque d’agitation multi-positions, 9 positions	VWR	12621-048
Conique en acier inoxydable passoire, 3 pouces  ;	RSVP
1.5 ml Tube	Eppendorf	0030 125.150
100 &mu ; m Crépine à cellule	Falcon	08-771-19
40 &mu ; m Crépine à cellules	Falcon	08-771-1
50 ml Tube conique	Falcon	352098
1 ml Seringue	BD	309659
96 puits Plaque à fond rond	Corning	3799
Anti-souris CD16/32 (bloc Fc)	Biolegend	101320
(En option) Colorant de viabilité fixable eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10 % Formalin, tampon neutre	Thermo Scientific	5725