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Article de méthode

Prévention de stress thermique Effets indésirables chez les rats par

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DOI :

10.3791/54122

⸱

11 juillet 2016

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1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, Auburn University

Dans cet article

Résumé

Nous avons décrit un protocole de prévention des effets du stress thermique chez le rat par prétraitement oral avec des bactéries bénéfiques. Ce protocole peut être modifié et utilisé pour diverses voies d’administration et pour l’analyse de différents composés.

Résumé

Cette étude a été conçue pour évaluer l'effet protecteur de la souche de Bacillus subtilis contre les complications liées au stress thermique. Trente-deux rats Sprague-Dawley ont été utilisés dans cette étude. Les animaux ont été traités par voie orale deux fois par jour pendant deux jours avec B. subtilis souche BSB3 ou PBS. Le lendemain , après le dernier traitement, chaque groupe a été divisé et les deux groupes expérimentaux (une traités avec du PBS et traitées avec un B. subtilis) ont été placés à 45 ° C pendant 25 min. Deux groupes témoins sont restés pendant 25 min à température ambiante. Tous les rats ont été euthanasiés et différents paramètres ont été analysés dans tous les groupes. Les effets néfastes du stress thermique sont enregistrées par la diminution de la hauteur des villosités et de l'épaisseur totale de la muqueuse dans l'épithélium intestinal; la translocation des bactéries à partir de la lumière; (LPS) niveau dans le sang augmenté vesiculation des érythrocytes et de l'élévation des lipopolysaccharides. L'efficacité protectrice du traitement est évaluée par un prévention de ces effets secondaires. Le protocole a été mis en place pour le traitement oral de rats avec des bactéries pour la prévention des complications de stress de chaleur, mais ce protocole peut être modifié et utilisé pour d'autres voies d'administration et pour l'analyse de différents composés.

Introduction

Différents facteurs de stress affectent la santé humaine et animale. La température est l’un des facteurs les plus stressants, provoquant des maladies chroniques, aiguës et même mortelles1. Des changements dans la morphologie intestinale et une perte d’intégrité de la barrière intestinale après un stress thermique ont été documentés dans de nombreux cas2,3. Cette barrière protectrice est responsable de la défense contre la translocation des bactéries intestinales et de leurs toxines, en particulier les lipopolysaccharides (LPS), de la lumière à la circulation interne4,5. La stabilité du microbiote intestinal influence de manière significative la fonction de la barrière intestinale, la réponse immunitaire de l’hôte et la tolérance aux conditions de stress6. Ainsi, la modulation du microbiote intestinal peut fournir une nouvelle approche pour la prévention des effets indésirables liés au stress.

Les bactéries bénéfiques ont été utilisées comme une stratégie prometteuse pour modifier le microbiote intestinal afin de gérer avec succès diverses affections cliniques, telles que la diarrhée, les maladies inflammatoires de l’intestin, la dermatite atopique, les troubles métaboliques7-10. Les effets probiotiques des bactéries bénéfiques comprennent la production de métabolites essentiels pour soutenir la santé intestinale, la stimulation du système immunitaire, la promotion de la tolérance au lactose, la restauration de la dysfonction épithéliale. Les probiotiques ont été efficaces dans la prévention des complications liées au stress in vitro et dans des modèles animaux11,12.

Les chercheurs ont accordé plus d’attention aux bactéries Bacillus en tant que probiotiques, car ces bactéries soutiennent l’homéostasie intestinale13 et ont des effets bénéfiques sur l’hôte14. Nos données précédentes ont démontré une grande efficacité des probiotiques Bacillus contre les agents pathogènes in vitro15,16 et dans les essais cliniques17,18. Ici, nous visons à évaluer l’effet préventif de la souche BSB3 de B. subtilis contre les complications après stress thermique.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par IACUC de l'Université d'Auburn, Auburn, Alabama.

1. Préparation de la Culture Media, Vaisselle et culture bactérienne

  1. Inoculer 10 ml de bouillon nutritif dans un flacon avec une colonie unique de la culture BSB3 Bacillus subtilis cultivées pendant une nuit sur ​​une plaque de gélose nutritive.
  2. Faire 500 ml de milieu de sporulation 19 (par litre: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (p / v) de KCl, 10 ml; 1,2% (p / v) de MgSO 4 x 7H 2 O, 10 ml; agar, 15 g) et de l' autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Laisser refroidir à 50 ° C et d' ajouter les solutions stériles suivantes: 1 M de Ca (NO 3) 2, 1 ml; 0,01 M MnCl2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml.
  3. Laisser refroidir le milieu préparé à 40 ° C pendant 20 min à température ambiante et verser dans 25 ml de chacune des 20 boîtes de Pétri stériles dans l'enceinte stérile. Que le milieu se solidifier pendant la nuit.
  4. Étaler 0,5 ml de culture de nuit de Bacillus subtilis BSB3 sur la surface du milieu dans les boîtes de Petri. Incuber la culture à 37 ° C pendant 5 jours jusqu'à 90% sporulation. Révéler phase lumineuse spores par microscopie à haute résolution.
  5. Récolte des bactéries par addition de 1 ml de phosphate de solution saline stérile tamponnée (PBS) à la plaque de raclage et les bactéries à partir d'une surface à l'aide d'un épandeur cellulaire stérile. Conserver la suspension dans le réfrigérateur jusqu'à ce que nécessaire.
  6. Confirmer la viabilité des bactéries par placage de 0,1 ml de la dilution appropriée (10 -5 à 10 -6) d'une suspension bactérienne sur des plaques de milieu de sporulation , suivie d' une incubation pendant 18-24 heures à 37 ° C.
  7. Compter les colonies bactériennes sur des plaques en utilisant un compteur de colonies et calculer le titre de bactéries dans la suspension de test. Préparer une suspension bactérienne à la concentration finale de 1 x 10 8 UFC / ml dans du PBS.

2. Animaux

  1. Utiliser 32 des rats mâles Sprague-Dawley (250-300 g). Maintenir les animaux dans des conditions exempts d'agents pathogènes spécifiques avec un accès gratuit à chow à granulés standard et l'eau. Établir une température moyenne (21 ± 1 ° C), l' humidité (50 ± 5%) et un cycle de lumière-obscurité de 12 h.

3. Conception expérimentale

  1. Démarrer le traitement des animaux par gavage oral 11, après 2 jours d'acclimatation. Utiliser la seringue avec l'aiguille de gavage oral. Traiter 16 rats avec B. subtilis BSB3 suspension (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe B. subtilis). Traiter les 16 rats avec du PBS (1 ml par rat) deux fois par jour pendant deux jours (groupe PBS) (figure 1).
  2. Après le traitement, subdiviser chaque groupe (8 rats par groupe): Groupe 1- contrôle (PBS / pas de stress), Groupe 2- B. subtilis (B. subtilis / pas de stress), Groupe 3- contrainte (PBS / stress thermique) et le groupe 4- B. subtilis + le stress (B. subtilis stress / chaleur).
  3. Mesurer la température rectale de chaque rat en utilisant un electronic thermomètre numérique. Gardez les rats des groupes 1 et 2 à la température ambiante pendant 25 min. Placer les animaux des groupes 3 et 4 dans une chambre climatique à 45 ° C et une humidité relative de 55% pendant 25 min.
  4. Ensuite, mesurer la température rectale de chaque rat dans tous les groupes à l'aide d'un thermomètre numérique électronique. Placez tous les animaux à la température ambiante pendant 4 heures.
  5. Anesthetize rats avec isoflurane (2-4%) dans un bocal d'anesthésie refermable et observer jusqu'à ce que les rats sont profondément anesthésiés (absence de réponse à pincement de l'orteil). Euthanasier rats par décapitation rapide avec une guillotine.
  6. Recueillir le sang du tronc de chaque rat 20 (15 - 16 ml) avec les pipettes apyrogènes dans des tubes apyrogènes pour obtenir le sérum et immédiatement prélever des échantillons de sang (7 pi de chaque rat) avec une pipette pour l' examen microscopique.
  7. Placer les tubes avec le sang dans un réfrigérateur pendant au moins 30 minutes pour permettre la coagulation. Tubes à centrifuger à 20 o C, 7000 xg pendant 10 min et rapidementretirer le sérum avec une pipette. Sérum aliquote obtenu à partir de chaque rat dans des volumes de 50 et conserver à -20 ° C jusqu'au dosage.

4. Procédure chirurgicale

  1. Couper / garniture tout fourrure de l'abdomen et du thorax de la face inférieure de la carcasse avec des cisailles électriques. Placer la carcasse dans une enceinte stérile et de traiter la surface rasée de la carcasse avec 70% d'alcool.
  2. Utilisation d'un scalpel stérile pour créer une incision médiane de l'abdomen. Enlever le foie, les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate et l'intestin grêle de chaque rat en utilisant des pinces stériles.

5. Analyse de la translocation bactérienne

  1. Placer chaque échantillon de foie, des ganglions lymphatiques mésentériques et la rate dans des tubes stériles pré-pesées et peser. Calculer le poids de l'échantillon en tant que différence entre le poids d'un tube à échantillon et le poids d'un tube vide.
  2. Ajouter du PBS stérile dans le tube pour obtenir une dilution de 1:10 (p / v) de l'échantillon et homonize chaque échantillon avec un homogénéiseur de tissu de verre stérile pour obtenir une suspension 21 homogène.
  3. Faire des dilutions en série (10 -1 à 10 -4) de chaque échantillon dans du PBS stérile. Plaque 0,1 ml de toutes les dilutions de chaque soie sur la surface de MacConkey et de la gélose au sang à 5% et la gélose au sang avec Brucella hémine (0,005 g / L) et de la vitamine K1 (0,01 g / L) des plaques.
  4. Incuber MacConkey et de 5% des plaques de gélose au sang en milieu aérobie et Brucella plaques de gélose au sang en anaérobiose à 37 ° C 22.
  5. Nombre de colonies de bactéries aérobies après 24 h, et les colonies de bactéries anaérobies, après 48 heures d'incubation en utilisant un compteur de colonies. Exprimer les résultats, le nombre d'unités formant des colonies (UFC) dans un gramme de tissu.

6. Analyse histologique

  1. Retirer de petits échantillons d'intestin de chaque rat par l'intervention chirurgicale (étapes 4/1 à 4/2). Fixer des échantillons dans le fixateur de Bouin, incorporer dans de la paraffine,préparer 6 um sections et des sections de tache avec de l' hématoxyline et de l' éosine en utilisant des procédures standard 23.
  2. Utiliser un système de microscope à haute résolution pour mesurer la hauteur des villosités intestinales et de l' épaisseur totale de la muqueuse dans chaque échantillon (grossissement 100X) 24. Analyser 4 échantillons de chaque rat et de faire au moins vingt mesures dans chaque échantillon. Exprimez les résultats en micromètres.

7. Cytokine Assay

  1. Utilisez des kits commerciaux rat ELISA pour IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ et l'IL-10 pour mesurer les niveaux de cytokines dans le sérum selon le protocole du fabricant.
  2. Générer des courbes standard pour chaque ensemble d'échantillons analysés en utilisant des normes pour le kit pertinent. Définir le niveau de cytokines dans chaque échantillon par comparaison des données expérimentales avec la courbe standard appropriée.

8. lipopolysaccharide Assay

  1. Analyser le niveau de LPS dans le sérum en utilisant un kit de LPS chez le rat selon la méthode ELISAle protocole du fabricant. Estimer la concentration de LPS dans des échantillons par comparaison des valeurs obtenues avec les valeurs de la courbe standard.

9. Haute Résolution Lumière Microscopie du sang

  1. Utilisez le système de microscope décrit précédemment 25,26. Utiliser une plate - forme d'isolation de vibration en tant que base pour le système de microscope et une caméra vidéo et un ordinateur 25 pour enregistrer les images en temps réel. Calibrer images de test en utilisant une diapositive Richardson comme décrit précédemment 27.
  2. Placez 7 pi de sang fraîchement prélevé sur chaque rat sur ​​une lame de verre, lamelle, photographier et enregistrer dix trames d' image de 72 × 53,3 um 2 dans chaque échantillon (grossissement 1,700X).
  3. Mesurer la concentration de vésicules en utilisant un logiciel qui fournit à haute résolution à vision directe des images optiques en temps réel. Examiner un minimum de 20 trames d' image pour chaque condition expérimentale 28.

10. Statistics

  1. Exprimez toutes les valeurs que la moyenne et l'écart type. Effectuer une analyse statistique et graphique tracé. Analyser les résultats obtenus avec le test t de deux échantillons, réglez le niveau de signification de 0,05 pour définir la signification statistique.

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Résultats

La température corporelle moyenne des animaux avant et immédiatement après le stress thermique était de 36,7 ± 0,07 o C et 40,3 ± 0,17 ° C, respectivement (P <0,05). L' exposition des rats à la chaleur (groupe 3) a entraîné une inhibition significative de la hauteur de villosités et de l' épaisseur totale de la muqueuse (figures 2, 3). L'administration orale de la souche BSB3 avant le stress protégé intestin de l'effet nocif de la...

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Discussion

L' exposition à haute température dans des conditions de santé graves 29. Prévention et détection précoce des complications liées au stress thermique sont d' une importance vitale 30. Le protocole présenté peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de diverses approches pour la prévention des effets nocifs de stress thermique.

Les étapes critiques au sein de ce protocole comprennent: la procédure de traitement thermique (45 ° C...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le fonds FOP 101002-139294-2050 de l’Université d’Auburn.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-Aldrich,  ;St. Louis, MOP4417
Alcool éthylique  ;Pharmco products Inc. Brookfield, CT, États-Unis  ;64-17-5
AgarVWR97064-334
Plaques de gélose MacConkeyVWR470180-742
Plaques de gélose au sang à 5 %VWR89405-024
Plaque de gélose au sang Brucella avec Hemin et Vitamine KVWR89405-032
Bouin' sFixative Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA15990
IL-10 Rat ELISAkit Invitrogen, Camarillo, CA, USAKRC0101
IL-1beta Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, États-UnisKRC0011
IL-6 Rat ELISAKit Invitrogen, Camarillo, CA, États-UnisKRC0061
INF-gamma Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, USA
TNF-alpha Rat ELISAKit Invitrogen, Camarillo, CA, USAKRC3011
Rat LPS ELISA KitNeoBioLab, MA, USARL0275
Chambre environnementale 6020-1Caron, Marietta, OH, USA6020-1
Centrifugeuse  ;Beckman Coulter, Indianapolis, IN, États-UnisOptima L-90K
Ultra Centrifuge
Système optique de microscope optiqueCitoViva Technology Inc., Auburn, AL
Compteur de coloniesFisher Scientific , Pittsburgh, PA, États-UnisRE-3325
CongélateurHaier, Brooklyn, NY, États-UnisHCMO50LA
Microplaque Ultra lecteurBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx 808
Auto Strip WasherBio-Tek Instrument, Winooski, VT, USAELx50
PipettesGilson, Pipetman, FranceP100, P200, P1000
C24 Incubator ShakerNew Brunswick Scientific, Enfield, CT, USAClassic C24
Rocking Shaker  ;Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, États-Unis55
Boîtes de PétriFisher Scientific, Pittsburgh, PA, États-Unis875713100 mm x 15 mm
SterilGard III AdvanceThe Baker Company, Sanford, ME, États-UnisSG403
Flacons de cultureCorning Incorporated, Corning, NY, États-Unis4995PYREX 250 ml Erlenmeyer flacons
Spectromètre optique Genesys 20Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis.4001
Sony DXC-33 Caméra vidéoSony
Richardson Lame de testMicroscopie électronique Science, Hatfield, PA, USA80303
Système de purification d’eau MilliporeLogiciel MilliporeDirect-Q
Image-Pro PlusMedia Cybernetics, MD, USA
Triple Beam BalanceOHAUS Corporation, Parsippany, NJ, États-Unis
Homogénéisateur de tissus, DounceVWR71000-518
KRC4021

Références

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