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Article de méthode

Mesure de temps de survie dans

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DOI :

10.3791/54126

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22 juillet 2016

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1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

Dans cet article

Résumé

Les rotifères sont des zooplanctons microscopiques utilisés comme modèles dans les études écotoxicologiques et de vieillissement. Nous fournissons ici un protocole pour une mesure puissante et reproductible du temps de survie chez les rotifères Brachionus. La synchronisation des conditions de culture sur plusieurs générations est particulièrement importante car l’état maternel affecte le cycle vital de la progéniture.

Résumé

Rotifers sont des zooplanctons cosmopolites microscopiques utilisés comme modèles dans les études écotoxicologiques et sur le vieillissement en raison de leurs nombreux avantages tels que leur courte durée de vie, leur facilité de culture et leur parthénogenèse qui permet la culture clonale. Cependant, la prudence est de mise lors de la mesure de leur temps de survie, car il est affecté par l’âge maternel et les conditions d’alimentation maternelles. Nous fournissons ici un protocole pour une mesure puissante et reproductible du temps de survie chez les rotifères Brachionus suite à une synchronisation minutieuse des conditions de culture sur plusieurs générations. Empiriquement, une mauvaise synchronisation entraîne une mortalité précoce et une diminution progressive du taux de survie, ce qui entraîne une faible puissance statistique. En effet, dans de telles conditions, la restriction calorique (RC) n’a pas réussi à prolonger de manière significative la durée de vie de B. plicatilis, bien que la longévité induite par la RC ait été démontrée avec des échantillons de rotifères bien synchronisés dans des études passées et présentes. Ce protocole est probablement utile pour d’autres modèles d’invertébrés, y compris la mouche des fruits Drosophila melanogaster et le nématode Caenorhabditis elegans, car des effets sur l’âge maternel ont également été rapportés chez ces espèces.

Introduction

Les rotifères sont microscopiques zooplancton cosmopolite (<1 mm) qui constituent le phylum rotifères 1. Ils ont un plan de corps simple composé d'environ 1000 cellules somatiques, ainsi qu'un appareil de ciliaire de roue comme caractéristique appelée la couronne, qui est utilisé pour la locomotion et l'alimentation. La plupart des rotifères appartiennent à des classes Monogononta ou Bdelloidea, qui contiennent environ 1.600 et 500 espèces, respectivement 2. Rotifères Monogonont ont généralement deux phases de la reproduction sexuée et asexuée (parthénogenèse cyclique), tandis que les rotifères bdelloides reproduisent par parthénogenèse obligatoire 3. Il est ainsi possible d'obtenir des individus de rotifères génétiquement identiques, ce qui assure une grande reproductibilité des expériences. En outre, ils ont plusieurs autres avantages comme organismes modèles, comme une courte durée de vie, la facilité de la culture, la disponibilité des données de séquences génomiques et transcriptomiques 4-7, et une position phylogénétique unique , distante d'unerthropods et nématodes 8. Les rotifères sont donc prometteurs modèles d'invertébrés dans écologiques, toxicologiques et études sur le vieillissement 9-12.

Le temps de survie en cas d' exposition au stress ou à des produits chimiques de l' environnement est un paramètre fréquemment mesurée dans ces domaines de recherche 13-19. Toutefois, la prudence est nécessaire lors de la mesure de la durée de survie des rotifères parce qu'il est sensible aux conditions environnementales de leurs mères. A savoir, dans le monogonont Manjavacas rotifères Brachionus, progéniture femelle de mères âgées ont une durée de vie plus courte que celles des jeunes mères; Cependant, la restriction calorique maternelle (CR) compense partiellement les effets délétères de 20 l' âge maternel avancé. Dans B. plicatilis, CR maternelle fournit la progéniture de la longévité, le temps de survie longtemps sous la famine, et de haute résistance au stress oxydatif associé à l' expression accrue des enzymes antioxydantes 21,22. L'effet de l'âge maternela également été observée dans les rotifères bdelloides 23. Par conséquent, les conditions de rotifères expérimentales doivent être soigneusement synchronisées sur plusieurs générations avant que les mesures de temps de survie.

Ici , nous fournissons un protocole pour la mesure du temps de survie en rotifères Brachionus suivant la synchronisation des conditions de culture sur plusieurs générations. Le jeûne intermittent (SI), une variation de CR où rotifères sont nourris régulièrement, a été appliquée pour révéler l'effet de la synchronisation en raison des effets bien connus du SI sur la longévité 22,24.

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Protocole

1. Préparation des milieux

Remarque: Utilisez la moitié diluée Brujewicz eau de mer artificielle de la salinité de 16,5 ppt (PSU). Autres seawaters artificiels sont aussi fréquemment utilisés pour la culture Brachionus rotifères 25,26.

  1. Ajouter du NaCl 454 mM, 26 mM de MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM de KCl et 10 mM de CaCl2 à 4,5 litres d' eau distillée (volume final sera de 5 L). Vous pouvez également utiliser l'eau de dilution désionisée au lieu de l'eau distillée. Ajouter CaCl 2 après dissolution de tous les autres sels.
  2. Préparer le M NaHCO3 solution stock 0,48 (concentration 200x). Ajouter 25 ml de celui-ci à la solution ci-dessus. La concentration finale de NaHCO 3 est de 2,4 mM.
  3. Préparer le M NaBr solution mère 0,4 (concentration 500x). Ajouter 10 ml de celui-ci à la solution ci-dessus. La concentration finale de NaBr est de 0,8 mM. Compléter à 5 litres avec de l'eau distillée.
  4. On filtre la solution avec un filtre à membrane de 0,45 um.Diluer deux fois avec de l'eau stérile avant utilisation (v / v).
    Note: Il est possible de faire une concentration de 2x de Brujewicz eau de mer artificielle comme une solution de stock.

2. Conditions générales Culture

  1. Culture laboratoire surélevé ou rotifères sauvages capturés dans un bécher de 100 ml stérile entre 20 et 30 ° C. Des températures plus élevées se traduisent par une durée de vie plus courte et la reproduction accélérée. Utiliser 25 ° C pour la commodité des expériences. La densité ou le volume d'eau de mer artificielle rotifères est pas un gros problème ici.
  2. Culture espèces de microalgues alimentaires dans l' eau de mer artificielle 11. Voir Snell et al. (2014) pour plus de détails 11. En règle générale, utilisez Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 cellules / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 cellules / ml 25,29), et Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 cellules / ml 30,31). Depuis le régime alimentaire des algues (espèces, culture conditions, des compositions biochimiques) influe de manière significative le temps de survie des rotifères Brachionus, utiliser le même lot de microalgue dans tous les groupes expérimentaux.
  3. Gardez une population stock de rotifères dans une culture discontinue en alimentant et en changeant les médias à l' occasion (par exemple, nourrir tous les 2 jours et ensemencer chaque semaine). Beaucoup de nouveau-nés et les adultes portant 2-3 œufs peuvent être observés lorsque les rotifères sont dans des conditions optimales.
    Remarque: Une autre façon d'obtenir des rotifères expérimentales est de faire éclore des oeufs de repos. Rotifères éclos à partir d' oeufs de repos sont considérés comme étant bien synchronisés et leur durée de vie ne soit pas sensiblement différente de celle de rotifères à partir d' œufs éclos amictiques 11. Cependant, rotifères à partir d'œufs de repos commencent reproduction plus tôt que ceux des œufs amictiques. Ainsi, la prudence est nécessaire pour les mesures de leurs traits de reproduction.

3. Synchronisation des rotifères par pré-culture

  1. Sélectionnez un seul rotifères de la stla population et la culture ock comme décrit dans 2.1-2.3 pour établir une sous-population qui sera utilisé pour des expériences. Typiquement culture pendant deux semaines.
  2. Collecter rotifères oeuvées de la sous-population (collecter un nombre double de personnes qui seront utilisés pour l'expérience). Culture comme une seule cohorte (densité: ~ 50 individus / ml) dans une plaque de culture à 6 puits tel que décrit dans 2,1-2,3 dans un nouveau média dans l' alimentation ad libitum. Contrôle de la densité de population est importante parce que le milieu conditionné affecte la physiologie de la reproduction des rotifères Brachionus 32,33.
  3. Transfert des nouveau-nés éclos à partir des premiers oeufs des adultes aux milieux de culture nouvellement préparé. Répétez cette procédure sur 2-3 générations.
  4. Utiliser le nouveau - né éclos dans un laps de temps donné (par exemple, <3 h) pour mesurer le temps de survie. Pour éviter un biais possible dans le choix du seul individu, bien que très improbable, vérifier la reproductibilité en utilisant plusieurs indépensous-populations pendantes.
    Remarque: Comme les rotifères se reproduisent généralement asexuée sous cette condition, assurez-vous pas de mâles sont présents tout au long de l'expérience. Les mâles sont plus petits que les nouveau-nés et se déplacent généralement plus vite que les femelles. Femelles Mictic ont des durées de vie différentes des femelles amictiques sous certaines conditions 29.

4. Les mesures de temps de survie

  1. La place dans les nouveau-nés des plaques en plastique (en général 24 ou 48 puits des plaques, avec chaque puits contenant 1 ml d'eau de mer artificielle).
  2. A intervalles de 24 heures, transférer les rotifères aux milieux de culture nouvellement préparés ou à des intervalles de 12 h si, à une température plus élevée (30 ° C ou au-dessus). Notez le nombre de descendants et si chaque individu est mort ou vivant. Notez le rotifères comme mort lorsque le mouvement des cils de la couronne est complètement arrêté.
    Nota: Les rotifères se fixent souvent sur les parois latérales des puits. pipetage doux de l'eau aide à les trouver. Si rotifères sont introuvables ou are accidentellement endommagé par le pipetage, les enregistrer comme «censuré», non pas comme «mort».
  3. Retirer les nouveau-nés lorsque rotifères expérimentales reproduisent activement. Les nouveau-nés grandissent rapidement et il est parfois difficile de les distinguer des rotifères expérimentales.

Analyse 5. Données

  1. Créer la survie courbe de Kaplan-Meier (figures 1 et 2) en traçant le taux de survie cumulatif sur l'axe et le temps Y sur l'axe des X. Ceci est la représentation la plus courante de données de survie. Utilisez le test log-rank non-paramétrique (aussi appelé test de Mantel-Cox) pour comparaison statistique du temps de survie 34. Le test du log-rank est également inclus dans d'autres progiciels statistiques standards tels que JMP et R.
    Note: Ne pas utiliser le test t ou une analyse de variance (ANOVA) suivie par comparaison multiple paramétrique de Student parce que la distribution normale est généralement pas satisfaite par les données de survie 35. En outre, ces méthods ne prennent pas les individus censurés en compte. test de Mann-Whitney U peut être utilisé s'il n'y a pas de données censurées.

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Résultats


La figure 1 montre les courbes de survie représentatives des populations mal synchronisées (sur deux répétitions). Dans cette expérience, les rotifères étaient soit tous les jours nourris [groupe ad libitum (AL)] ou tous les autres jours (IF groupe). La médiane de survie était de 13 et de 18 jours dans l'AL et si des groupes, respectivement. Bien qu'il soit bien connu que IF prolonge la durée de vie du rotifères, cette expérience n'a pas réussi...

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Discussion

Le protocole actuel décrit un procédé pour mesurer le temps de survie chez les rotifères Brachionus. L'étape critique est la synchronisation des conditions de rotifères sur plusieurs générations. Lorsque rotifères expérimentaux sont bien synchronisés, une courbe I de survie de type typique est observé avec très peu de mortalité précoce comme rapporté dans plusieurs études antérieures 18,24,37,38. Les écarts-types de leur temps de survie deviennent donc plus petit par rapport à rotifères synchroni...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à George Jarvis, Martha Bock, et Bette Hecox-Lea, Laboratoire de biologie marine, pour leur aide dans le tournage.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlorure de sodiumWako190-13921
Chlorure de magnésiumWako136-03995
Sulfate de magnésiumWako131-00427
Chlorure de potassiumWako168-22111
Chlorure de calciumWako035-00455
Bicarbonate de sodiumWako199-05985
Bromure de sodiumWako190-01515
Filtre à membrane (0,45 & micro ; PlaqueMilliporeHAWP04700
6 puits, non traitéeThomas Scientific6902D01à fond plat
, 48 puits, non traitéeThomas Scientific6902D07Tetraselmis à fond plat
, LivingCarolina Biological Supply Company152610
PRISM 6GraphPad SoftwareVersion 6.0d
de culture , Plaque de culture

Références

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