Article de méthode

Méthyl-liaison par capture d'ADN de séquençage pour les tissus du patient

DOI :

10.3791/54131

⸱

31 octobre 2016

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1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthylation est l'une des modifications épigénétiques essentielles à l'ADN, qui est responsable de la régulation précise des gènes nécessaires à un développement stable et la différenciation des différents types de tissus. Dysrégulation de ce procédé est souvent la caractéristique de diverses maladies telles que le cancer. Ici, nous présentons l'une des techniques de séquençage récents, Methyl-Binding séquençage d'ADN de capture (MBDCap-seq), utilisé pour quantifier la méthylation dans divers tissus normaux et pathologiques pour les grandes cohortes de patients. Nous décrivons un protocole détaillé de cette approche d'enrichissement d'affinité avec un pipeline de bioinformatique pour obtenir une quantification optimale. Cette technique a été utilisée pour séquencer des centaines de patients à travers divers types de cancer comme une partie du projet de méthylome 1000 (Système méthylome Cancer).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La régulation épigénétique de gènes par méthylation de l' ADN est l' un des mécanismes essentiels nécessaires pour déterminer le sort de la cellule par la différenciation stable de différents types de tissus dans le corps 1. Dysrégulation de ce processus a été connu pour causer diverses maladies , dont le cancer 2.

Ce procédé implique essentiellement l'addition de groupes méthyle sur le résidu cytosine dans les dinucléotides CpG d'ADN 3. Il y a quelques différentes techniques actuellement utilisées pour étudier ce mécanisme, chacun ayant ses propres avantages , comme indiqué dans de nombreuses études 2-8. Ici, nous allons discuter de l'une de ces techniques appelées Methyl-Binding séquençage d'ADN de capture (MBDCap-seq), où nous utilisons une technique d'enrichissement d'affinité pour identifier les régions méthylés de l'ADN. Cette technique se fonde sur la capacité de méthyle de liaison de la protéine MBD2 pour enrichir les fragments d'ADN génomique contenant des sites CpG méthylés. Nous utilisons un kit d'enrichissement de l'ADN méthylé commercialpour l'isolement de ces régions méthylées. Notre laboratoire a examiné des centaines d'échantillons de patients avec cette technique et ici nous fournir un protocole optimisé complet, qui peut être utilisée pour étudier les grandes cohortes de patients.

Comme on le voit avec toute technologie de séquençage de nouvelle génération, MBDCap-seq exige également une approche bioinformatique spécifiques afin de quantifier avec précision les niveaux de méthylation dans les échantillons. Il y a eu de nombreuses études récentes dans le but d'optimiser le processus des données de séquençage 9, 10 normalisation et d' analyse. Dans ce protocole, nous démontrons une de ces méthodes de mise en œuvre d'une approche unique de récupération de lecture - LONUT - suivie par la normalisation linéaire de chaque échantillon afin de permettre des comparaisons impartiales à travers un grand nombre d'échantillons de patients.

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Protocole

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Tous les tissus sont obtenus suite à l'approbation du comité Institutional Review Board et quand tous les participants ont consenti à la fois des analyses moléculaires et des études de suivi. Les protocoles sont approuvés par le Comité des études humaines à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio.

1. Méthyl-liaison à l'ADN de capture (MBDCap)

  1. Collecte des échantillons et l' isolement de l' ADN
    1. Collecter des tumeurs en vrac ou des échantillons de tissus normaux provenant d'échantillons de tissus de patients inclus en paraffine.
    2. Utiliser un kit d'ADN de mini-commerciale pour isoler l'ADN génomique à partir des échantillons de tissu inclus en paraffine selon le protocole du fabricant.
    3. Utiliser un kit d'enrichissement de l'ADN méthylé avec le mode opératoire décrit ici selon le protocole du fabricant.
  2. Lavage initial de perles
    Nota: Les perles sont utilisées pour coupler des protéines MBD-biotine, qui détecte méthylation de l'ADN sur le génome. Les perles sont habituellement suspendusdans une solution de stock. Utilisez ces étapes pour laver ce liquide.
    1. Resuspendre le stock de billes de streptavidine (Voir le tableau Matériaux) par pipetage de haut en bas pour obtenir une suspension homogène. Ne pas mélanger les perles par tourbillonnement.
    2. Pour une pg d'ADN d'entrée, ADD10 ul de billes dans un tube avec 90 pi de 1 x bind / tampon de lavage. Tourner pendant 1 min. Ne pas mélanger par tourbillonnement.
    3. Placer le tube (s) sur un support magnétique pour 1 min.
    4. Éliminer le liquide avec une pipette et jeter le liquide.
    5. Ajouter 250 pi de 1x Bind / Wash Buffer aux billes et faire tourner pendant 1 min.
    6. Répétez les étapes 1.2.3 - deux fois 1.2.5.
  3. Le couplage de la protéine MBD-Biotine aux billes
    1. Pour 1,2 pg d'ADN d'entrée, ajouter 7 ul (3,5 ug) de protéine MBD-Biotine à chaque tube.
    2. Ajouter 93 uL de 1x Bind / Wash Buffer à la protéine pour obtenir un volume final de 100 pi.
    3. Mélanger les perles de protéinesmélange sur un mélangeur rotatif à température ambiante pendant 1 h.
  4. Fragmenté ADN (entrée)
    1. ADN de traitement par ultrasons par l'addition de 1,2 ug d'ADN génomique total dans 96 pi de tampon TE et on pi de 5x tampon / de lavage 24 Bind pour préparer une solution de 120 ul. Utilisez la puissance de ON de 30 et de la puissance de OFF de 30 pendant la sonication, 20 - 25 fois.
    2. Exécutez 1 pl de solution d'ADN soniqué utilisant un système de Bioanalyseur avec un kit d'ADN à haute sensibilité commerciale pour vérifier la taille des fragments d'être dans la gamme de 150-350 pb selon le protocole du fabricant.
  5. Laver les MBD-perles
    1. Placer le tube contenant MBD-billes sur un support magnétique pendant 1 min.
    2. Retirer et jeter le liquide avec une pipette sans toucher les perles.
    3. Resuspendre les perles avec 250 pi de 1x Bind / Wash Buffer.
    4. Mélanger les perles sur un mélangeur rotatif à température ambiante pendant 5 min.
    5. Répétez les étapes 1.5.1 - deux fois 1.5.4.
  6. Réaction de capture d'ADN Fragmenté (1 pg d' ADN d'entrée)
    1. Transférer le mélange ADN / tampon dans le tube contenant les MBD-billes.
    2. Mélanger les MBD-perles avec de l'ADN sur un mélangeur rotatif pendant 1 heure à température ambiante. Vous pouvez également mélanger O / N à 4 o C.
  7. Retrait de l' ADN non capturé des Perles
    1. Après avoir mélangé l'ADN et MBD-perles, placer le tube sur le support magnétique pendant 1 min pour concentrer toutes les billes sur la paroi intérieure du tube.
    2. Retirer le liquide surnageant avec une pipette et l'enregistrer dans un tube de microcentrifugeuse DNase propre que l'ADN non méthylé. Conservez cet échantillon sur la glace.
    3. Ajouter 200 pi de 1x Bind / Wash Buffer aux billes de se laver les perles.
    4. Mélanger les perles sur un mélangeur rotatif pendant 3 min.
    5. Placer le tube sur le support magnétique pendant 1 min.
    6. Retirer le liquide avec une pipette et l'enregistrer dans un tube à centrifuger.
    7. Pour bouchonture réactions de ≤1 pg d'ADN d'entrée, répétez les étapes 1.7.3 - 1.7.6 pour 2 fractions de lavage au total.
  8. Simple fraction d' élution
    1. Mélanger un tampon pauvre en sel avec un tampon riche en sel (1: 1) pour obtenir un tampon d'élution (NaCl 1000).
    2. Remettre en suspension les billes dans 200 pi de tampon d'élution (NaCl 1000).
    3. Incuber les perles sur un mélangeur rotatif pendant 3 min.
    4. Placer le tube sur le support magnétique pendant 1 min.
    5. Avec le tube en place sur la grille magnétique, retirez le liquide avec une pipette sans toucher les billes avec la pointe de la pipette, et l'enregistrer dans un tube de 1,5 ml propre microcentrifugeuse DNase. Conservez cet échantillon sur la glace.
    6. Répéter les étapes 1.8.1 - 1.8.4 une fois, en recueillant le second échantillon dans le même tube (volume total sera de 400 pi). Conserver l'échantillon mis en commun sur la glace.
  9. Ethanol précipitation (ADN nettoyage)
    1. Pour chaque noncaptured, lavage et élution fraction from les étapes précédentes, ajouter 1 pl de glycogène (20 pg / pl, inclus dans le kit), le volume 1/10 de l' échantillon d'acétate de sodium 3M, pH 5,2 (par exemple 40 pi par 400 pi d'échantillon) et 2 volumes de 100% de l' échantillon éthanol (par exemple, 800 pi par 400 pi de l' échantillon). Le volume total est 1,241 pi.
    2. Bien mélanger et incuber à -80 o C pendant au moins 2 h.
    3. Centrifuger le tube pendant 15 min à 11363 xg à 4 o C.
    4. Eliminer délicatement le surnageant sans perturber le culot.
    5. Ajouter 500 ul d'éthanol à 70% froid.
    6. Centrifuger le tube pendant 5 minutes à 11.363 xg à 4 o C.
    7. Eliminer délicatement le surnageant sans perturber le culot.
    8. Répétez les étapes 1.9.6 - 1.9.7 une fois et enlever tout surnageant résiduel.
    9. Air-sécher la pastille pour ~ 5 min. Ne pas sécher complètement la pastille.
    10. Remettre en suspension la pastille d'ADN dans 37,5 ul d'eau exempte de DNase ou d'autresun volume approprié de tampon.
    11. Placer l'ADN sur de la glace ou de stocker l'ADN à -20 ° C ou moins jusqu'à utilisation ultérieure.
    12. Vérifiez que la quantité totale d'ADN est supérieur à 20 ng, (par exemple, utiliser le système de quantification fluorométrique, voir tableau des matériaux).

2. séquençage

  1. Utiliser les fragments d'ADN récupérés à partir MBDCap procédure pour le séquençage. Pour chaque échantillon à séquencer, une quantité totale de 20 - 40 ng d'ADN est nécessaire pour préparer la bibliothèque.
  2. Pour la préparation de la bibliothèque d' ADN suivants utilisent un système de construction de bibliothèque entièrement automatisé (voir tableau Matériaux) et suivre le protocole standard fourni par le fabricant. fragments d'ADN de taille Sélectionnez 200-400 pb pour la préparation bibliothèque. Le système de préparation de la bibliothèque d'automatisation permet de standardiser la procédure de préparation de la bibliothèque et de minimiser les variations entre les échantillons en raison de la préparation manuelle.
  3. Utiliser l'adaptateur Premierrs et diluer la concentration 100x. De cette somme, utiliser 10 pi pour chaque échantillon.
  4. Suite à l' étape 2.2, prenez la réaction, et de quantifier la banque d'ADN-seq en utilisant un système de quantification fluorométrique (Voir le tableau Matériaux).
    1. Mettre en place PCR procédure d'amplification. Le choix du PCR Master Mix est d'améliorer l'efficacité de la PCR de GC enrichie région du génome. Dans un tube PCR, ajouter la bibliothèque 15 pi d' ADN-seq, 25 pl PCR master mix (Voir le tableau Matériaux), 2 uL PCR mélange d' amorces (Voir tableau des matériaux), et 8 pi H 2 O.
  5. Suivre la recommandation de la PCR du producteur du mélange maître de PCR, ce qui modifie les temps de cyclage et les températures pour les différentes matières de départ: 98 ° C pendant 45 s, X cycles de 98 ° C pendant 15 s, 65 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s, puis 72 ° C pendant 1 min. Tenir à 4 o C.
    1. Perform suffisamment de cycles pour aboutir à 2-10 nM d'ADN de la banque (8 - 10 cycles).
  6. Nettoyer la réaction de PCR avec 1: 1 de billes de PCR purification selon le protocole du fabricant (voir le tableau Materials).
  7. Eluer avec 20 - tampon d'élution 30 uL.
  8. Code-barres de chaque échantillon et piscine pour 4 échantillons en une seule voie d'une cellule d'écoulement. Utilisez le 50 pb seul protocole de lecture standard pour le séquençage (voir le tableau Matériaux).

3. Bioinformatique Analyse

Remarque: En outre traiter les fichiers fastq brutes obtenues à partir du séquençage pour effectuer un contrôle de qualité et de cartographier les courtes séquences d'ADN (lit) dans le génome.

  1. Utilisez Bowtie court lecture aligneur, génome outil de cartographie sur chaque exemple de fichier fastq à cartographier le lit du génome de référence. De nombreux outils de cartographie de lecture sont disponibles pour effectuer cette étape et peuvent être utilisés en fonction des préférences individuelles.
    1. Prévoyez un maximum de 2 inadéquations dans le groe lit tout en traçant le génome de référence. Signaler jusqu'à 20 meilleurs alignements pour chaque lecture. Par exemple, utiliser bowtie -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 .
  2. Utilisez LONUT 9 pour récupérer la multiplication mappé lit pour améliorer la détection des régions enrichies. Pour chaque lecture, à un alignement le plus serait récupéré quand il est assez proche de l'un des ci-dessus appelés pics. Par exemple, utiliser: perl lonut.pl -g -w hg19 250 -p 99 . LONUT effectuera les étapes suivantes.
    1. alignements divisé en mappés unique lit et se multiplient mappés lectures. Pic d' appel sur le tracé unique lit en utilisant appelant pic CEINTURE 11. L'option -w 250 et -p 99 dans la commande par exemple sont pour CEINTURE.
    2. Combinez mappé unique lit avec le récupéré obtenu à partir de lectures LONUT et le combiné lit, au format LIT, sera utilisé dans une analyse plus approfondie. Calculer le nombre de combined lit pour la normalisation future.
  3. Bin le lit. Extrait lit dans la région d'intérêt en utilisant un script perl: perl methyPipeline.pl -up -dn . Pour chaque fichier de lit indiqué dans le sampleInfoFile, le script perl exécute les tâches ci-dessous.
    Note: Voir le fichier de codage supplémentaire pour le script perl.
    1. Bin le lit en taille fixe bin, par exemple, 100 pb, pour 24 chromosomes.
    2. Pour chaque gène spécifié dans refGeneFile, extraire les bacs autour de site de début de transcription (TSS), jusqu'à la longueur étendant spécifiée par l'option -up et -dn. Par exemple, extraire les données de la région qui est en aval de 4 kb de TSS. A bin taille 100 pb, cette extraction des données ont 81 bacs, et le bac central correspond à la TSS.
    3. Pour le gène sur le brin antisens, retourner la région extraite de gauche à droite de sorte que les bacs en amont sont toujours placed sur la gauche avec le script perl.
    4. En outre diviser la région ± 4 kb TSS en trois sous-régions: gauche, en amont 4 kb en amont 2 kb; Moyen, et aval 2 kb; A droite, en aval 2 kb à 4 kb.
    5. Pour chaque échantillon, diviser le nombre de lectures dans chaque bac par le nombre total de lectures combinées mappé calculée en 3.3.3. La normalisation permettra d'éliminer l'échantillon spécifique lu différences et permet de comparer les lectures dans les différents échantillons.
  4. Exécutez le script bash (comme indiqué dans le fichier de script) pour effectuer un test statistique sur la lectures normalisées obtenue à partir de la région à gauche, pour détecter la méthylation différentielle entre le groupe normal et le cas dans les régions décrites comme dans la région du flanc.
    Note: Voir le fichier de codage supplémentaire pour le script bash. Sur la base des régions qui sont différentiellement méthylés, il y a sept combinaisons:
    Toute la région: la méthylation différentielle dans toute la région ± 4 kb TSS
    Middlméthylation différentielle dans les deux région centrale et à gauche: eLeft
    méthylation différentielle dans les deux régions, milieu et à droite: MiddleRight
    méthylation différentielle dans les deux régions, à gauche et à droite: Flanc
    A gauche: la méthylation différentielle dans la région laissé que
    méthylation différentielle dans la région à droite seulement: Droite
    méthylation différentielle dans la région moyenne seulement: Moyen
  5. Utilisez le même script bash pour visualiser la méthylation différentielle dans une parcelle de tornade. Tracer les hyper et hypo gènes méthylés sur un panneau séparé, et trier dans l'ordre de la combinaison de la région telle que décrite au point 3.4, respectivement.

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Résultats

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Nous avons utilisé MBDCap-seq pour étudier les altérations de méthylation d' ADN dans un grand nombre de patients atteints de cancer à partir de types divers , y compris 12 sein, de l' endomètre 13, 14 de la prostate et des cancers du foie , entre autres. Ici , nous démontrons quelques informations de l'étude sur le cancer du sein publiée récemment 12. Dans ce cas, nous avons utilisé toute l'approche de séquençage du génome pour identifier les îlots CpG qui sont différentiellement méthylés dans la...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technique MBDCap-seq est une approche d'enrichissement d'affinité 3, considéré comme une alternative rentable lors d' enquêtes sur des cohortes avec un grand nombre de patients 15. Le pipeline présenté ici décrit une approche globale de l'échantillon achats à l'analyse et l'interprétation des données. L'une des étapes les plus importantes est la mise en place d'une procédure d'amplification par PCR pour améliorer l'efficacité de la PCR des régions du GC enrichi dans le génome ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole a été développé dans les laboratoires du Dr Tim Huang et le Dr Victor Jin à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travail est soutenu par CPRIT Research Training Award RP140105, ainsi que partiellement pris en charge par les Instituts américains nationaux de la santé (NIH) des subventions R01 GM114142 et par la Fondation William et Ella Owens Medical Research.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’enrichissement de l’ADN MethylminerInvitrogenME10025
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen112-05D
Bioruptor Plus Sonication DeviceDiagenodeB01020001
3 M acétate de sodium, pH 5,2SigmaS7899100 mL
bibliothèque de fragments SPRIworks IBeckman CoulterA50100Système de construction de bibliothèque entièrement automatisé
Adaptateur Amorces BiooScientific514104PCR primer mix
QubitInvitrogenQ32854Système de quantification fluorométrique
PCR master mixKAPA scientificKK2621PCR master mix
AMPure XPBeckman CoulterA63881PCR Perles de purification
EB BufferQiagen19086
HiSeq 2000 Système de séquençageIllumina
Système de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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