Article de méthode

Méthyl-liaison par capture d'ADN de séquençage pour les tissus du patient

DOI :

10.3791/54131

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31 octobre 2016

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1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.

Résumé

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La méthylation est l'une des modifications épigénétiques essentielles à l'ADN, qui est responsable de la régulation précise des gènes nécessaires à un développement stable et la différenciation des différents types de tissus. Dysrégulation de ce procédé est souvent la caractéristique de diverses maladies telles que le cancer. Ici, nous présentons l'une des techniques de séquençage récents, Methyl-Binding séquençage d'ADN de capture (MBDCap-seq), utilisé pour quantifier la méthylation dans divers tissus normaux et pathologiques pour les grandes cohortes de patients. Nous décrivons un protocole détaillé de cette approche d'enrichissement d'affinité avec un pipeline de bioinformatique pour obtenir une quantification optimale. Cette technique a été utilisée pour séquencer des centaines de patients à travers divers types de cancer comme une partie du projet de méthylome 1000 (Système méthylome Cancer).

Introduction

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La régulation épigénétique de gènes par méthylation de l' ADN est l' un des mécanismes essentiels nécessaires pour déterminer le sort de la cellule par la différenciation stable de différents types de tissus dans le corps 1. Dysrégulation de ce processus a été connu pour causer diverses maladies , dont le cancer 2.

Ce procédé implique essentiellement l'addition de groupes méthyle sur le résidu cytosine dans les dinucléotides CpG d'ADN 3. Il y a quelques différentes techniques actuellement utilisées pour étudier ce mécanisme, chacun ayant ses propres avantages , comme indiqué dans de nombreuses études 2-8. Ici, nous allon....

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Protocole

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Tous les tissus sont obtenus suite à l'approbation du comité Institutional Review Board et quand tous les participants ont consenti à la fois des analyses moléculaires et des études de suivi. Les protocoles sont approuvés par le Comité des études humaines à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio.

1. Méthyl-liaison à l'ADN de capture (MBDCap)

  1. Collecte des échantillons et l' isolement de l' ADN
    1. Collecter des tumeurs en vrac ou des échantillons de tissus normaux provenant d'échantillons de tissus de patients inclus en paraffine.
    2. Utiliser un....

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Résultats

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Nous avons utilisé MBDCap-seq pour étudier les altérations de méthylation d' ADN dans un grand nombre de patients atteints de cancer à partir de types divers , y compris 12 sein, de l' endomètre 13, 14 de la prostate et des cancers du foie , entre autres. Ici , nous démontrons quelques informations de l'étude sur le cancer du sein publiée récemment 12. Dans ce cas, nous avons utilisé toute l'approche de séquençage du génome pour identifier les îlots CpG qui sont différentiellement .......

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Discussion

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La technique MBDCap-seq est une approche d'enrichissement d'affinité 3, considéré comme une alternative rentable lors d' enquêtes sur des cohortes avec un grand nombre de patients 15. Le pipeline présenté ici décrit une approche globale de l'échantillon achats à l'analyse et l'interprétation des données. L'une des étapes les plus importantes est la mise en place d'une procédure d'amplification par PCR pour améliorer l'efficacité de la PCR des régions du GC enrichi dans le génome .......

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Déclarations de divulgation

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Ce protocole a été développé dans les laboratoires du Dr Tim Huang et le Dr Victor Jin à l'Université du Texas Health Science Center à San Antonio.

Remerciements

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Le travail est soutenu par CPRIT Research Training Award RP140105, ainsi que partiellement pris en charge par les Instituts américains nationaux de la santé (NIH) des subventions R01 GM114142 et par la Fondation William et Ella Owens Medical Research.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d’enrichissement de l’ADN MethylminerInvitrogenME10025
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen112-05D
Bioruptor Plus Sonication DeviceDiagenodeB01020001
3 M acétate de sodium, pH 5,2SigmaS7899100 mL
bibliothèque de fragments SPRIworks IBeckman CoulterA50100Système de construction de bibliothèque entièrement automatisé
Adaptateur Amorces BiooScientific514104PCR primer mix
QubitInvitrogenQ32854Système de quantification fluorométrique
PCR master mixKAPA scientificKK2621PCR master mix
AMPure XPBeckman CoulterA63881PCR Perles de purification
EB BufferQiagen19086
HiSeq 2000 Système de séquençageIllumina
Système de

Références

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  1. Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
  2. Nair, S. S., et al.

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Mots-clés

Analyse de la m thylation de l ADNchantillons de tissus de patientsIsolement de l ADN g nomiqueProtocole de sonicationPr paration du tampon d lutionPipeline bioinformatiqueM thylation des lots CpGCancer Methylome ProjectD couverte de biomarqueurs pig n tiques

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