Mucine Agarose Gel Electrophoresis: Western Blot pour les glycoprotéines de haut poids moléculaire,

Kathryn A. Ramsey; Zachary L. Rushton; Camille Ehre

doi:10.3791/54153

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Article de méthode

Mucine Agarose Gel Electrophoresis: Western Blot pour les glycoprotéines de haut poids moléculaire,

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DOI :

10.3791/54153

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14 juin 2016

Kathryn A. Ramsey¹^,² , Zachary L. Rushton¹ , Camille Ehre¹^,³

¹Marsico Lung Institute/CF Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Telethon Kids Institute, University of Western Australia, ³Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Les mucines sont des glycoconjugués de haut poids moléculaire, d’une taille allant de 0,2 à 200 mégadaltons (MDa). En raison de leur taille, les mucines ne pénètrent pas dans les gels de polyacrylamide conventionnels et nécessitent des pores plus grands pour la séparation. Nous fournissons un protocole détaillé pour l’électrophorèse sur gel d’agarose mucine afin d’évaluer la quantification relative et d’étudier l’assemblage des polymères.

Résumé

Mucines, les protéines fortement glycosylées qui tapissent la surface des muqueuses, ont évolué comme un élément clé de la défense innée en protégeant l'épithélium contre les agents pathogènes envahisseurs. Le rôle principal de ces macromolécules est de faciliter le piégeage des particules et de dégagement, tout en favorisant la lubrification de la muqueuse. Au cours de la synthèse des protéines subissent une intense mucines O-glycosylation et multimérisation, ce qui augmente considérablement la masse et la taille de ces molécules. Ces modifications post-traductionnelles sont critiques pour les propriétés viscoélastiques du mucus. En raison de la nature biochimique et biophysique complexe de ces molécules, en travaillant avec des mucines fournit de nombreux problèmes qui ne peuvent pas être résolus par des méthodes d'analyse des protéines classiques. Par exemple, leur haut poids moléculaire empêche la migration électrophorétique par des gels de Polyacrylamide réguliers et leur nature collante provoque l'adhérence à un tube expérimental. Cependant, étudier le rôle des mucines dans la santé(Par exemple., Le maintien de l' intégrité des muqueuses) et de la maladie (par exemple., Hyperconcentration, mucostase, cancer) a récemment suscité un intérêt et mucines sont à l'étude comme cible thérapeutique. Une meilleure compréhension de la production et la fonction des macromolécules mucine peut conduire à de nouvelles approches pharmaceutiques, par exemple, les inhibiteurs de la mucine exocytose de granules et / ou agents mucolytiques. Par conséquent, des protocoles cohérents et fiables pour étudier la biologie mucine sont essentiels pour le progrès scientifique. Ici, nous décrivons des méthodes classiques pour séparer les macromolécules de mucine par électrophorèse en utilisant un gel d'agarose, transfert des protéines dans une membrane de nitrocellulose, et à détecter le signal avec des anticorps spécifiques de la mucine, ainsi que l'infrarouge lecteur de gel de fluorescence. Ces techniques sont largement applicables pour déterminer la mucine quantification, multimérisation et de tester les effets des composés pharmacologiques sur mucines.

Introduction

Les mucines sont normalement produites par des surfaces muqueuses qui tapissent les cavités exposées à l'environnement extérieur (par exemple., Respiratoires, digestifs, les secteurs de la reproduction, la surface oculaire), ainsi que les organes internes (par exemple, le pancréas, la vésicule biliaire, les glandes mammaires). La présence de ces glycoprotéines maintient l'hydratation de la surface et forme une barrière physique contre les agents pathogènes. Bien que la production de mucine est essentielle à la santé des muqueuses, mucine hyperconcentration et / ou des propriétés de mucus aberrantes peut conduire à obstruction du canal, la co....