Article de méthode

Implantation et enregistrement de Wireless Électrorétinogramme et potentiel évoqué visuel chez des rats conscients

DOI :

10.3791/54160

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29 juin 2016

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1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne, 2Pfizer Neusentis

Dans cet article

Résumé

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Nous montrons les procédures d'implantation et d'enregistrement chirurgicales pour mesurer des signaux électrophysiologiques visuels de l'oeil (électrorétinogramme) et le cerveau (visuel potentiel évoqué) chez des rats conscients, ce qui est plus analogue à la condition humaine où les enregistrements sont effectués sans anesthésie confond.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'électrorétinogramme-plein champ (ERG) et potentiel évoqué visuel (VEP) sont des outils utiles pour évaluer la rétine et de l'intégrité de la voie visuelle dans les deux paramètres cliniques et de laboratoire. Actuellement, les mesures ERG et VEP précliniques sont effectués avec l'anesthésie pour assurer des placements d'électrodes stables. Cependant, la présence de l'anesthésie a été montré pour contaminer les réponses physiologiques normales. Pour surmonter ces facteurs confusionnels d'anesthésie, nous développons une nouvelle plate-forme pour tester ERG et VEP chez des rats conscients. Les électrodes sont implantés chirurgicalement sous-conjonctivale sur l'oeil pour analyser l'ERG et épidurale sur le cortex visuel pour mesurer la VEP. Une gamme d'amplitude et de sensibilité / paramètres de synchronisation sont analysés à la fois l'ERG et VEP à accroître les énergies lumineuses. Les signaux ERG et VEP sont présentés pour être stable et reproductible pendant au moins 4 semaines après l'implantation chirurgicale. Cette capacité à enregistrer des signaux ERG et VEP sans anesthésie déconcerte dans les s précliniquesise devrait fournir une traduction de qualité supérieure à des données cliniques.

Introduction

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L'ERG et VEP sont peu invasive dans des outils in vivo pour évaluer l'intégrité des voies rétiniennes et visuelles respectivement en laboratoire et en clinique. Le plein champ ERG donne une forme d' onde caractéristique qui peut être décomposé en différentes composantes, chaque élément représentant différentes classes de cellules de la voie 1,2 rétinienne. Le classique-plein champ ERG forme d' onde est constitué d'une pente initiale négative (a-ondes), qui a été montré pour représenter photorécepteur activité post exposition à la lumière 2-4. L'une onde est suivie par une forme d' onde positif substantiel (b-ondes) qui reflète l' activité électrique de la rétine centrale, principalement les cellules ON-bipolaires 5-7. En outre, on peut faire varier l' énergie lumineuse et inter-impulsion-intervalle pour isoler cône à partir des réponses de la tige 8.

Le flash VEP représente des potentiels électriques de la tige du cortex et du cerveau visuel en réponse à une stimulation lumineuse de la rétine9,10. Cette forme d' onde peut être décomposé en composants précoces et tardifs, avec le composant début reflétant l' activité des neurones de la voie rétino-geniculo-striée 11-13 et la fin du composant représentant le traitement cortical effectué dans diverses strates V1 chez le rat 11,13. Par conséquent la mesure simultanée de l'ERG et VEP renvoie l'évaluation complète des structures impliquées dans la voie visuelle.

À l'heure actuelle, afin d'enregistrer l'électrophysiologie chez l'animal, l'anesthésie est utilisé pour permettre le placement stable d'électrodes. Il y a eu des tentatives pour mesurer ERG et VEP chez des rats conscients 14-16 , mais ces études employé une installation filaire, ce qui peut être lourd et peut conduire à un stress des animaux en restreignant le mouvement des animaux et le comportement naturel 17. Avec les récents progrès dans la technologie sans fil, y compris l'amélioration de la miniaturisation et de la vie de la batterie, il est maintenant possible de mettre en œuvre une approche de télémétrie pour ERG und 'enregistrement de VEP, ce qui diminue le stress associé à des enregistrements filaires et l'amélioration de la viabilité à long terme. Entièrement intériorisées stables implantations de sondes télémétriques ont prouvé leur efficacité pour la surveillance chronique de la température, de la pression artérielle 18, l' activité 19 ainsi que l' électroencéphalographie 20. Ces avancées technologiques contribueront également à la répétabilité et la stabilité des enregistrements conscients, ce qui augmente l'utilité de la plate-forme pour les études chroniques.

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Protocole

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Éthique déclaration: Les expérimentations animales ont été menées en conformité avec le Code australien pour le soin et l' utilisation des animaux à des fins scientifiques (2013). approbation éthique des animaux a été obtenue auprès du Comité d'éthique animale, Université de Melbourne. Les matériaux sont ici pour des expériences de laboratoire, et non destinés à un usage médical ou vétérinaire.

1. Electrodes Préparation

Remarque: un émetteur à trois canaux est utilisé pour l'implantation chirurgicale qui permet à deux ERG et l'enregistrement d'une VEP être réalisée simultanément. Les trois actifs et trois électrodes inactives doivent être pré-façonné en forme d'anneau avant l'implantation afin d'attacher à l'œil. Pour des fins d'identification, le fabricant a fermé électrodes actives dans la moitié blanche, gaines en plastique demi de couleur tandis que les électrodes inactives sont couverts dans des gaines colorées pleines. L'électrode de masse (gaine en plastique transparent) est laissée inchangée. Pour tous électr actifs et inactifsconduite odes étapes 1.1, 1.2, 1.3 et 1.7.

  1. Défaites la double électrode en acier inoxydable brin avec deux pinces à pointe fines.
  2. Coupez l'un des brins d'acier inoxydable (environ 1 cm de la pointe), laissant un seul brin plus droite reste à façonner l'électrode annulaire.
  3. Pliez le seul brin d'acier inoxydable sur lui-même et la torsion, formant un anneau lisse à la pointe de l'électrode.
  4. Pour l'ERG électrodes actives mode cette boucle ~ 0,2 - 0,5 mm de diamètre par torsion de la base de la boucle (aux fins décrites ici, la forme de deux électrodes actives dans cette façon d'enregistrer ERG des deux yeux), et pour l'ERG inactif et électrodes VEP font le diamètre de la boucle ~ 0,8 mm de diamètre (dans cet exemple, le faire pour une électrode de VEP active et les trois électrodes inactives).
  5. Accrocher la VEP électrode circulaire actif autour d'une vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm) pour l'électrode repose contre la tête de vis.
  6. Hook les 3 électrodes inactives (2 ERG, 1 VEP) autour d'une seconde vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm).
  7. Tirez le manchon en plastique vers l'avant sur les extrémités pointues du brin deux en acier inoxydable pour réduire l'irritation.
  8. Stériliser les émetteurs de télémesure par trempage dans glutaraldéhyde à 2% pendant plus de 10 heures à environ 25 ° C. Ensuite, rincez l'émetteur avec une solution saline stérile 3 fois.

2. Transmetteur Implantation

  1. Préparation des animaux
    1. Désinfecter la zone chirurgicale avant l'expérimentation par nettoyage à l'éthanol 70%. Autoclave tout le matériel chirurgical avant l'utilisation et l'entretien du matériel de chlorhexidine lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation lors de la chirurgie. Couvrir l'animal avec un drap chirurgical pendant une intervention chirurgicale afin de maintenir un environnement stérile. Vérifiez que tous les expérimentateurs portent des masques chirurgicaux, des gants et des blouses stériles.
    2. Induire une anesthésie avec 1,5 à 2% d'isoflurane, à un taux de 3 L / min et débit entretenir cetnis à 1,5 à 2% à 2 L / min tout au long de la chirurgie. Confirmer une profondeur suffisante de l'anesthésie par l'absence d'un réflexe de la pédale lors de pincer le muscle entre les orteils.
    3. Rasez 40 mm Surface x 30 mm sur l'abdomen au-dessus de l'aine au sternum.
    4. Rasez 30 mm Surface x 20 mm sur le front, postérieure aux yeux et antérieure aux oreilles.
    5. Désinfecter les deux zones rasées. Pour la zone de front désinfecter avec 10% de povidone-iode à trois reprises (éviter l'utilisation d'antiseptiques à base d'alcool pour la zone près de l'œil, étant compatible avec la norme de pratique établie par l'Association des technologues chirurgicaux). Sur l'abdomen désinfecter avec 10% de polyvidone iodée et 70% d'éthanol.
    6. Appliquer 1 goutte de proximétacaïne à la cornée pour l'anesthésie topique supplémentaire.
    7. Appliquer 1 goutte de carboxyméthylcellulose sodique à la cornée pour éviter le dessèchement des yeux.
  2. L' implantation chirurgicale
    1. Faire une incision de 10 mmsur la tête le long de la ligne médiane verticale entre les oreilles avec un scalpel chirurgical.
    2. Faire une incision de 5 mm sur l'abdomen à travers la couche de peau le long de la ligne médiane au-dessous du sternum.
    3. Tunnel à 5 ​​mm de diamètre canule sous-cutanée de l'incision abdominale à l'incision de la tête.
    4. Passer les fils d'électrodes (3 actifs et inactifs) 3 de l'émetteur à travers la canule de l'abdomen à la tête.
    5. Laisser l'électrode de référence à la base de l'émetteur et couvrir la pointe de l'électrode avec de la gaze aseptique.
    6. Couvrir les pointes d'électrodes (3 actifs et inactifs) 3 avec de la gaze aseptique.
    7. Fixer la tête du rat à une plate-forme stéréotaxique.
    8. Prolongez l'incision de front à 30mm de longueur avec des ciseaux chirurgicaux.
    9. Exposer zone chirurgicale en rétractant la peau lâche avec 2 sutures (3 - 0) à ~ 3 et 9 heures.
    10. Grattez le périoste recouvrant le crâne à l'aide de gaze stérilisée pour exposer Bregma, lambda et midline sutures.
    11. Percez deux trous dans le crâne à la VEP active (7 mm ventral bregma 3 mm en dehors de la ligne médiane) et inactive (5 mm rostrale à bregma sur la ligne médiane) coordonnées stéréotaxiques.
    12. Fixer VEP électrodes actives et inactives avec des vis pré-joint en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm) au crâne avec un petit tournevis à ~ 1 mm de profondeur dans les trous préformés. Cette ancre la vis à l'os sans endommager le tissu cortical sous-jacent.
    13. Pour implanter les électrodes actives ERG utilisent un 8-0 suture de se rétracter temporairement la paupière supérieure.
    14. Insérez un 16 à 21 G canule sous-cutanée derrière l'oeil à travers le fornix conjonctival supérieur.
    15. Retirez l'aiguille de guidage.
    16. Nourrissez l'électrode active à travers le cathéter en plastique raccourci du front vers l'oeil. Ensuite, retirer le cathéter en plastique.
    17. Utiliser un fil de suture temporaire (8-0), qui est enfilée à travers la boucle d'électrode, afin d'empêcher les electrode de se rétracter de nouveau dans le tunnel.
    18. Faire une incision de 0,5 mm sur la conjonctive supérieure à 12 heures, de 1 mm en arrière du limbe. Utilisez dissection pour exposer la sclérotique sous-jacent.
    19. Implanter un 8 - 0 suture immédiatement derrière le limbe à la moitié de l'épaisseur scléral - 0 ou 9.
    20. Retirer suture temporaire ERG électrode active.
    21. Ancrer l'électrode active ERG à la demi-scléral épaisseur suture en liant 3 noeuds consécutifs assurant la pointe de l'électrode est situé à proximité du limbe.
    22. Fermez le volet conjonctival en utilisant 1 à 2 sutures interrompues (8 - 0 à 9 - 0). Assurez-vous que la conjonctive recouvre complètement l'électrode ERG pour améliorer le confort.
    23. Retirer la paupière rétracter suture.
    24. Répétez la procédure pour l'oeil controlatéral.
    25. Appliquer le gel de cyanoacrylate sur le crâne pour sécuriser toutes les vis en acier inoxydable et les fils d'électrodes. Assurer les électrodes actives ERG ne sont pas tirés trop serré avant de fixer à enmouvements oculaires capables.
    26. Fermez la blessure à la tête au moyen d'un non-absorbable 3-0 suture.
    27. Tournez rongeur pour exposer la zone abdominale. Allonger dermique incision abdominale à 40 mm le long de la ligne blanche avec des ciseaux chirurgicaux.
    28. Faire une incision de 35 mm à travers la paroi du muscle interne pour exposer la cavité abdominale intérieure.
    29. L'utilisation de deux sutures (3 - 0) fixer le corps de l'émetteur à droite paroi abdominale interne de l'animal. Éviter tout contact avec le foie.
    30. Boucle l'électrode de masse et de sécurité dans cette forme avec une suture (3 - 0). Placez-le flottant librement dans la cavité abdominale.
    31. Fermez le péritoine en utilisant une suture continue (3 - 0).
    32. Fermer l'incision de la peau en utilisant des sutures interrompues (3 - 0).
  3. Les soins post-opératoires
    1. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Maison de l'animal seul après la chirurgie.
    2. Administrer carprOfen sous-cutanée pour l'analgésie (5 mg / kg) une fois par jour pendant 4 jours.
    3. Ajouter des antibiotiques oraux prophylactiques (Enrofloxin, 5 mg / kg) à l'eau potable pendant 7 jours après la chirurgie.
    4. Appliquer une pommade anti-inflammatoire à des sites d'incision de la peau pour réduire l'irritation pour les 7 premiers jours après la chirurgie.

3. Conduite ERG et VEP Recordings chez des rats conscients

  1. adapter foncé animaux pendant 12 heures avant l'ERG et VEP enregistrements
  2. Effectuer toutes les manipulations expérimentales sous éclairage faible rouge (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm)
  3. Appliquer une anesthésie topique (0,5% de proximétacaïne) et dilatant (0,5% tropicamide) tombe à la cornée.
  4. Guide du rongeur conscient en fait sur mesure, restrainer claire.
    Remarque: La longueur de ce tube en matière plastique peut être ajustée pour s'adapter à des rats de tailles différentes avec le diamètre global fixé à 60 mm. L'extrémité avant de l'appareil est effilée pour réduire au minimum la tête moDépla et contient des perforations pour permettre une respiration normale. Ce front conique permet un alignement et la stabilisation de la tête et les yeux du rat à l'ouverture de la sphère de Ganzfeld. A noter que le rongeur a été acclimatés au dispositif de retenue (3 à 5 fois) avant l'intervention chirurgicale.
  5. Placer le rongeur en face de la cuvette Ganzfeld avec les yeux alignés avec l'ouverture de la cuvette.
  6. Allumez l'émetteur inhabitation en passant un aimant au sein de ~ 5 cm de l'émetteur. Vérifiez que l'émetteur est en vérifiant le voyant d'état LED sur la base du récepteur.
  7. Recueillir des signaux sur une gamme d'énergies lumineuses (ie, -5,6 à 1,52 log cd.sm -2) comme décrit précédemment 21. En bref, plusieurs signaux moyenne aux niveaux de gradateur de lumière (~ 80 répétitions) et moins aux énergies plus lumineux lumineuses (~ 1 répétition). Peu à peu, d'allonger l'intervalle de 1 à 180 secondes interstimulus de dimmest au niveau de lumière la plus brillante.
  8. Pour isoler la tige ERGet les réponses du cône utilisent un paradigme double flash 8. Par exemple, lancer deux flashs à 1,52 log cd.sm -2 avec un intervalle msec 500 inter-stimulus entre les deux.
  9. Pour enregistrer des signaux VEP, moyenne 20 répétitions aux énergies plus lumineux lumineux (ie, 1,52 log cd.sm -2, 5 sec d' intervalle inter-stimulus).
  10. Pour évaluer la stabilité des implants, qui est évaluée par le signal de la variabilité dans le temps, conduire ERG et VEP enregistrements 7, 10, 14, 21 et 28 jours après la chirurgie.
  11. Après la période expérimentale, les rats euthanasie par injection intracardiaque de pentobarbiturate (1,5 ml / kg) après la kétamine: anesthésie xylazine (12: 1 mg / kg).

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Résultats

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La réponse du photorécepteur est analysée en ajustant une gaussienne retardée du bord d' attaque de la branche descendante initiale de la réponse ERG aux 2 derniers énergies lumineuses (1,20, 1,52 log csm -2) pour chaque animal, basé sur le modèle de Lamb et Pugh 22, formulé par Hood et Birch 23. Cette formule renvoie une amplitude et d' un paramètre de sensibilité (figure 1C et 1D, respectivement). Une fonction hyperboli...

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Discussion

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En raison de la nature très peu invasive de l'électrophysiologie visuelle, et VEP enregistrements d'ERG chez des patients humains sont effectuées dans des conditions conscientes et ne nécessitent l'utilisation d'anesthésiques topiques pour le positionnement des électrodes. En revanche, électrophysiologie visuelle dans des modèles animaux est classiquement réalisée sous anesthésie générale pour permettre le placement des électrodes stables en éliminant les mouvements oculaires volontaires et le corps. Cep...

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Déclarations de divulgation

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RG et RF sont des employés du bailleur de fonds commercial de cette recherche (Pfizer Neusentis et Pfizer Global Research). MI était un employé de Pfizer Global Research pendant cette recherche et est actuellement un employé de Proteostasis Therapeutics (Cambridge, États-Unis).

Remerciements

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JC tient à remercier le David Hay Memorial Fund, l’Université de Melbourne, pour son soutien financier dans la rédaction de ce manuscrit. Le financement de ce projet a été fourni par une subvention de liaison de l’ARC 100200129 (BVB, AJV, CTON).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BioamplificateurADInstrumentsML 135Amplifie les signaux ERG et VEP
Carboxyméthylcellulose sodique 1,0 %AllerganCAS 0009000-11-7Maintien de l’hydratation de la cornée pendant l’opération
Carprofène 0,5 %Pfizer Animal Health GroupCAS 53716-49-7Analgésie post-opératoire, administrée avec une solution saline injectable pour le réapprovisionnement en liquide
Chlorhexadine 0,5 %Orion Laboratories27411, 80085Désinfection de l’instrument chirurgical
Activateur de gel de cyanoacrylateRS components473-439Sèche rapidement le gel de cyanoacrylate
Gel de cyanocrylate  ;Composants RS473-423Fixer les vis en acier inoxydable au crâne
Fraise dentaireStorz Instruments, Bausch et LombE0824ATête de forage miniature de ~ 0,7 mm de diamètre pour faire un petit trou dans le crâne sur chaque hémisphère pour implanter des vis VEP
PerceuseBoschDremel série 300Perceuse automatique pour la trépanation
EnrofloxinTroy LaboratoriesPoste antibiotique prophylactique sphère d’intégration Surgey
GanzfeldPhotometric Solutions InternationalStimulateur de lumière conçu sur mesure : 36 mm de diamètre, 13 cm d’ouverture
Écouvillons de gazeMultigate Medical Products Pty Ltd57-100BSéche l’incision chirurgicale et la surface du crâne exposée pendant la chirurgie
Isoflurane 99,9 %Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7Nom exclusif : Isoflo(TM) Anathésique par inhalation. Anesthésique par inhalation de qualité pharmaceutique mélangé à de l’oxygène gazeux pour la chirurgie d’implant d’électrodes VEP
Pommade KenacombAspen Pharma Pty LtdPour réduire l’irritation de la peau et les démangeaisons après la chirurgie
Luxeon LEDsPhillips Lighting Co.Pour la stimulation lumineuse, vingt LED de 5 W et une LED de 1 W, contrôlées par le logiciel Scope
Aiguille (macrochirurgie)World Precision Instruments501959pour la suture de l’abdomen et de la tête, utilisé avec une suture 3 - 0, une aiguille à œil, un bord de coupe 5/16 cercle Taille 1, 15 mm
Porte-aiguille (macrochirurgie)World Precision Instruments500224Pour tenir l’aiguille pendant la chirurgie
abdominale et de la têtePorte-aiguille (microchirurgie)World Precision Instruments555419NTPour tenir l’aiguille pendant la chirurgie oculaire
Cathéter OptivaSmiths Medical International LTD16 ou 21 GGuide les électrodes cornéennes actives du crâne à la conjonctive
Povidone iodée 10 %Sanofi-AventisCAS 25655-41-8Nom propriétaire : Bétadine, Antiseptique pour préparer la peau rasée à la chirurgie 10 %, 500 ml
Système d’acquisition de données PowerlabADInstrumentsML 785Acquisition du signal à partir d’un émetteur de télémétrie, apparié à un convertisseur de données de télémétrie
Proxymetacaine 0,5Alcon Laboratories  ;CAS 5875-06-9Analgésie oculaire topique
Cutom de contentionfabriquéL’avant du dispositif de contention est effilé pour minimiser les mouvements de la tête, la longueur peut être ajustée pour s’adapter à différentes longueurs de rat, le diamètre total est de 60 mm.
Lame ScapelR.G. Medical SuppliesSNSM0206Pour l’incision chirurgicale
Ciseaux (macrochirurgie)World Precision Instruments501225pour couper les tissus sur le corps et le front
Ciseaux (microchirurgie)World Precision Instruments501232Pour disséquer la conjonctive pour la fixation d’électrodes
Logiciel de lunetteADInstrumentsversion 3.7.6Déclenche simultanément le stimulus via le système ADI Powerlab et collecte des données
ShaverOsterGolden A5Shave fur des zones chirurgicales
Vis en acier inoxydable  ;MicroFastenersL001.003CS304Diamètre de l’arbre de 0,7 mm, longueur de 3 mm  ;
Cadre stéréotaxiqueDavid KopfModèle 900Un instrument stéréotaxique pour petits animaux pour localiser les repères d’implantation sur le crâne
Champ chirurgicalVital Medical SuppliesGM29-612EEAssurer un environnement stérile pendant la chirurgie
Suture (macrochirurgie)Aiguilles médicales Ninbo3-0pour la suture de l’abdomen et de la tête, soie stérile tressée, 60 cm
Aiguille de suture ( microchirurgie)Aiguilles médicales Ninbo8-0 ou 9-0pour la chirurgie oculaire comprenant, électrode de suture à la sclérotique et à la fermeture de la plaie conjonctivale, suture en nylon, cercle 3/8 1 & fois 5, convertisseur
données de télémétrie 30 cm  ;DataSciences InternationalR08permet au signal de télémétrie de s’interfacer avec un logiciel de collecte de données
Matrice d’échange de données de télémétrieDataSciences InternationalCollecte les données des émetteurs, appariement avec le récepteur
Récepteur de données de télémétrieDataSciencesInternational RPC-1Reçoit les données de télémétrie de l’émetteur
Émetteur de télémétrieDataSciences Émetteur deF50-EEE3 canaux
Tropicamide 0,5 %Laboratoires AlconPince
épiler (macrochirurgie)World Precision Instruments500092Manipuler les tissus lors d’une chirurgie abdominale et cérébrale
Pince à épiler (microchirurgie)World Precision Instruments500342Manipuler des tissus lors d’une chirurgie oculaire
 % de télémétrie international à

Références

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