Amélioration Technique Swiss-laminage pour la préparation Intestinal des tissus pour immunohistochimique et immunofluorescence Analyses

Résumé

l'identification et la localisation des cellules épithéliales le long de la paroi de la muqueuse intestinale précis sont essentiels pour définir différentes lignées cellulaires. l'imagerie correcte des tissus intestinaux est cruciale pour l'identification des motifs d'expression de protéine avec une résolution maximale. Cette étude vise à définir les méthodes et les conditions optimales pour les tissus intestinaux de traitement de la souris.

Résumé

Il est important de comprendre le rôle des facteurs qui régulent l’homéostasie épithéliale intestinale et la réponse aux lésions et à la régénération. La littérature actuelle décrit plusieurs approches méthodologiques différentes pour obtenir des images de tissus intestinaux pour la validation des données. Dans cet article, nous décrivons un protocole commun relatif à la dérivation et au traitement des tissus intestinaux de souris. La bonne fixation des tissus intestinaux et les techniques de Swiss-roll qui améliorent la morphologie épithéliale intestinale sont abordées. Le traitement post-résection et la réorientation des tissus intestinaux intégrés sont essentiels pour obtenir des blocs inclus dans la paraffine qui présentent des caractéristiques structurelles intestinales intactes après la section. La technique du Swiss-rolling aide à l’évaluation histologique des coupes intestinales ou coliques complètes examinées. La capacité de différencier les caractéristiques structurelles intestinales peut être essentielle dans les mesures quantitatives de l’inflammation intestinale et de la tumorigenèse sur toute la longueur. Enfin, les coupes enrobées de paraffine sont idéales pour un traitement robuste utilisant des méthodes de détection immunohistochimiques et immunofluorescentes. Les coupes immunohistochimiques non fluorescentes fournissent une image vibrante du tissu détaillant différentes caractéristiques structurelles cellulaires, mais n’offrent pas de flexibilité pour les expériences de colocalisation intracellulaire. Plusieurs canaux fluorescents peuvent être utilisés de manière appropriée avec la détection immunofluorescente pour des expériences de co-localisation, ce qui soutient les études mécanistes.

Introduction

L'épithélium intestinal de mammifère comprend une seule couche de cellules prismatiques. Dans l'intestin grêle, les cellules proliférantes sont confinés dans les cryptes tandis que les cellules différenciées occupent la région de villosités. Cependant, parce qu'il n'y a pas de villosités dans le gros intestin, les cellules proliférantes sont localisées au fond des cryptes et des cellules différenciées occupent la partie supérieure des cryptes. L'épithélium intestinal subit une reconstitution rapide (environ 3-5 jours) qui est entraîné en continu par division des cellules prolifératives dans les cryptes. Les cellules prolifératives des cryptes ne sont pas une population homogène et sont subdivisées en cellules souches et (TA) des cellules de transit-amplification ^1. Les cellules souches se trouvent au fond de la crypte, dans les 4 premières - 5 cellules de la très inférieure ^2. Le modèle actuel soutient l'existence de deux types de cellules souches: les cellules souches cryptes colonnaire de base (SRC) et les cellules souches quiescentes de réserve. La SRC scellules TEM sont activement prolifèrent et sont marquées par une protéine G contenant de répétition-leucine-riche récepteur couplé 5 (LGR5) ^3, olfactomédine 4 (Olfm4) ⁴ et Achaete scute-like 2 (Ascl2) ^5. D'autre part, les cellules souches quiescentes de réserve sont marqués par B Moloney murine site spécifique des cellules de virus de la leucémie d'intégration 1 (Bmi1) ^6, la télomérase de la souris transcriptase inverse (mTERT) ^7, HOP Homeobox (HopX) ^8, Doublecortin-Like Et CAM Kinase -Comme 1 (DCLK1) ^9, et riche en leucine répétitions et Immunoglobulin-Like Domains 1 (Lrig1) ^10. Les cellules souches qui prolifèrent activement donnent naissance à des cellules TA puis subissent une différenciation en cellules absorbantes (entérocytes) et les cellules sécrétoires (entéro, caliciformes, cellules Paneth et Tuft). la division cellulaire continue dans la zone de prolifération résulte en mouvement vers le haut des cellules épithéliales le long de l'axe crypte-villosité jusqu'à ce qu'ils atteignent le dessus des villosités, où ils subissent l'apoptose et sontmué hors de la surface de l'épithélium. Les différents types de cellules épithéliales intestinales sont marquées par l'expression de protéines distinctes (par exemple, les cellules caliciformes intestinales peuvent être reconnues par coloration avec un anticorps contre les cellules muc2 et Paneth avec un anticorps dirigé contre le lysozyme). Nous étudions le rôle des facteurs Krüppel-like (KLFs) dans l'homéostasie et physiopathologie de l'épithélium intestinal ^11-13. Les résultats présentés ici supportant la faisabilité d'une technique de laminage suisse modifiés sont basés sur des études antérieures sur le rôle de facteur semblable à Krüppel 5 (KLF5) dans le maintien de la prolifération active des cellules souches épithéliales intestinales ^14. KLF5 est un facteur de transcription à doigt de zinc qui est fortement exprimé dans la tige intestinale active et les cellules ¹² TA. Des études antérieures ont démontré que KLF5 est co-exprimé avec Ki-67, un marqueur proliférative connu dans les cryptes intestinales.

Le tr gastro acte est pas un tissu structurellement ou fonctionnellement homogène. L'intestin grêle est subdivisé en le duodénum, ​​le jéjunum et l'iléon et le gros intestin, du caecum et du côlon dans, ce dernier étant en outre divisée en proximale, intermédiaire et distale. Chacune de ces sections a des caractéristiques histologiques uniques et joue des rôles distincts ^15. Par conséquent, les effets des injurieux et le degré de la réponse de l'épithélium intestinal peuvent dépendre de la région de tissu étudié ^16. En outre, les différentes souches de souris montrent la diversité de la réponse au niveau histologique en fonction du type d'insulte utilisée dans les études ^16. Ainsi, digne préparation des tissus est nécessaire pour permettre histologique appropriée et l'analyse moléculaire des tissus intestinaux. En tant que tel, le Swiss-roll subventions de la technique d'analyse de la longueur totale de l'épithélium intestinal en même temps et donc détermine des conclusions bien informées fondées sur des informations complètes.

e_content "> La technique Swiss-roll a été mentionné par Magnus ^17, et décrit en détail par Moolenbeck et Ruitenberg et Park et al. comme une méthode pour la préparation de tissus et d' effectuer des analyses histologiques de l'intestin des rongeurs ^18,19, respectivement. Le protocole délimitée dans cette publication présente une version améliorée de la méthode originale qui permet pour la préparation des tissus en temps opportun et fiable à des fins de diagnostic. cette technique modifiée permet de collections et de la préparation de l'épithélium intestinal des techniques universellement utilisées, comme l'immunohistochimie, immunofluorescence, ainsi efficaces comme l' hybridation in situ (fluorescente et chromogénique ^20). en outre, le tissu modifié spécimen procédé de préparation utilise des réactifs facilement disponibles et relativement peu coûteux , tout en offrant un mode de fixation rapide des tissus et permet la récupération des protéines, de l' ADN et de l' ARN pour une évaluation supplémentaire. Prise ensemble, this technique est excellente pour l'évaluation complète des caractéristiques histopathologiques, pathologiques et moléculaires de l'épithélium intestinal.

Protocole

1. Souris

1. Toutes les études sur des souris ont été approuvées par l'Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité Stony Brook University (IACUC). Les souris ont été maintenues sur un cycle de lumière-obscurité 12:12 h.
   1. obtenir dans le commerce C57BL / 6. Obtenir des souris C57BL / 6 portant des alleles KLF5 flanquée de sites loxP (KLF5 ^{f l / f l).} Ces souris ont été décrites précédemment ²¹ et gracieusement fournies par le Dr Ryozo Nagai.
2. Achetez C57BL / 6 souris portant le gène de la recombinase Cre inductible sous la régulation du promoteur LGR5 (LGR5-EGFP / CreERT2 souris).
3. Pour établir LGR5-EGFP / CREER ^T2 / KLF5 ^{f l / f l} souris, traverser KLF5 ^{fl / f l} souris avec des souris / CREER ^T2 LGR5-EGFP puis rétrocroisement la progéniture KLF5 ^{fl / f l} les souris.
4. Souris Traiter avec le tamoxifène comme par le protocole décrit précédemment ^22. Injecter 8 semaines d'âge des souris témoins et expérimentaux par voie intraperitoneale (IP) avec 1 mg de tamoxifène (10 mg / ml), dissous dans de l'huile de maïs stérile, pendant 5 jours consécutifs.
5. Au jour 14 après la première injection tamoxifène, sacrifiez des souris en utilisant du CO ₂ asphyxie en les plaçant dans une chambre reliée à la source de CO ₂ gazeux. Laisser le gaz de circuler dans la chambre jusqu'à ce que les souris sont inconscients et tout mouvement cesse. Pour assurer l'euthanasie effectuer la dislocation cervicale.

2. Préparation des tissus et Swiss Rouler

1. En utilisant des pinces à dissection et ciseaux, couper une incision dans la peau de la face abdominale. Avec une paire de pinces, maintenir la peau à l'incision et tirez doucement loin du tissu musculaire abdominale. Utilisez une paire de ciseaux pour couper la peau abdominale et exposer les muscles abdominaux.
2. Maintenez et tirez la peritoneum avec la pince. Assurez-vous de ne pas être tenue et en tirant sur les intestins. faire avec précaution une incision dans le tissu péritonéal et continuer coupant la peau pour exposer les muscles abdominaux. faire avec précaution une incision dans les muscles abdominaux et continuer à les couper pour exposer les intestins.
3. Identifier les deux points et tracer à l'extrémité distale où elle rejoint le rectum / anus. Avec une paire de ciseaux, couper aussi près de l'ouverture anale possible.
4. Identifier l'estomac et de tracer, où il rejoint le petit intestin. Avec une paire de ciseaux, coupe sans l'intestin d'environ 1 cm de l'estomac. Transférer la totalité de la longueur de l'intestin grêle et du côlon libéré dans une boîte de Petri contenant une solution saline propre tamponnée au phosphate (PBS).
5. Avec une main ou une paire de pinces, maintenir l'extrémité distale du côlon et utiliser l'autre main pour démêler délicatement toute la longueur du côlon de tout tissu conjonctif et / ou de la graisse mésentérique.
6. Identifier le caecum(Petite poche entre le petit et le gros intestin) et couper là où le caecum et le côlon rejoignent (l'extrémité proximale du côlon) pour libérer le côlon.
7. Avec une main ou une paire de pinces, tenez le petit intestin et utiliser l'autre main pour démêler délicatement toute la longueur de l'intestin grêle, de tout tissu conjonctif et / ou de la graisse mésentérique. Coupez le caecum et jeter s'il n'y a pas besoin.
   Remarque: Le processus peut être arrêté ici en incubant les intestins disséqués dans le fixateur de Bouin modifié (éthanol / 5% d'acide acétique à 50% dans dH ₂ O) pendant la nuit et suivez la procédure le lendemain.
8. Manipulation d'un segment de l'intestin (l'intestin grêle ou du côlon), remplir une seringue de 10 ml avec le fixateur de Bouin modifié et fixer une aiguille de gavage à elle. Insérer l'aiguille à environ un demi-centimètre dans l'ouverture antérieure du segment intestinal.
9. Tenez l'aiguille de gavage à l'intérieur du segment intestinal en appliquant une pression ferme avec un instrumentsur le segment intestinal. Avec l'autre main tenant la seringue, appliquer une légère pression, mais cohérente pour vider le contenu du segment intestinal en utilisant le fixateur de Bouin modifié. Cette étape permet un nettoyage simultané du segment intestinal et de la fixation immédiate. Utilisez une boîte de Pétri pour recueillir les déchets d'écoulement. Fixation peut être observée par la couleur du côlon tournant opaque.
   Remarque: Assurez-vous de ne pas appliquer trop de pression pendant le rinçage ou le segment intestinal pourrait éclater.
10. Avec des ciseaux, couper ouvrir le segment intestinal longitudinalement le long de la ligne mésentérique. Tenez-le avec une paire de pinces et le rincer brièvement dans une boîte de Pétri contenant du PBS.
    1. Couper le petit intestin en 3 segments égaux: proximale, moyenne et distale. Le segment proximal est celle qui suit immédiatement l'estomac, et le segment distal est celle juste avant le côlon. Le segment proximal est équivalent au duodénum, ​​le milieu de la jéjunum et distale par rapport à lal'iléon.
    2. Pour chaque segment de marquer l'extrémité proximale et l'extrémité distale. L'extrémité proximale est celle qui a été initialement dirigé vers l'estomac, et l'extrémité distale pointée vers le côlon.
11. Utiliser le dessus d'une boîte de Petri pour placer le segment intestinal nettoyé et ouvert. Placer le segment intestinal avec le côté luminal vers le haut.
    1. Pour le côlon, identifier la face luminale par des bigarrures / nervures courent sur sa largeur et sont présents à l'extrémité proximale. Les régions moyennes et distales ont des bigarrures qui courent longitudinalement. Pour le petit intestin, identifier le côté luminal par la surface apparaissant rugueuse, qui marque les villosités.
       Remarque: Pour le petit intestin, il n'y a pas de démarcation anatomique macroscopique externe de proximale, moyenne et régions distales. Toutefois, ces régions peuvent être identifiées dans les sections peuvent sous le microscope. Les villosités sont les plus longs dans la région proximale et deviennent progressivement plus courtes de manière distale où ils sontla plus courte en longueur. Au microscope, les cryptes coloniques sont les plus courtes dans la région proximale qui peut également être identifié par la présence d'arêtes. Les cryptes coloniques sont le plus grand dans la partie médiane et plus courte dans la région distale mais toujours plus grande que dans la région proximale.
12. Procéder à Swiss rouler le côlon:
    1. Gardez le côlon plat ouvert et tirez-le avec une pince à partir de son extrémité proximale vers le bord de la boîte de Pétri.
    2. Gardez côté luminal vers le haut et maintenir l'extrémité proximale avec la pince avec une main et avec l'autre main tenir un cure-dent.
    3. Enroulez le bord de l'extrémité proximale autour du cure-dent en utilisant la pince et légèrement pincer le bord enveloppé contre le cure-dent pour le maintenir en place.
    4. Doucement et lentement commencer à rouler le cure-dent avec les doigts pour rouler le côlon autour du cure-dent pour former un rouleau suisse.
    5. Une fois que toute la longueur du côlon a été mis en place, utiliser une paire de pinces à glisser avec précaution le colon Swiss roll off le cure-dent et dans une / Cassette -embedding tissu de traitement. Placer la cassette dans 10% de formaline tamponnée pendant une nuit à température ambiante.
13. Procéder suisse roulant de l'intestin grêle:
    1. Manipulation d'un segment à la fois, garder le segment ouvert à plat avec le côté luminal et tirez-le avec une pince à partir de son extrémité proximale vers le bord de la boîte de Pétri.
    2. Procéder au laminage suisse comme décrit pour le côlon.
14. Procéder au traitement des tissus fixés au formol pour l'inclusion en paraffine. Procédez comme suit:
    REMARQUE: Utilisez un processeur automatisé (voir matériaux et équipement de pour plus de détails).
    1. Alors que le tissu se trouve dans la cassette, rincer avec du PBS jusqu'à ce que le tissu est complètement retiré fixatif.
    2. Déshydrater le tissu à l'aide d'éthanol dans la séquence suivante: 50% d'éthanol pendant 10 min, 70% d'éthanol pendant 10 min, 80% d'éthanol pendant 10 min, de l'éthanol à 95% pendant 10 minutes, l'éthanol à 100% pendant 10 min, 100% d'éthanol pendant 10 min et 1éthanol à 00% pendant 10 min.
    3. éthanol d'échange avec du xylène dans la séquence suivante: 2: 1 d'éthanol: xylène pendant 10 - 15 min, 1: 1 éthanol: xylène pendant 10 - 15 min, 1: 2 éthanol: xylène pendant 10 - 15 min, 100% de xylène pour 10 - 15 min, 100% de xylène pendant 10 - 15 minutes et 100% de xylène pendant 10 - 15 min. ATTENTION: Xylène est un danger pour la santé, donc le lieu de travail doit être équipé d'une ventilation locale avec une hotte appropriée et l'équipement de protection approprié doit être porté par le personnel.
    4. Échange xylène avec de la paraffine. Effectuez les étapes suivantes dans un four à vide fixé pour 54-58 ° C: 2: 1 xylène: paraffine pendant 30 min, 1: 1 xylène: paraffine pendant 30 min, 1: 2 xylène: paraffine pendant 30 min, 100% de paraffine pour 1 - 2 h, et 100% de paraffine pour 1 - 2 h ou toute la nuit.
       Remarque: Ne laissez pas la paraffine dépasse 60 ° C pendant des périodes de temps prolongées parce que cela va dégrader les polymères de paraffine et de le rendre dur et cassant.
    5. Incluez dans de nouveaux tissus de paraffine et orient fraîche comme dedésiré avant que la paraffine ne durcisse. Pour les cylindres suisses suivant paraffinization des tissus, il est important de repositionner chaque rouleau sur son côté pendant l'enrobage de paraffine. Cela garantit que lors de la coupe, les sections de la longueur entière de chaque rouleau sera produit.
15. Pour la coloration, couper 5 um d'épaisseur des sections en utilisant microtome. Collecter les sections sur des lames chargées et les (cuisson) sécher dans un four à 65 ° C pendant la nuit; laisser refroidir à température ambiante, puis les a utilisés pour la coloration.
    Remarque: Le temps de cuisson peut être réduit à 1 - 2 h selon la façon dont fraîchement coupé les diapositives sont. Si moins d'un mois depuis sectionnant, alors il est conseillé de faire cuire pendant une nuit. Si elle a été plus d'un mois, puis 1 - 2 h de cuisson est suffisante pour gagner du temps. Si à court de temps, le soutien pendant la nuit peut toujours être utilisé.

3. Analyse histologique et immunofluorescence

Effectuer des analyses histologiques et immunofluorescence coloration comme décrit précédemment ^23,24, avec des modifications. Pour améliorer la protéine fluorescente verte (EGFP) immunofluorescence:

1. Cuire les lames dans une étuve à 65 ° C pendant 1 heure pour inactiver l'activité phosphatase alcaline endogène et Déparaffiner ensuite dans le xylène.
2. Incuber les sections dans un bain de 3% de peroxyde d'hydrogène dans du methanol pour bloquer les peroxydases endogènes de tissu; puis réhydrater par incubation dans une série décroissante du bain d'alcool (100%, 95%, 70%), suivie par la récupération de l'antigène dans une solution tampon citrate (10 mM de citrate de sodium, 0,05% de Tween-20, pH 6,0) à 125 ° C pendant 10 min en utilisant une chambre decloaking.
3. Tracez un cercle autour des coupes de tissus en utilisant un stylo qui fournit barrière hydrophobe marquage et incuber les sections avec un tampon de blocage (2,5% de sérum albumine bovine [BSA] dans du TBS-Tween) pendant 30 min à 37 ° C, puis avec un anticorps primaire contre EGFP (dilution 1 : 500) à 4 ° C pendant une nuit dans une chambre humidifiée en agitant doucement.
4. Laver sections et incuber avec un anticorps secondaire fluorescent marqué à la concentration appropriée pendant 30 min à 37 ° C.
5. Laver les lames après le traitement d'anticorps et détachants noyaux secondaires avec Hoechst et monter avec un milieu de montage.
   1. Pour KLF5 / EGFP / Ki-67 co-coloration, les lames de processus tel que décrit dans les étapes 3.1 - 3.3 et effectuer KLF5 coloration par incubation avec un anticorps KLF5 (dilution 1: 150) pendant la nuit.
   2. Appliquer la détection de polymère AP de lapin aux diapositives que selon le protocole.
   3. Klf4 révèle la coloration en utilisant une coloration immunohistochimique chromogène selon le protocole du fabricant.
   4. Effectuer une élution d' anticorps en utilisant le protocole décrit précédemment ^25. Incuber les lames à 50 ° C dans Glycine-SDS (pH 2,0) solution avec agitation pendant 1 h.
   5. Laver les lames avec de l'eau distillée et incuber avec du tampon de blocage (2,5% de BSA dans du TBS-Tween) pendant 30 min à 37 ° C.
   6. Ajouter Ki-67 (dilution 1: 500) et EGFP (dilution 1:500) des anticorps dirigés simultanément et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
   7. Effectuer la détection fluorescente avec des anticorps secondaires appropriés avant coloration avec Hoechst (données non présentées) et monter avec un milieu de montage.
6. Observer la morphologie histologique des tissus sur coloration des sections 5 um avec hématoxyline et l' éosine (H & E) ^26. Pour les images fluorescentes, utiliser des longueurs d'onde d'émission de 535, 646 et 700 pour visualiser EGFP, KLF5 et Ki-67 coloration, respectivement.

Résultats

La technique de laminage suisse en combinaison avec la coloration immunohistochimique permet une analyse complète de petit ou grand tissu intestinal. L'exemple de coloration H & E d'un gros intestin d'une souris C57BL / 6 (Figure 1) est une illustration de la faisabilité et l'efficacité de cette technique. Comme on le voit sur ​​la figure 1, l'image est capable de capturer toutes les parties du côlon: proximale, médiane et distale. Ainsi, il permet u...

Discussion

La technique de laminage suisse est une méthode puissante pour la préparation de tissu intestinal pour l'évaluation histologique et morphologique sur une grande échelle. Contrairement à la technique de laminage suisse décrit précédemment, qui a été initialement mis au point pour la préparation de coupes congelées ^18,19, la procédure présentée ici permet la préparation du tissu intestinal et de fixation rapide pour la fixation au formol et inclusion dans la paraffine (FFPE). Par rapport aux tissus congelés...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kits de dissection en acier inoxydable	VWR	25640-002
Chambre de dévoilement	Biocare Medical	DC2012
Seringue 10 ml	VWR	89215-218
Swingsette Cassette d’enrobage/traitement de tissus avec couvercle	Simport	M515
Superfrost Plus Lames [taille : 25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
Kit de coloration manuel	Tissue-Tek/Sakura	4451
Plat de coloration Vert	Tissue-Tek/Sakura	4456
Plat de coloration White	Tissue-Tek/Sakura	4457
Porte-diapositives à 24 lames avec poignée amovible	Tissue-Tek/Sakura	4465
Four	Thermo Scientific	6243	pour la cuisson des lames à 65 degrés
Microscope de dissection	Microscope à fluorescence Zeiss	Stemi 2000C
	Nikon	Eclipse 90i	Lumière vive et fluorescente, avec objectifs : 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Ethanol 200 proof	AAPR	111000200
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Acide acétique glacial	AAPR	281000ACS
Xylène	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Peroxyde d’hydrogène solution à 25 % dans l’eau	ACROS	202465000
10 % formol cultivé	Fisher Scientific	22-026-213
Fraction sérique bovine V, choc thermique	Roche	3116956001
Tween 20	Sigma Aldrich	P7949
Citrate de sodium	Fisher Scientific	S279
Aiguille à gavage	VWR	20068-624
Anticorps anti Klf5 pour lapin	Santa Cruz Biotechnology	sc-22797	Dilution 1:150
Anticorps anti EGFP pour poulet	Millipore	AB16901	Dilution 1:500
Anticorps	anti Ki67 pour lapinBiocare Medical	CRM325B	Dilution 1:500
Mach3 rabbit AP kit de détection de polymère	Biocare Medical	M3R533L
Warp red chromogen	Biocare Medical	WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 souris  ;	Jackson labs	008875
Processeur automatisé	Leica	Leica TP1020