Article de méthode

typage de Campylobacter jejuni Ssp. doylei Les isolats utilisant PhyloProteomics basés sur la spectrométrie de masse (MSPP)

DOI :

10.3791/54165

⸱

30 octobre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

Dans cet article

Résumé

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Mass phyloproteomics la spectrométrie (MSPP) a été utilisé pour taper une collection de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolats au niveau de la souche par rapport à multilocus sequence typing (MLST).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS offre la possibilité de différencier certaines bactéries non seulement au niveau des espèces et sous-espèces, mais même au-dessous, au niveau de la souche. isoformes alléliques des ions de biomarqueurs détectables se traduisent par des changements de masse spécifiques isolés. phyloproteomics basée sur la spectrométrie de masse (MSPP) est une nouvelle technique qui combine les spectrométriques de masse détectables masses de biomarqueurs dans un système qui permet la déduction des relations phyloproteomic de isoler des changements de masse spécifiques par rapport à un génome séquencé souche de référence. Les séquences d'acides aminés déduites sont ensuite utilisées pour calculer dendrogrammes à base de RRMS.

Nous décrivons ici le flux de travail de MSPP en tapant un ssp Campylobacter jejuni. Doylei collection isolat de sept souches. Les sept souches étaient d'origine humaine et multilocus sequence typing (MLST) ont démontré leur diversité génétique. MSPP-typage a donné lieu à sept types de séquence MSPP différents, reflétant suffisamment leur phyrelations logenetic.

C. jejuni ssp doylei régime MSPP comprend 14 ions de biomarqueurs différents, la plupart du temps des protéines ribosomiques dans la gamme de masse de 2 à 11 kDa.. MSPP peut en principe, être adapté à d'autres plates-formes de spectrométrie de masse avec une gamme étendue de masse. Par conséquent, cette technique a le potentiel de devenir un outil utile pour le typage microbien de niveau de la souche.

Introduction

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Au cours de la dernière décennie, laser assistée par matrice désorption ionisation spectrométrie à temps de vol de masse (MALDI-TOF MS) a avancé comme une méthode standard très apprécié pour le genre microbienne et l' identification des espèces en microbiologie clinique 1, 2. L'identification des espèces est basée sur l'enregistrement des petites empreintes de protéines des cellules intactes ou des lysats cellulaires. La gamme typique de masse pour un spectromètre de masse utilisé en microbiologie clinique de routine est 2-20 kDa. En outre, les spectres résultant peut être utilisé pour distinguer les souches aux dessous-espèces et sous - espèces ci - dessous-niveau 3. Les premières études pionnières ont identifié des ions de biomarqueurs spécifiques pour un sous - groupe particulier de souches de Campylobacter jejuni 4, 5 Clostridium difficile, Salmonella enterica ssp. enterica sérotype Typhi 6, Staphylococcus aureus 7-9 et Escherichia coli 10-12.

La combinaison de plusieurs masses de biomarqueurs variables correspondant aux isoformes alléliques offre la possibilité de sous-typage plus profond. Auparavant, nous avons mis en place avec succès une méthode pour convertir ces variations dans les profils de masse dans les relations phyloproteomic significatives et reproductibles appelés phyloproteomics basés spectrométrie de masse (MSPP) sur un C. ssp jejuni. collection isolat jejuni 13. MSPP peut être utilisé d'une spectrométrie de masse équivalente à des techniques de typage à base de séquences d'ADN comme le typage de séquence multilocus (MLST).

Espèces de Campylobacter sont la principale cause de gastro - entérite bactérienne dans le monde entier 14, 15. En conséquence de sequela post-infectieuse campylobactériose, à savoir, le syndrome de Guillain - Barré, l' arthrite réactive et la maladie inflammatoire de l' intestin peut se produire 16. Les principales sources d'infection sontla viande de bétail contaminé du poulet, de la dinde, du porc, des bovins, des moutons et des canards, le lait et l' eau de surface 15, 17. Par conséquent, les études de surveillance épidémiologique régulière dans le contexte de la sécurité alimentaire sont nécessaires. MLST est le «gold standard» dans le typage moléculaire pour les espèces de Campylobacter 18. Parce que le Sanger séquençage méthode MLST base est un travail intensif, de temps et relativement coûteux, MLST typage est limitée à relativement petites cohortes isolées. Par conséquent, il existe un besoin de méthodes de typage moins coûteux et plus rapide. Ce besoin pourrait être satisfaite par des méthodes de spectrométrie de masse comme MSPP.

Cet article présente un protocole détaillé pour MSPP-typage en utilisant une collection de Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolats et la comparaison de son potentiel avec MLST.

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Protocole

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1. Préparer un milieu de travail sécuritaire en considérant les conditions de biosécurité

  1. Se familiariser avec les règlements de laboratoire et de sécurité qui sont pertinentes pour travailler avec des micro-organismes. La plupart des micro - organismes pathogènes pour l' homme doivent être traitées au niveau de biosécurité 2 conditions , mais certains, tels que Salmonella enterica sérotype Typhi, exigent de biosécurité de niveau 3. Des informations sur le niveau de traitement de chaque agent pathogène peut être consulté à www.cdc.gov/biosafety.
  2. Indépendamment de la classification des risques biologiques du micro-organisme spécifique, considérer tous les matériaux qui sont entrés en contact avec l'agent infectieux comme des déchets infectieux qui doivent être autoclavés avant leur élimination. Respecter les directives régionales de sécurité pour les matières dangereuses et des substances biologiques. Veiller à ce que des récipients appropriés pour l'élimination immédiate et appropriée de matériaux potentiellement contaminés (biorisques) sont disponibles.
  3. Veiller à ce que des instruments stériles (boucles d'inoculation), des solutions et des milieux de culture (plaques d'agar) sont disponibles avant de commencer la culture bactérienne.
  4. Se laver les mains avec du savon antiseptique et de l'eau chaude immédiatement après la manipulation des micro-organismes infectieux.

2. Sélectionnez Référence et Collection isolements

  1. Sélectionnez et obtenir une référence du génome séquencé norme isoler ainsi que les séquences du protéome codé, idéalement au format FASTA. Si plusieurs souches du génome séquencé sont disponibles, les inclure dans l'analyse.
    Note: Cet isolat / ces isolats sera plus tard utilisé pour prédire l'identité des pics de masse observés en spectrométrie de masse (voir la section 7).
  2. Sélectionner et obtenir une variété de potentiellement divers isolats d'une manière telle qu'ils recouvrent la phylogénie des espèces ou sous-espèces d'intérêt.
    Note: Ces isolats seront plus tard être utilisés pour démontrer la variabilité des biomarqueurs dans la population (voir la section 8).
  3. Veiller à ce que toute la collection et isolat (s) de référence sont properly tapé par l'étalon-or respective pour cet organisme particulier 18 - 20.
    Note: Ceci peut inclure une variété de (sous-) méthodes -typing, mais probablement recourir à MLST, qui est encore la méthode standard pour démontrer la diversité génétique de la plupart des espèces microbiennes.
  4. Pour déduire la phylogénie de la collection, calculer un phylogramme à partir des données de frappe, par exemple, en utilisant la méthode non pondérée groupe de paires avec une moyenne arithmétique (UPGMA) dans le logiciel MEGA6 pour les données MLST 21. Pour les données MLST, consultez aussi une base de données MLST et attribuer des types de séquence et complexes clonales respectifs 22.
    Note: Ce sera plus tard utilisé pour analyser la congruence du MSPP avec la méthode de saisie standard d'or plus tôt (voir section 9).

3. Préparer une plaque MALDI Target

ATTENTION: TFA est un acide fort. Une mauvaise utilisation de TFA porte le risque de brûlures de la peau, des lésions oculaires et une irritation sévère of les voies respiratoires supérieures en cas d'inhalation. Par conséquent, des mesures de sécurité strictes doivent être respectées et un équipement approprié de protection individuelle (EPI), y compris des lunettes de protection, masques de protection, des gants appropriés, bottes, ou même une combinaison de protection complète est nécessaire, lors de la manipulation de TFA. Exposition possible au TFA doit être contrôlé par la manipulation de la substance sous ventilation adéquate avec un système de ventilation efficace des gaz d'échappement. En cas de ventilation insuffisante, un respirateur avec filtre homologué doit être utilisé. En outre, le TFA est nocif pour la vie aquatique avec des effets à long terme. Toute libération de TFA dans les eaux usées à l'environnement doit être évité.

Remarque: Avant de repérer les échantillons sur une cible MALDI, nettoyer la plaque cible à fond si la plaque a été utilisée précédemment.

  1. Préparer une solution aqueuse d'éthanol à 100 ml de 70% en utilisant 30 ml d'eau déminéralisée et 70 ml d'éthanol pur.
  2. 250 ul de la préparation d'un acide trifluoroacétique aqueux à 80% (TFA) à une solution en mélangeant 50ul d'eau déminéralisée et 200 ul de TFA à 100% dans un tube de réaction et le tube tourbillonnement pendant 1 min.
  3. Nettoyez la cible MALDI en le plaçant dans un plat en verre et immergeant dans 70% d'éthanol aqueux pendant environ 5 min à température ambiante.
  4. Rincer la cible sous l'eau chaude.
  5. L'utilisation d'un mouchoir en papier, essuyez la plaque cible intensive avec une solution aqueuse d'éthanol à 70% pour éliminer tous les échantillons précédents et d'autres débris potentiel.
  6. Si un nettoyage supplémentaire est nécessaire, rincer à l'eau chaude tout en essuyant avec un mouchoir en papier.
  7. Éliminer les contaminants résiduels et éventuellement invisible, en recouvrant la surface cible avec une mince couche de 80% de TFA aqueux (~ 100 ul par 96 points) et en essuyant toutes les positions cibles nettoyer avec un mouchoir en papier.
  8. Enfin, rincer la cible pour éliminer l'acide, essuyez à l'aide d'un mouchoir en papier, et le laisser pendant au moins 15 min à température ambiante pour évaporer le liquide résiduel.

4. Préparation d'unSolution de matrice d'acide a-cyano-4-hydroxy-cinnamique contenant un Calibrant intérieur; 45

  1. Préparer une solution de matrice saturée en dissolvant 10 mg de α-cyano-4-hydroxy-cinnamique (HCCA) dans 1 ml d'un mélange de 50% d'acétonitrile, 47,5% d'eau et 2,5% de TFA. Résiduel non dissous HCCA restera si la solution est saturée.
  2. Ajouter l'insuline humaine recombinante comme étalon interne. Pour cela, préparer une solution mère à une concentration finale de 10 pg / pl dans 50% aqueuse acétonitrile, aliquote et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.

5. MALDI-TOF Mass Spectrometry

Remarque: Les conditions de culture spécifiques pour les organismes d'intérêt doivent être utilisés. Les échantillons pour MALDI-TOF MS peuvent être préparés soit par la préparation du frottis ou l'extraction, en fonction de l'organisme (voir section 8.4.1). Bien que la méthode d'extraction de l'acide formique éthanol fournit inactivation suffisante des agents pathogènes, la préparation des frottis doit être réalisé sous suffdes conditions de biosécurité isant au besoin (voir la section 1). En règle générale, il n'y a aucun risque d'infection après l'application de la matrice, mais pour certains agents pathogènes spécifiques des protocoles d'inactivation spécifiques sont nécessaires. Ainsi, par exemple MALDI-TOF MS des espèces Nocardia exige la lyse préalable des bactéries dans l' eau bouillante, à la suite d' une précipitation à l' éthanol des protéines 23. EI Khéchine et al. mis au point un procédé d'inactivation des mycobactéries, en chauffant les colonies bactériennes à 95 ° C pendant 1 h dans des tubes à bouchon à vis contenant de l' eau et 0,5% de Tween 20 24.

  1. Smear Préparation
    1. Étaler une quantité pinhead taille d'une colonie bactérienne directement sur une position de plaque cible MALDI ( «spot»).
    2. Superposez chaque tache avec 1 pl de HCCA matrice ou matrice régulière contenant le calibrant interne et laisser cristalliser à la température ambiante. Pour la détermination de la masse exacte du pic d'étalonnage, superposer une commande spot avec 1 ul d'essai standard et 1 pl de la matrice HCCA contenant le calibrant interne.
      Remarque: Ici, comme test standard d' un extrait d ' Escherichia coli DH5 alpha est utilisé qui démontre une empreinte de protéine caractéristique MALDI-TOF. Il est enrichi avec deux protéines qui étendent la limite supérieure de la gamme de masse détectable.
  2. Méthode d'extraction
    1. Récolte environ cinq colonies à partir d'une culture sur plaque de gélose avec une boucle d'inoculation et de suspendre à fond dans 300 pi d'eau distillée deux fois dans un tube de 1,5 ml de réaction. Ajouter 900 pi d'éthanol absolu et bien mélanger par pipetage répété jusqu'à ce que les colonies bactériennes sont complètement suspendues.
      Remarque: À cette étape, il est possible et bien établi pour stocker les échantillons à -20 ° C. En outre, l'inactivation des agents pathogènes peut être testée en repiquant 1-10 ul de l'extrait sur une plaque de gélose appropriée après incubation dans des conditions de croissance optimales. Réussi àl'activation est indiquée par l'absence de croissance microbienne.
    2. Centrifuger l'échantillon à 13 000 x g pendant 1 min, jeter le surnageant et le culot sécher à la température ambiante pendant 10 minutes. Remettre en suspension le culot à fond par pipetage vers le haut et vers le bas dans 50 ul d'acide formique à 70%.
    3. Ajouter 50 ul d'acétonitrile et mélanger. Retirer les débris par centrifugation à 13 000 xg pendant 2 min. Transfert 1 pl de surnageant sur une position de l'échantillon sur une plaque cible MALDI et laisser sécher pendant 5 min à température ambiante.
    4. Superposez chaque tache avec 1 pl de matrice HCCA contenant le calibrant interne et laisser cristalliser à la température ambiante.
  3. Enregistrement des spectres de masse
    Note: Pic-picking à partir des spectres de masse est effectué en utilisant les procédures standard recommandée (algorithme Centroïde; S / N. 2; rel Seuil d'intensité: 2%; largeur du pic 3 m / z, soustraction de base: TopHat)
    1. Calibrer l'appareil selon le protoc des fabricantsol.
    2. Pour chaque point, de recueillir 600 spectres dans 100-plans étapes.
      1. Allez à l'onglet "AutoXecute" du logiciel de configuration du spectromètre de masse. Ouvrez la "Méthode" par un clic gauche sur le bouton «Méthode» et choisir la méthode par exemple, "MBT_AutoX" dans le menu déroulant.
      2. Gauche-cliquez sur le bouton "Editer ..." à droite du menu "Méthode" pour ouvrir le "AutoXecute Method Editor". Allez à l'onglet "Accumulation". Réglez le "Résumer" valeur "600" et les "coups satisfaisants dans la" valeur "_X_ étapes de prise de vue" à "100".
  4. Spectre interne Procédure d'étalonnage
    Note: Les erreurs de mesure de la minute sont inhérentes à la spectrométrie de masse. En fonction de l'utilisation de l'instrument intermittente, la température de l'appareil et ré-étalonnage, les valeurs de mesure obtenues peuvent varier entre les expériences. Après l'étalonnage des instruments de pré-mesure et post-mesure spectre calibration à un étalon interne est la façon la plus précise pour assurer la comparabilité inter-spectre.
    1. Effectuez les procédures suivantes pour chaque liste d'étalonnage de pointe:
      1. Lancer le navigateur du spectre (par exemple, Flexanalysis et spectre ouvert:. Menu "Fichier" → "Open ...")
      2. Créer une liste de contrôle de masse avec calibrant pic: menu "Méthode" → "Open ...".
      3. Choisir la méthode: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Open".
      4. Modifier la liste de contrôle de masse: Décochez toutes les calibrants.
      5. Ajouter Calibrant pic à fond: Pic Label: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; m_z: "5808,29"; Tolérance [ppm]: "50"; Vérifiez Calibrant case.
      6. Enregistrer en tant que, par exemple, "liste de calibrant MSPP".
    2. Pour chaque spectre, choisissez le pic calibrant de la liste, cliquez sur "Automatique Assign" et appuyez sur "Ok".
ove_title "> 6. Vérifiez la procédure d'étalonnage interne

  1. Expérimentalement Déterminer la masse exacte du pic d'étalonnage.
    1. Préparer deux points avec 1 ul d'essai standard chaque (étape 5.1.1). Superposez la première avec 1 pl de matrice régulière HCCA, le second avec 1 ul matrice de calibrant-dopés.
    2. Obtenir les spectres de masse à partir de chaque point (section 5.3), et étalonner en interne pour les pics standard de test (section 5.4).
    3. Superposez les deux spectres en les ouvrant avec le navigateur du spectre (par exemple, Flexanalysis et spectre ouvert: menu "Fichier" → "Open ...") et de trouver le pic à la masse attendue (insuline m / z = 5,808.29), qui devrait être présent dans le spectre d'étalon-dopés, mais pas dans le spectre obtenu avec la matrice régulière.
  2. Vérifiez que le Calibrant pointe est pas cachées par d'autres Biomarker de l'organisme d'intérêt.
    1. Préparer deux points (section 5.1) avec la souche de référence et overlay la première avec 1 pl de matrice régulière, la seconde avec 1 ul matrice de calibrant-dopés.
    2. Acquérir des spectres de masse des deux points (section 5.3) et superposer les spectres résultant en les ouvrant avec le navigateur du spectre (par exemple, Flexanalysis et ouvert spectre: menu "Fichier" → "Open ..."). Assurez-vous que le pic de calibrant est clairement visible dans le spectre obtenu avec la matrice à pointes et non masquée par un autre signal adjacent. Si cela est le cas, choisir un autre calibrant pour cet organisme particulier.
      Remarque: L'utilisation d'un étalon interne à pointes augmente de manière significative la précision pour déterminer les variations de masses de biomarqueurs. En utilisant cette méthode, les différences de masse jusqu'à 1 Da peuvent être détectés. En variante, des masses aussi invariantes provenant des organismes peuvent être utilisés comme étalons. Toutefois, par définition, toutes les masses d'organismes dérivés doivent être considérés comme potentiellement variables, sauf preuve du contraire.

7. Identifier Biomarker Ions dans la souche de référence

  1. Mesurer le spectre de masse de la souche de référence, Utilisation de la matrice Pointu avec le Calibrant interne.
    1. Étaler une quantité pinhead taille d'une colonie bactérienne (section 5.1) ou 1 ul d'extrait de protéine bactérienne (section 5.2) directement sur une position de plaque cible MALDI ( «spot»).
    2. Superposez chaque tache avec 1 pl de matrice HCCA contenant le calibrant interne et laisser la plaque cible à cristalliser à la température ambiante (section 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Les spectres de masse de la fiche de la souche de référence (section 5.3).
  2. En interne calibrer le spectre de référence à la masse calibrant (ici: l'insuline à m / z = 5,806.29), et par la suite pré-traitement par soustraction référence (TopHat) et de lissage (paramètres: SavitzkyGolay; largeur: 2 m / z, 10 cycles).
    1. Lancer le navigateur du spectre (par exemple, Flexanalysis et ouvert spectre: menu "Fichier" → "Open ...; »).
    2. Choisir la méthode: menu déroulant "Méthode" → "Open ...", un clic gauche de la méthode de choix, par exemple, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Open".
    3. Calibrer spectre en choisissant "Interne ..." dans le menu déroulant "Calibrer". Une fenêtre s'ouvre le pic de calibrant (s) (section 5.4). Gauche-cliquez sur le pic de calibrant (insuline) → Gauche-cliquez sur "OK". Choisissez "spectres process" dans le menu déroulant "Processus".
    4. Pour la soustraction de base activer le spectre dans la liste des fréquences sur le côté droit. Choisissez "Soustraire Spectre de masse de référence" dans le menu déroulant "Processus".
    5. Pour lisser le spectre, activez le spectre dans la liste des fréquences sur le côté droit. Choisissez "Lisser Spectre de masse de référence" dans le menu déroulant "Processus".
  3. À partir des données de séquençage du génome de la souche de référence, le calcul de la theoretical monoisotopique du poids moléculaire de chacune des protéines codées par la traduction de la séquence d'ADN dans la séquence d'acides aminés correspondant en utilisant un éditeur d'alignement de séquence. Copier-coller cette séquence de protéine dans la zone de saisie sur le portail ExPASy Bioinformatics Resource (http://web.expasy.org/compute_pi/). et appuyez sur "Cliquez ici" pour calculer pI / Mw. Dans le cas de C. jejuni ssp doylei. calculer la masse de 14 biomarqueurs détectables.
  4. Copier les résultats dans une feuille de calcul, avec une colonne contenant l'identifiant de gène et l'autre la masse moléculaire. Trier les lignes en poids moléculaire calculé pour faciliter plus facile consultation des masses. Remarque: Les autres colonnes sont facultatives; annotation fonctionnelle peut être particulièrement utile plus tard pour l'interprétation.
  5. Insérez une deuxième colonne dans la feuille de calcul pour le poids moléculaire de la forme de-methioninated, soustrayant 135 Da de la masse moléculaire monoisotopique. Note: Ceci est parce que certaines protéines subissent aprèstraductionnelles par élimination protéolytique de la méthionine -terminale N.
  6. Attribuez à chaque grande masse biomarqueur mesurée aux masses calculées à partir de la souche de référence en recherchant la masse mesurée à partir de la table du génome préparé ci - dessus (tableau 1).
  7. Si les ions de biomarqueurs ne peuvent pas être attribués à des produits de gènes prédits, envisager d' autres modifications post - traductionnelles (méthylation, acétylation, prénylation, etc., voir http://www.abrf.org/delta-mass pour une compilation des modifications et des changements de masse associés ). Pour toute autre modification post-traductionnelle connue qui est fréquemment observé dans les organismes d'intérêt ajouter une autre colonne à la table et recalculer le poids moléculaire analogue au procédé pour la forme de-methioninated.
  8. Mettre en place un autre onglet de feuille de calcul, et enregistrer pour chaque biomarqueur ion de la masse et de l'identificateur dans une colonne de table séparée.

8. Évaluer Biomarker Variabilitédans la population

  1. Calibrer les spectres de masse obtenus à partir de la collecte des isolats, comme cela se fait pour la souche de référence (s) (section 5.4.2).
  2. Identifier les biomarqueurs variantes dans les spectres de masse. Une masse variante se caractérise par l'absence d'une masse connue à partir du spectre de référence et l'aspect d'une masse nouveau pas présent dans la référence. La différence de masse doit être conforme à un seul échange d'acides aminés (tableau 2), ou une combinaison de ceux - ci.
  3. A un isolat par ligne, enregistrer la masse mesurée pour chaque biomarqueur et l'isoforme prédit dans les colonnes de table respectives.
    Note: Rarement, certains changements de masse peuvent être attribuables à plusieurs différents échanges d'acides aminés, par exemple, à la fois, N échangé par D et Q échangée par E, et vice - versa, entraîner un changement de masse de 0,985 Da (tableau 2). Ce problème intrinsèque ne peut être résolu par spectrométrie de masse seul. Par conséquent, différentes isoformes au niveau de séquences de protéines ayant la même massedoivent être traités comme un seul type MSPP. Séquençage Sanger parallèle des gènes d'ions de biomarqueurs particuliers a confirmé que ce problème ne se produit pas tout MSPP-tapant le C. jejuni ssp. doylei isoler collection utilisée dans cette étude.
  4. Confirmer nouveaux types MSPP par PCR-amplification et le séquençage des gènes marqueurs respectifs. À son tour, cela sert aussi la confirmation que l'identité de biomarqueurs a été attribué correctement.
    1. Culture bactérienne isole dans des conditions de croissance optimales. Culture C. jejuni ssp. doylei souches sur gélose Columbia au sang de mouton à 5% , à 37 ° C dans des conditions microaérophiles (5% de O 2, 10% de CO 2, 85% N 2). Incuber pendant environ 48 h. Utiliser une plaque de gélose séparée pour chaque isolat afin d'éviter la contamination croisée.
    2. Extraire l'ADN génomique des isolats bactériens en utilisant un kit d'extraction d'ADN appropriée / machines automatisées selon les instructions du fabricant.
    3. Amplifier les gènes marqueurs respectifs en utilisant les amorces énumérées dans le Tableau 3 Effectuer toutes les réactions PCR dans les conditions suivantes:. dénaturation à 94 ° C pendant 30 secondes; recuit à 55 ° C pendant 30 secondes; allongement à 72 ° C pendant 30 secondes.
    4. Déterminer la séquence d'ADN de chaque amplicon par séquençage de Sanger en utilisant une quantité appropriée d'ADN génomique (généralement 600 à 700 ng d'ADN est suffisante à une concentration d'environ 100 ng / ul) et l'une des amorces d'amplification (ce qui est habituellement effectuée par utilisation d'un fournisseur de services).
  5. Dans une table séparée (voir tableau 4), enregistrer la séquence de protéine déduite pour chaque nouvelle isoforme en utilisant un outil de traduction approprié (par exemple, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Calculer une phylogénie basée à MSPP et comparer à l'étalon-or

  1. Concaténer les séquences biomarqueur d'acides aminés particuliers appartenant à tle type qu'il MSPP des isolats en une seule séquence continue en utilisant un éditeur d'alignement de séquence, comme BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 ou la feuille de calcul de biomarqueurs.
  2. Calculer phylogénie par le clustering comme cela se fait pour les données de frappe de l' étalon-or, par exemple, le regroupement UPGMA 21.
  3. Comparer la phylogénie à base RRMS à celle obtenue avec l'étalon-or 4, 13.

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Résultats

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Auparavant, nous avons réussi à établir un régime MSPP pour C. ssp jejuni. jejuni 13. Ici, nous avons cherché à étendre la méthode à la fratrie sous - espèce C. ssp jejuni. doylei. Dans ce cadre spécifique, sept C. ssp jejuni. doylei isolats ont été acquis de la collection belge de micro - organismes / Laboratoire de microbiologie UGent BCCM / LMG Gand, Belgique. Les sept souches utilisées pour le...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'étape la plus critique dans la mise en place d'un régime MSPP est la détermination génétique sans équivoque des identités biomarqueur d'ions. S'il est impossible d'identifier un biomarqueur sans aucun doute, alors il devrait être exclu du régime 13.

C. ssp. doylei régime jejuni comprend 14 ions de biomarqueurs différents. Ceux - ci sont 5 moins par rapport à C. ssp jejuni. schéma jejuni MSPP 13 ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants à Hannah Kleinschmidt pour son excellent support technique. Cet article a été financé par le programme de soutien à l’Open Access de la Deutsche Forschungsgemeinschaft et le fonds de publication de la Georg August Universität Göttingen.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
acétonitrileSigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne34967
Système Autoflex III TOF/TOF 200Bruker Daltonics, Brême, AllemagneGT02554 G201Spectromètre de masse
norme d’essai bactérien BTSBruker Daltonics, Brême, Allemagne604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Brême, Allemagne263564Progiciel
Étalon de test bactérien Bruker IVDBruker Daltonics, Brême, Allemagne82901905 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique collection coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG8843ATCC 49349 ; IMVS 1141 ; NCTC 11951 ; souche 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique coordination de la collecte de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG7790ATCC 49350 ; CCUG 18265 ; Kasper 71 ; LMG 8219 ; NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat  ;Belgique collecte coordonnée de micro-organismes/Laboratoire de microbiologie UGent BCCM/LMG Gand, BelgiqueLMG8870NCTC A613/87
Base de gélose Columbia  ;Merck, Darmstadt, Allemagne1.10455 .0500500 g
Boussole pour FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Brême, Allemagne251419Progiciel
de sang de mouton défibriné  ;Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, AllemagneSR0051
éthanol Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne02854 Acide
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneF0507
Matrice HCCABruker Daltonics, Brême, Allemagne604531
Tissu en papier KimwipesKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Brême, Allemagne259935Progiciel
Mât Cryobank flaconsMast Diagnostica, Reinfeld, AllemagneCRYO/B
MSP 96 cible en acier poliBruker Daltonics, Brême, Allemagne224989
QIAamp DNA Mini Kit  ;Qiagen, Hilden, Allemagne51304
insuline humaine recombinanteSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneI2643
acide trifluoroacétiqueSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneT6508
eau, biologie moléculaireSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneW4502
formique Fluka Z188956

Références

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MALDI TOF MSTypage au niveau de la soucheAnalyse des ions biomarqueursRelations phyloprot omiquesProt ines ribosomalesPr paration de la solution de matriceProtocole de centrifugationAcquisition de spectres de masse

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