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Article de méthode

Génération d'un humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches

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DOI :

10.3791/54167

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29 août 2016

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un nouveau modèle de foie de souris humanisé généré chez des souris TRECK)/SCID après la transplantation de cellules hépatiques humaines immatures et expansibles.

Résumé

Un nouveau modèle animal impliquant des souris chimères avec des foies humanisés établis par transplantation d’hépatocytes humains a été développé. Ces souris, chez lesquelles le foie a été repeuplé avec des hépatocytes humains fonctionnels, pourraient servir d’outil utile pour étudier la biologie des cellules hépatiques humaines, le métabolisme des médicaments et d’autres applications précliniques. L’un des facteurs clés nécessaires à la réussite de la transplantation d’hépatocytes humains chez la souris est l’élimination des hépatocytes endogènes afin d’empêcher la compétition avec les cellules humaines et de fournir un espace et un microenvironnement appropriés pour favoriser l’expansion et la différenciation des cellules de donneurs humains. À ce jour, deux principaux modèles de souris ayant subi des lésions hépatiques utilisant l’hydrolase de fumarylacétoacétate (Fah) et l’activateur de l’uroplasminogène (uPA) ont été établis. Cependant, les souris Fah sont principalement utilisées avec des hépatocytes matures et l’application du modèle uPA est limitée par une reproduction réduite. Pour surmonter ces limitations, des souris TRECK (TRECK)/SCID ont été utilisées pour la différenciation in vivo d’hépatocytes humains immatures et la génération hépatique humanisée. Les cellules souches hépatiques humaines (HpSC) ont repeuplé avec succès le foie de souris Alb-TRECK/SCID qui avaient développé une insuffisance hépatique fulminante mortelle après un traitement à la toxine diphtérique (DT). Ce modèle de foie humanisé chez la souris Alb-TRECK/SCID aura des applications fonctionnelles dans des études impliquant le métabolisme des médicaments et les interactions médicamenteuses et favorisera d’autres études in vivo et in vitro.

Introduction

Les souris sont couramment utilisées pour les tests pharmaceutiques car la recherche biomédicale chez l’homme est limitée1 ; cependant, ces modèles ne sont pas toujours utiles car ils peuvent simuler de manière inexacte les effets observés chez l’homme. La plupart des médicaments actuellement utilisés à des fins médicales sont métabolisés principalement dans le foie. Cependant, le même médicament peut être métabolisé en différents métabolites dans le foie de souris et d’homme en raison de différences inter-espèces. Ainsi, il est souvent difficile de déterminer au cours du développement si un médicament potentiel présente des risques pour des applications cliniques2,3.

Pour résoudre ce problème, des foies de souris « humanisés » ont été développés en cultivant des cellules hépatiques humaines à l’intérieur de souris4 à 6 ; ces modèles présentent des réponses médicamenteuses similaires à celles observées dans le foie humain. Les principaux modèles de souris actuellement utilisés pour la génération humanisée du foie comprennent les souris4,7 activateurs d’uroplasminogène (uPA+/+), les souris 6 de l’hydrolase de fumarylacétoacétate (Fah−/−) et les souris thymidine kinase (TK-NOG) récemment signalées.

Cependant, des rapports antérieurs ont montré que les cellules immatures humaines transplantées ou les cellules souches sont moins compétitives que les hépatocytes humains adultes dans les foies de souris Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. De plus, les souris Fah−/− n’offrent un avantage de croissance que pour les hépatocytes différenciés et non pour les cellules progénitrices hépatiques immatures11. La transplantation en laboratoire de cellules souches hépatiques humaines (HpSC) chez des souris TK-NOG n’a pas abouti. Par conséquent, il n’existe actuellement aucun modèle murin utile pour la greffe efficace de cellules hépatiques humaines immatures.

Ainsi, nous avons développé un nouveau modèle de souris Alb-TRECK/SCID qui pourrait être efficacement repeuplé avec des hépatocytes humains immatures. Ce modèle de souris transgénique exprime les récepteurs humains du facteur de croissance de type EGF (HB-EGF) liés à l’héparine sous le contrôle d’un promoteur d’albumine spécifique aux cellules hépatiques. Suite à l’administration de toxine diphtérique (DT), ces souris développent une hépatite fulminante due à l’ablation conditionnelle des hépatocytes, permettant la résidence et la prolifération des cellules du donneur12. Bien que des hépatocytes de souris aient été transplantés avec succès chez des souris Alb-TRECK/SCID dans des études antérieures13,14, la génération d’un foie humanisé à l’aide de souris Alb-TRECK/SCID n’a pas encore été rapportée.

Dans cette étude, des foies humanisés ont été générés chez des souris Alb-TRECK/SCID par transplantation de HpSCs. Ce foie humanisé fournit un environnement in vivo pour la différenciation universelle des cellules souches et la capacité de prédire les modèles de métabolisme des médicaments humains et les interactions médicamenteuses.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices de protection des animaux de l'Université de Yokohama City.

1. Génération du modèle hépatique aiguë blessures souris

  1. Ajouter 1 ml de solution phéniqué 0,85% NaCl (0,6 g de phénol dans 100 ml d'une solution de NaCl à 0,85%) à 1 mg de la toxine diphtérique (DT) pour faire un / ml DT solution mère 1 mg. Remarque: DT à une concentration de 1 mg / ml peut être stocké pendant environ 2 ans à 3 ° C à 8 ° C.
  2. Série diluer la solution 1 mg / ml de bouillon DT à 0,3 pg / ml de DT dans phéniqué une solution de NaCl à 0,85% et de préparer une aliquote de la solution DT / ml 0,3 pg comme solution de travail. Remarque: Cette solution de travail doit être fraîchement préparée.
  3. Pour effectuer des expériences en utilisant une dose sublétale (~ 50% de létalité), administrer les souris 8 semaines, âgé d'une dose / kg de 1,5 ug de DT.
    1. Effectuer une injection intrapéritonéale de DT en maintenant la souris en décubitus dorsal et insérez le needle ci-dessous le pli des genoux, à gauche ou à droite de la ligne médiane. Éviter la ligne médiane pour empêcher la pénétration de la vessie. Angle l'aiguille à environ 45 ° par rapport au corps.
    2. À l'aide d'une seringue à insuline, l'injection des souris avec 100 pi de fraîchement préparée de 0,3 pg / ml DT par 20 g de poids de souris. Par exemple, une souris de 18 g doit recevoir 90 ul de la solution DT / ml 0,3 ug.
  4. À post-injection de DT de 48 heures, un prélèvement de sang de la veine caudale en plaçant la souris dans un dispositif de retenue et en chauffant la queue de la souris dans un bain d'eau à 37 ° C pendant environ 10 minutes pour dilater les vaisseaux sanguins. Ensuite, faire un 1 mm nick dans la queue 2 cm de la pointe avec une lame de scalpel et de recueillir le sang avec un tube microcapillaire.
    1. Centrifuger le tube microcapillaire contenant le sang à 1500 g pendant 5 min et recueillir le sérum en séparant le surnageant et culot cellulaire.
  5. Pipette 50 ul de 01h20 sérum de souris diluée sur GOT / AST-PIII glisse. Mesurer l'absorbance du produit de réaction (colorant bleu) à 650 nm en utilisant un analyseur automatique de chimie sèche multi-usages selon le protocole du fabricant.
    NOTE: La température lue de l'aspartate aminotransférase (AST) / activité transaminase glutamique oxaloacétique (GOT) est affiché automatiquement. 2 jours après l'injection DT, environ 60% des souris présentait des valeurs AST entre 12.000 - 16.000 UI / L et ont été considérés comme souffrant de lésions hépatiques aiguës. Ces souris ont été transférées dans une nouvelle cage et utilisés comme receveurs de greffes de cellules.

2. Préparation des hépatiques humains Cellules souches

  1. Isoler les cellules souches hépatiques humaines à partir de cellules hépatiques primaires humaines foetales avec un trieur de cellules en utilisant les antigènes cellulaires CDCP1, CD90 et CD66 pour obtenir une sous-population CDCP1 + CD90 + CD66-, puis ensemencer la population de cellules isolées sur des boîtes de culture de collagène IV-enrobés, comme indiqué précédemment 15. Utiliser des cellules primaires fœtales hépatiques humains d'un embryonâge entre les semaines 14 et 18.
  2. Recueillir les cellules souches hépatiques humaines cultivées à 80% - 90% de confluence sur des boîtes de culture de 100 mm, aspirer le milieu de culture, laver les cellules avec 10 ml de PBS, puis retirez le PBS. Trypsiniser les cellules avec une solution de trypsine / EDTA 2 ml 0,05% pendant 5 min à 37 ° C. Note: Les cellules à plus de 90% de la confluence ne conviennent pas pour une transplantation de cellules depuis la différenciation cellulaire peut influencer leur capacité proliférative chez la souris.
  3. Surveiller l'état de dispersion des cellules sous un microscope. Lorsque les cellules semblent flotter librement ou coulant, arrêter la digestion enzymatique par addition de 8 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS.
  4. Les cellules en suspension lentement à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 100 xg et 4 ° C.
  5. remise en suspension avec précaution le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM / F12 contenant 10% de FBS et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope.
  6. Diviser les cellules dans 1,0 x 10 6 cellules par 50 pi de PBS aliquotes pour chaque souris individuelle et de stocker sur la glace jusqu'à la transplantation.

3. intraspléniques transplantation d'hépatiques humains Cellules souches

  1. Placez une cage propre sur un 37 ° C coussin chauffant électrique.
  2. Anesthésier la souris à l'aide d'isoflurane inhalation (1 - 1,5% (volume / volume) dans 2 litres d'oxygène par minute) en le plaçant au-dessous de la buse. Vous pouvez également utiliser des tubes contenant de la gaze imbibée d'isoflurane.
    1. Assurez-vous que la souris est anesthésiée par pincement légèrement la patte arrière. Si un réflexe est déclenchée, placez la souris en arrière dans la chambre. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  3. Raser le site chirurgical en utilisant une tondeuse électrique et d'appliquer 70% (volume / volume) d'éthanol et de povidone-iode à stériliser. Ensuite, faire une 1 cm incision cutanée dans le flanc gauche juste au-dessous de la frontière costal des côtes, suivie par une incisionla paroi abdominale, ainsi que le péritoine.
  4. exposer soigneusement la rate. Utiliser une seringue de microinjection à 100 ul avec une aiguille 32 G 02/01 pouces pour injecter directement 1,0 x 10 6 cellules souches hépatiques humaines dans 50 ul de PBS dans la rate de chaque souris. Inclinez l'aiguille à un angle de 5 ° pour l'injection.
    1. Faire en sorte que la profondeur d'injection est inférieure à la moitié de l'épaisseur de la rate. L'aiguille doit entrer dans la rate à une extrémité (la tête) et déposer les cellules à l'autre extrémité (la queue).
  5. Pour éviter les fuites des cellules après l'injection, appliquer doucement la pression avec un doigt pendant 2 minutes puis retirer l'aiguille.
  6. Placez la rate dans le corps de la souris et fermer la cavité avec une suture de fonctionnement normal pour la musculature et de la peau.
  7. Transférer les souris dans une cage préchauffé à 37 ° C immédiatement après la transplantation. Pour assurer la souris est capable de respirer confortablement, placez la souris sur le côté dans la cage, unannuler le contact entre le lit de la cage et le site de l'intervention chirurgicale.
  8. Surveiller les souris jusqu'à ce que l'anesthésie se dissipe pour assurer les sutures restent fermées et les souris retour à des conditions de chirurgie pré.
  9. Veiller à la souris sont fournis avec de l'eau potable normale et de la nourriture. Au bout de 1 h, le retour de la cage dans la chambre de souris du centre de l'animal et de suivre les souris quotidiennement.

4. Détection de transplanté hépatique humaine souches hépatocytes cellulaires dérivées dans le foie de souris

Remarque: Pour les procédures suivantes, euthanasier tous les animaux à l'aide d'une surdose de kétamine et de xylazine suivie par dislocation cervicale.

  1. A 4 - 6 semaines après la transplantation, euthanasier les souris et ouvrir la cavité abdominale en coupant simultanément le derme et le fascia en utilisant des ciseaux chirurgicaux.
  2. Disséquer le tissu conjonctif au-dessus du péritoine, en utilisant les ciseaux comme un épandeur, et couper le péritoine le long de la ligne blanche pour ouvrir le péritonéalecavité.
  3. Soulevez le sternum avec une pince, percer le diaphragme, et couper à travers chaque côté du sternum à travers la ceinture cervicale.
  4. Sectionner la veine cave inférieure sur la face dorsale du foie et de tirer l'oesophage par le foie dans la direction antérieure. Retirer le diaphragme afin d'éliminer le foie.
    Remarque: Veillez à garder les pointes des ciseaux étaient à la hausse afin d'éviter tout dommage aux organes thoraciques dessous. Le thymus a une tendance à se cramponner de temps en temps à la face dorsale du sternum et ceci doit être soigneusement évité.
  5. Utiliser le diaphragme comme une poignée, commencer à tirer le foie hors de la cavité abdominale. La veine cave intérieure tiendra le foie en place. Couper la veine cave intérieure; veillez à ne pas libérer prématurément le droit surrénale.
    Remarque: Les souris ont un foie à quatre lobes constitué d'un lobe médian, lobe gauche, lobe droit et le lobe caudé. La vésicule biliaire est suspendue dans la petite bifurcationle lobe médian.
  6. Séparer les lobes de l'autre au niveau des jonctions et les incorporer dans la température optimale de coupe (OCT) Composé selon le protocole du fabricant. Congeler les PTOM contenant le tissu hépatique dans les grilles métalliques sur le cryostat.
  7. Couper des échantillons de sections 5 um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat à -18 ° C et les monter sur des lames de microscope RT. Conserver le stock à -80 ° C. Préparer les lames de l' hématoxyline et de l' éosine (H & E) et coloration par immunofluorescence selon des procédés rapportés précédemment 16.

5. Détection de Human Albumine Sécrétion et calcul du taux chimériques

  1. Pour mesurer la reconstitution du foie humain, effectuer l'albumine humaine ELISA en utilisant du sérum et un kit ELISA humain d'albumine selon les instructions du fabricant.
  2. Calculer le taux chimérique du foie humanisé par analyse en temps réel PCR des niveaux d'expression dans l'ensemble-humanisé foie. Déterminer l'ex relatifpressure ratio de niveau d'actine humain spécifique à l'humain-souris de croix actine (rapport 1) et le rapport de l'actine de la souris spécifique à l'humain-souris de croix actine (rapport de 2). Le taux chimérique est calculé comme le rapport 1 / (rapport 1 + rapport 2).

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Résultats

Alb-Treck / SCID hépatocytes de souris expriment le récepteur DT gène humain HB-EGF sous le contrôle d'un promoteur de l' albumine et présentent des effets cytotoxiques après l' administration de DT 12. Pour évaluer les effets du traitement DT sur les lésions du foie, des doses DT de 1,5 ug / kg ont été injectées dans des souris SCID 8 semaines vieux Alb-Treck / et les changements pathologiques dans l'h après administration du foie 48 DT ont été histologiquemen...

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Discussion

Des études récentes ont montré que le foie de souris peut être repeuplée avec des hépatocytes humains, y compris les hépatocytes adultes et des cellules souches hépatiques proliferatives 17. Ces foies repeuplés ont été utilisés comme modèles expérimentaux précliniques pour les tests de métabolisme des médicaments et de la découverte et le développement 18 médicaments; en outre, ils ont fourni un environnement in vivo pour la maturation et la différenciation cellulaire 19. L'...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Projet de génétique des mammifères, Institut métropolitain des sciences médicales de Tokyo, pour avoir fourni les souris. Nous remercions également S. Aoyama et Y. Adachi de l’Institut de recherche sur l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’excrétion ADME, Sekisui Medical Company Ltd., Japon, ainsi que K. Kozakai et Y. Yamada pour leur aide dans l’analyse LC-MS/MS. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT) du Japon à Y-W.Z. (18591421, 20591531 et 23591872) ; par le projet novateur et entrepreneurial du Jiangsu pour l’introduction de talents de haut niveau et le projet de planification scientifique et technologique du Jiangsu (BE2015669) ; et par des subventions à H.T. pour la promotion stratégique de la recherche et du développement innovants (S-innovation, 62890004) de l’Agence japonaise pour la science et la technologie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Albumine humaineSigmaA6684Souris
Humaine CK19DakoM088801Souris
Noyaux humainsMilliporeMAB1281Souris
Humaine CK8/18ProgenGP11Cochon d’Inde
CDCP1Biolegend324006Souris
CD90BD559869Souris
CD66BD551479souris
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0,05 % Trypsine-EDTA  ;Gibco25300-054
Toxine diphtériqueSigmaD0564-1MG
Kit ELISA d’albumine humaineBethyl LaboratoriesE88-129
Seringue (1 ml)TerumoSS-01T
32G 1/2" aiguilleTSKPRE-32013
O.C.T.Compound (118 ml)Sakura Finetek Japan4583
Trieur de cellules à grande vitesse MoFloBeckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Références

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