Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.
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Article de méthode
Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Macrophages et les cellules dendritiques (CD) sont des cellules immunitaires innées présentes dans les tissus et les organes lymphoïdes qui jouent un rôle clé dans la défense contre les pathogènes. Cependant, ils sont difficiles à isoler en nombre suffisant pour les étudier en détail, par conséquent, des modèles in vitro ont été développés. Dans les cultures in vitro de macrophages dérivés de la moelle osseuse et les cellules dendritiques sont des méthodes précieuses et bien établies pour les études immunologiques. Ici, un procédé de mise en culture et identifier à la fois les DC et les macrophages à partir d'une seule culture de cellules de moelle osseuse de souris en utilisant la première facteur stimulant les colonies de granulocytes-macrophages de cytokines (GM-CSF) est décrit. Ce protocole est basé sur la procédure établie d' abord développé par Lutz et al. en 1999 pour les PED dérivées de la moelle osseuse. La culture est hétérogène, et MHCII et hyaluronane fluorescéine (FL-HA) sont utilisés pour distinguer les macrophages de CD immatures et matures. Ces GM-CSF dérivé macrophages proVidé une source pratique d'in vitro des macrophages dérivés qui ressemblent étroitement à des macrophages alvéolaires dans les deux phénotype et la fonction.
Introduction
Plusieurs méthodes de culture in vitro ont été décrits pour générer des macrophages d'os dérivées de la moelle (BMDMs) et les CD dérivées de la moelle osseuse (BMDC) en utilisant un ou une combinaison de facteurs de croissance. BMDMs peut être produite en cultivant des cellules de moelle osseuse en utilisant soit le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) ou le GM-CSF 1,2. Pour BMDCs, l'addition d' un ligand de FLT3 dans la culture de moelle osseuse donne lieu à des DC plasmacytoïdes classiques et non-adhérentes (CD11c haut / MHCII haut et CD11c lo, B220 + , respectivement)....
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Protocole
Les souris ont été euthanasiés en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux pour la recherche animale éthique par des procédures approuvées par l'Université de Columbia Animal Care Committee britannique.
1. L'acquisition d'une seule cellule de moelle osseuse Suspension de la souris et de Tibia Fémur
- Allumer une enceinte de sécurité biologique (BSC) 15 min avant le début de la procédure pour purger l'air de l'armoire et de permettre la stabilisation des flux d'air, puis nettoyer / pulvérisation surface BSC avec 70% d'éthanol. Gardez tout aussi stérile que possible pour l'....
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Résultats
Un organigramme résumant les principales étapes de ce procédé est représenté sur la figure 1. La densité et la morphologie de la culture de moelle osseuse à différents moments de la culture sont représentés sur la figure 2. Au jour 1, les cellules sont petites et rares , mais par jour 3, il y a plus de cellules, certains sont plus grandes et que quelques-uns ont commencé à adhérer. Par jour 6 il y a une adhérence définitive et la fraction non adhérente <.......
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous fournissons un procédé pour générer les macrophages et les DC GM-CSF provenant d'une culture de moelle osseuse de souris unique qui est adapté de Lutz et coll. 6. Expression MHCII et FL-HA distingue les CD immatures et les macrophages de liaison dans cette culture (voir la figure 3C), qui a été difficile. Ceci, combiné avec un autre rapport de Helft et al. 19, montre l' hétérogénéité au sein de GM-CSF cultures BMDC induits qui étaie.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.
Remerciements
Ce travail a été financé par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (Grant MOP-119503) et les sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG) du Canada. Le CRSNG appuie également bourses d'été à YD et AA YD est pris en charge par l'Université de la Colombie-Britannique (UBC) avec une bourse de recherche de 4 ans, AA est pris en charge par les IRSC à l'attribution d'une maîtrise de l'étudiant diplômé (BESC-M). Nous remercions Calvin Roskelley d'assistance avec le microscope utilisé pour générer les images de la figure 2. Nous reconnaissons également le soutien des UBC animaux et de débit Installations cy....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cytomètre en flux | BD ; | LSR-II | |
| ; | Leica ; | Centrifugeuse DMI4000 B | |
| ; | Thermo Fisher | ST-40R | |
| Armoire de biosécurité | Nuaire | NU-425-600 | |
| Seringue 1 ml | BD | 309659 | |
| Aiguille de calibre 26 1/2 | BD | 305111 | |
| 50 ml Tube conique ; | Corning | 357070 | de marque Falcon |
| (1,5 ml) | Corning | MCT-150-C | |
| 5 ml tubes en polystyrène à fond rond | Corning | 352052 | |
| Outils de dissection | Outils de science fine ; | *Divers ; | *Ciseaux de dissection, pince Dumont et pince standard ; |
| Hémocytomètre ; | Reichert | 1490 | |
| Stérile 100 mm x 15 mm Boîte de Pétri | Corning | 351029 | *Falcon marque |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21985-023 | |
| Chlorure d’ammonium | BDH | BDH0208-500G | |
| Albumine sérique bovine | Fisher Bioréactifs | BP1600-1 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651-5MG | |
| EDTA | Sigma | E5134-1KG | Acide éthylènediaminetétraacétique |
| Sérum de veau fœtal | Thermo Fisher | 16000-044 | |
| Solution saline équilibrée de Hank’s | Thermo Fisher | 14175-095 ; | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630-080 | 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineacide éthananesulfonique |
| L-Glutamine | Sigma | G8540-100G | |
| LPS Ultrapure | Invivogen | tlrl-3pelps | |
| MEM Solution d’acides aminés non essentiels ; | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Pénicilline/Streptomycine 100x | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Phosphate de potassium monobasique | BDH | BDH0268-500G | |
| Chlorure de potassium | BDH | BDH9258-500G | |
| Recombinant GM-CSF | Peprotech | 315-03-A | |
| Crête de coq Hyaluronate de sodium ; | Sigma | H5388-1G | *Utilisé pour fabriquer de l’acide hyaluronique fluorescéiné |
| RPMI-1640 ; | Thermo Fisher | 21870-076 | Sans pyruvate de sodium, sans glutamine. Supports chauds à 37 ; ° ; C avant utilisation. |
| Chlorure de sodium | Fisher ; | 5271-10 ; ; | |
| Phosphate de sodium dibasique | Sigma | 50876-1Kg | |
| Pyruvate de sodium | Sigma | P5290-100G | |
| Tris(hydroxyméthyl)aminométhane | Fisher Bioréactifs | BP152-5 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Récepteur anti-Fc (non marqué), Supernageant de culture tissulaire | N/A | /A | Clone : 2.4G2 |
| Anti-CD11c PeCy7 | eBioscience | 25-0114-82 | Clone : N418 |
| Anti-Gr-1 efluor450 | eBioscience | 48-5931-82 | Clone : RB6-8C5 |
| Anti-MHCII APC | eBioscience | 17-5321-82 | Clone : M5/114.15.2 |
| Biotinylé Anti-MerTK | Abcam | BAF591 | IgG polyclonale de chèvre |
| Streptavidine PE | eBioscience | 12-4317-87 | |
| Iodure de propidium | Sigma | P4170-25MG | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) | Sigma | D9542-5MG |
Références
- Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation. J Immunol. 178 (8), ....
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Réimpressions et autorisations
