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Article de méthode

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

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DOI :

10.3791/54196

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11 juillet 2016

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1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole rapide et flexible pour un système d’expression in vivo basé sur un seul récepteur de cellules T (TCR). Les vecteurs rétroviraux sont utilisés pour transduire les cellules progénitrices de la moelle osseuse afin d’étudier le développement des lymphocytes T et la fonction d’un seul TCR in vivo comme alternative aux souris transgéniques TCR.

Résumé

la signalisation du récepteur des lymphocytes T (TCR) est essentielle dans le développement et la différenciation des lymphocytes T dans le thymus et la périphérie, respectivement. La vaste gamme de TCR rend difficile l’étude d’une réponse antigénique spécifique. Par conséquent, des souris transgéniques TCR ont été conçues pour étudier la sélection positive et négative dans le thymus ainsi que l’activation, la prolifération et la tolérance des lymphocytes T périphériques. Cependant, relativement peu de souris transgéniques TCR spécifiques à un antigène donné ont été générées. Ainsi, il n’y a pas eu d’études portant sur des TCR d’affinités variables pour le même peptide antigénique. La génération d’une nouvelle lignée transgénique TCR peut prendre six mois ou plus. De plus, tout rétrocroisement spécifique peut prendre six mois supplémentaires. Afin de permettre une génération et un criblage plus rapides de plusieurs TCR, un protocole de transduction rétrovirale de la moelle osseuse a été établi avec l’expression stœchiométrique des chaînes TCRα et TCRβ et la génération de souris rétrogéniques. Chaque souris rétrogénique est essentiellement une souris, ce qui annule pratiquement un effet fondateur, tandis que la durée de génération d’un TCR rétrogénique est réduite de six mois à environ six semaines. Nous présentons ici une alternative rapide et flexible aux souris transgéniques TCR qui peut être exprimée sur n’importe quel fond choisi avec n’importe quel TCR particulier.

Introduction

Récepteur des cellules T (TCR) de répertoire humain et la souris a été estimée à 1 x 10 8 et 2 x 10 6 RLT uniques respectivement 1,2. Cette grande diversité permet aux cellules T de reconnaître une vaste gamme d'épitopes d'antigènes dérivés d'auto-peptides, ainsi que des agents pathogènes présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules présentatrices d'antigènes (APC). Les différences subtiles dans les interactions des RLT uniques avec des complexes peptide-CMH déterminent si une cellule T subira l'apoptose, l'anergie, l'activation, la différenciation, la production de cytokine ou la cytotoxicité. Toutefois, en raison du grand répertoire de TCR, l'analyse de la façon dont un TCR spécifique de répondre à un antigène particulier nécessite l'utilisation de systèmes de TCR unique.

Diverses souris transgéniques TCR ont été générés dans le but d'étudier la fonction d'un seul TCR dans un modèle in vivo 3-9. Cependant, il existe des réserves de TCR des souris transgéniques, y compris lale coût, la durée de temps pour générer une seule souris transgénique et le soi - disant effet fondateur d'insertion du transgène aléatoire dans l' ADN de la lignée germinale 10. Par conséquent, relativement peu de souris transgéniques TCR ont été générées pour tout antigène donné et les implications fonctionnelles de haute affinité et une faible TCR pour le même épitope sont rarement pris en compte. Pour répondre à la nécessité d'une approche rapide à l' écran et d' étudier plusieurs TCR individuellement ou en combinaison, les souris retrogenic ( «rétro» de retrovirus et 'géniques' de transgéniques) ont été utilisés comme une alternative à TCR des souris transgéniques 11-13.

Le motif consensus 2A peptide trouvés dans plusieurs virus sont constitués par un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, dans laquelle le clivage se produit entre la glycine, de la figure 2A et la proline de la figure 2B de l'activité hydrolase de cis, ce qui entraîne le saut du ribosome pendant la traduction 10,14-16. Pour un diagramme détaillé représentant la cleavage des différents peptides 2A (F2A, E2A, T2A et P2A) s'il vous plaît se référer aux références 10 - 12. De cette manière, 2 cistrons (TCR alpha et TCR bêta) peuvent être liés résultant en traduction stoechiométrique dans un seul vecteur. En utilisant cette approche, nous sommes en mesure d'exprimer et de comparer directement plusieurs TCR spécifiques de l' antigène in vivo.

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Protocole

Déclaration d' éthique: Tous les efforts sont faits pour maintenir inconfort ou de stress animal à un minimum lors de l' irradiation et de la queue veine injections. Les souris sont utilisées comme source de cellules dans ces expériences; en tant que tel, il n'y a pas de procédures ou manipulations en dehors de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiés par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale pour confirmer la mort. Cette procédure est conforme aux recommandations du Groupe d'étude sur l'euthanasie de l'American Veterinary Medical Association.

1. Préparer rétrovirale Construct

  1. Sous-clone du récepteur des cellules T (TCR) chaînes alpha et bêta, séparés par un lieur 2A, dans un retroviral 11 vecteur à base de MSCV (exemple, pMIAII ou pMIGII) 11.
    NOTE: Le lieur 2A permet l'expression stoechiométrique et concordant des alpha et bêta de TCR chaînes à partir d'un cadre de lecture ouvert unique. Le vecteur comprend une cassette IRES fluorescent de protéines (ou ametrine GFP) qui est utilisé poursuivre les cellules transduites et l'efficacité de transduction. Pour un protocole détaillé s'il vous plaît voir Holst et al 11.
  2. Isoler l'ADN plasmidique à l'aide obtenue dans le commerce kit de préparation de plasma ou un produit similaire. Utiliser une concentration de travail de 1 - 2 pg ul -1.

2. Génération de rétrovirales Producteur lignées cellulaires

  1. Utiliser un processus en deux étapes pour produire les lignées cellulaires productrices rétrovirales.
    NOTE: Pour un protocole détaillé, s'il vous plaît voir Holst et al 11..
    1. Générer retrovirus par transfection transitoire de cellules 293T avec trois plasmides (pVSVG, PEQ-pAM3 (-E) et vecteur d'intérêt 11) et prendre le surnageant retroviral à partir des cellules 293T à la transduction de la lignée cellulaire productrice GP + E86 écotrope rétroviral.
    2. Isoler le top 40% des cellules exprimant la production GP + E86 fluorescentes par FACS et propager les cellules productrices + E86-GP transdcuced comme source de virus.
      NOTE: La générationproducteurs à titre élevé de est essentielle pour la transduction efficace de cellules de moelle osseuse. Pour un protocole complet s'il vous plaît voir Holst et al. 11

3. retrovirus transfert de cellules souches Gene (Jour -5)

  1. Dégeler et culture 0.5 -1.0 x 10 6 de chaque lignée cellulaire productrice GP + E86 dans DMEM complet à 10% (vol / vol) FBS pour permettre une croissance suffisante pour deux confluentes plaques de 150 mm par jour 0 de ce protocole.
    NOTE: Dégel 0,5 à 1,0 x 10 6 de chaque lignée cellulaire productrice GP + E86 dans une plaque de 10 cm permettra 30 - 50% de confluence au jour 5. Cela permet également de 5 jours de culture en vue d'élargir le GP + E86 lignées cellulaires de production à deux confluentes plaques de 150 mm par jour 0.
    1. Culture de la lignée cellulaire productrice rétrovirale dans un milieu complet de culture de tissu contenant 5% de sérum de veau féta, et la ciprofloxacine (10 pg / ml) afin d'éviter une contamination par des mycoplasmes.
      NOTE: Cesser l'utilisation de la ciprofloxacine lorsque generating surnageant viral pour la transduction de la moelle osseuse. Évitez de trop-croissance de la lignée cellulaire productrice, car cela aura un impact négatif de la moelle osseuse efficacité de transduction.

4. Les souris donneuses Inject avec 5-fluorouracile (5-FU) (Jour -3)

  1. Peser les souris donneur (5 - 12 semaines) pour déterminer la quantité de 5-FU nécessaire. En utilisant des souris de moins de 5 semaines de résultats d'âge faible rendement de la moelle osseuse. Pour assurer l'expression d'un seul TCR, utiliser une souche de souris déficiente des lymphocytes T tels que SCID, RAG ou TCR alpha souris déficientes en tant que donneurs de moelle osseuse.
  2. Travailler dans le tissu de la culture hotte, diluer le stock 5-FU avec du PBS stérile afin d'obtenir une quantité suffisante de 10 mg ml -1 solution de travail de 5-FU pour fournir 0,15 mg 5-FU par gramme de poids corporel.
  3. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille 37 G, intraperitoneale injectent 0,15 mg de 5-FU par gramme de poids corporel par souris donneuse.
    REMARQUE: Utilisez la souris 1 donneur par un destinataire pour démarrer et réglerle nombre de souris donneuses en fonction du rendement de la cellule. Une autre méthode pour le traitement 5-FU pour l'enrichissement et l' isolement de progéniteurs de moelle osseuse est la sélection négative de cellules positives de la lignée , comme décrit dans Viret et al.

5. Bone Marrow Procédure d'extraction (jour 0)

  1. Obtenir des ciseaux de dissection et des pinces pour l'isolement de l'os. Préparer les supports (HBSS additionné de 5% de SVF (v / v)) pour recueillir des os dans un tube conique de 50 ml. Gardez 50 ml conique contenant des médias sur la glace. Euthanasier souris par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale pour confirmer la mort. Pincez patte pour assurer qu'aucun réflexes sont détectés.
  2. Stériliser le site chirurgical et des outils chirurgicaux avec l'éthanol ou le méthanol. Retirez le fémur, le tibia, l'humérus, et la ceinture pelvienne avec soin par la première découpe et sous la ceinture pelvienne. Coupez le long du fémur au tibia. Retirez tous les tissus environnants en utilisant des ciseaux et des pinces pour obtenir des os propres. Garderos hydratés dans HBSS + 5% (volume / volume) de FBS.
  3. Séparer les os en coupant au niveau des articulations, en veillant à couper les deux extrémités de chaque os. Insérer une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue de 10 ml contenant du HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. Appliquer une pression et rincer toute la moelle osseuse à travers une passoire de repos de 70 pm dans un 50 ml conique.
  4. Périodiquement, pousser la moelle osseuse à travers le filtre de 70 um en utilisant le piston d'une seringue de 1 ml ou 3 ml. Rincer le filtre avec du HBSS + 5% (volume / volume) de FBS. Ceci assurera une suspension cellulaire unique qui est exempte de fragments osseux et des tissus. Gardez les cellules stériles en effectuant la procédure dans une hotte stérile.
  5. cellules de moelle osseuse centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.

6. moelle osseuse Culture (jour 0)

  1. Décanter ou aspirer les médias et culot cellulaire de remettre en suspension dans 1 ml de tampon d'ammonium à base de chlorure de lyse des globules rouges (ou équivalent RBC tampon de lyse) par 50 ml tube conique. Après 1 min d'incubation à la chambrela température, la trempe le tampon de lyse des globules rouges en ajoutant 10 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS.
  2. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
  3. Décanter ou aspirer le surnageant et remettre en suspension la moelle osseuse dans 5 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS. Compter les cellules avec une chambre de comptage de Neubauer.
    NOTE: le rendement général devrait être d' environ 5 à 10 x 10 6 cellules par souris; cependant, le rendement peut varier entre les différentes souches de souris.
  4. Les cellules plaque de la moelle osseuse à une densité de 4 x 10 7 cellules par plaque de 150 mm dans 30 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS supplémenté avec de l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml -1) et SCF (50 g ml -1).
    REMARQUE: Utilisez des cytokines fraîchement décongelé-aliquotées. Ne pas utiliser de cytokines qui ont été congelés et décongelés plus d'une fois ou conservés à 4 ° C pendant plus de 2 semaines.
  5. Incuber la moelle osseuse pendant une nuit (environ 24 heures) à 37 ° C avec 5% de CO 2.

7. Rétrovirale Producteur Culture Cellulaire (jour 0)

  1. La plaque 3 x 10 6 cellules productrices rétrovirales par plaque de 150 mm dans 18 ml de DMEM complet à 20% (volume / volume) de FBS.
  2. Incuber des cellules productrices de retrovirus à 37 ° C pendant une nuit. Anticiper une plaque de 150 mm pour 15 millions de cellules de moelle osseuse (environ 2 - 3 des souris donateurs).

8. rétrovirale Surnageant (Jour 1)

  1. Le lendemain (environ 24 heures plus tard), récolter le surnageant retroviral à partir des plaques de producteurs (mis en place à l'étape 7) en élaborant le surnageant retroviral directement sur la plaque de 150 mm avec une seringue de 10 ml et le filtre en utilisant un 0,45 filtre seringue -μm.
  2. Replacez soigneusement le surnageant retroviral enlevé avec 18 ml de DMEM complet frais de 20% (vol / vol) FBS.
  3. Compléter le surnageant retroviral filtré avec de l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) et de bromure d' hexadiméthrine (polybrène) (6 &# 956; g ml -1).
    REMARQUE: le bromure d'hexadiméthrine devrait être fraîche tous les 2 mois pour éviter une baisse de l'efficacité de la transduction rétrovirale.

9. Bone Marrow Harvest (Jour 1)

  1. Après avoir terminé l'étape 8.3, récolter les cellules de la moelle osseuse de l'étape 6.4 et transférer les médias contenant des cellules non-adhérentes dans des tubes de 50 ml stériles.
  2. Laver les plaques vigoureusement avec 10 ml de PBS et de recueillir dans les 50 ml conique de l'étape 9.1. Si nécessaire, répéter l'étape de lavage.
  3. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, transvaser le surnageant, remettre les cellules dans un petit volume (1 - 3 ml) de DMEM complet 20% (vol / vol) de FBS, et compter. Anticiper 50-75% de récupération du jour 0. Resuspendre la moelle osseuse à 1 x 10 6 cellules par 1 ml du surnageant retroviral contenant des cytokines et le bromure de Hexadimethrine.

10. Bone Marrow transduction (Jour 1)

  1. Plaque rétroviral surnageant / os marrow mélange à un volume de 3 ml par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits. Envelopper les plaques dans une pellicule de plastique pour minimiser les échanges gazeux au cours de la centrifugation à l'étape 10.2.
  2. Faites tourner les plaques à six puits emballés à 1000 xg pendant 60 min à 37 ° C.
  3. Après le spin est terminée, retirez la pellicule de plastique et placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C CO 2 pendant 24 heures.

11. rétrovirale Surnageant et transduction (Jour 2)

  1. Après 24 h, de recueillir surnageant viral frais à partir de la lignée cellulaire productrice virale. Filtrer le surnageant retroviral en utilisant une seringue de 10 ml et un filtre à seringue de 0,45 um. Compléter le surnageant filtré rétrovirale avec l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml - 1) et du SCF (50 g ml - 1) et de bromure d' hexadiméthrine (6 g ml -1).
  2. Ensuite, retirez soigneusement avec une pipette ou aspirer les 2 premiers ml de milieu de chaque puits de la plaque de six puits contenant les cellules de la moelle osseuse.
    REMARQUE: Le travail avec soin de ne pas aspirer la moelle osseuse, ce qui est généralement concentrée dans le milieu du puits. En variante, le surnageant a été retiré peut être centrifugé pour récupérer toutes les cellules de la moelle osseuse perdus.
  3. Pour chaque puits dans la moelle osseuse plaque de 6 puits ajouter 3 ml de surnageant contenant des cytokines virales fraîches et le bromure de Hexadimethrine. Envelopper les plaques en plastique, et répéter la transduction de spin à 1000 xg pendant 60 min à 37 ° C. Déballer les plaques et incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant une nuit (environ 24 heures).

12. Ajout de frais supplémenté DMEM (Jour 3)

  1. Après 24 heures, retirer les 2 premiers ml de milieu de chaque puits de la plaque de six puits contenant les cellules de la moelle osseuse, comme dans l'étape 11.2. Remplacer le support enlevé avec du DMEM frais à 20% (volume / volume) de FBS supplémenté avec des concentrations finales de l' IL-3 (20 g ml - 1), IL-6 (50 g ml - 1) et du SCF (50 g ml -1) .
  2. Incuber la moelle osseuseles plaques à 37 ° C incubateur à CO2 pendant 24 h.

13. Récolte transduites moelle osseuse (Jour 4)

  1. Au bout de 24 h, recueillir les cellules de la moelle osseuse provenant des plaques à six puits. Laver les plaques vigoureusement avec du PBS pour éliminer toutes les cellules non-adhérentes.
    1. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C, puis décanter le surnageant.
    2. Remettre en suspension la moelle osseuse dans un petit volume (1 ml) de PBS + 0,5% (volume / volume) de FBS inactivé à la chaleur. Gardez les cellules sur la glace.
  2. Prenez un échantillon de 10 pi de chaque état de la moelle osseuse et de compter les cellules en utilisant une chambre de comptage de Neubauer. En supposant que 1 - 2 donateurs par bénéficiaire, le rendement sera suffisant pour transférer au moins 4 x 10 6 cellules par souris receveuse. Remettre en suspension la moelle osseuse dans un volume suffisant de PBS + 0,5% (volume / volume) de FBS inactivé à la chaleur à injecter 200 - 300 ul par souris.
    1. Injecter au moins 2 x 10 6 cellules avec une efficacité de transductionde 25% (peut injecter jusqu'à 8 x10 6 cellules) par souris par voie intraveineuse.
      REMARQUE: On injecte régulièrement cinq souris receveuses par deux plaques de cellules de moelle osseuse à 6 puits. Si le rendement est nettement plus faible, plus les souris donneuses doivent être utilisées jusqu'à ce que le nombre de moelle osseuse suffisante peut être obtenue. Afin de parvenir à une reconstitution optimale, au moins 5 x 10 5 transduction (fluorescente positive) doit être injecté dans chaque destinataire.
  3. Avec un micro - pipette, prélever un échantillon de 10 pi de chaque état ​​de la moelle osseuse et d' analyser l' efficacité de transduction par cytométrie de flux basé sur l' expression du marqueur fluorescent (figure 1A) 11.
    NOTE: En règle générale, le pourcentage de cellules positives fluorescentes est comprise entre 25% et 70%, en fonction de la construction et le titre retroviral. Le nombre de cellules de moelle osseuse transduites nécessaires pour reconstituer une souris sublétales irradier peut varier en fonction de l'efficacité de transduction. Plus le tranl'efficacité sduction, les cellules de la moelle osseuse plus nécessaire et, inversement, plus l'efficacité de transduction de la moelle osseuse, la diminution du nombre de cellules nécessaires pour la reconstitution. L'efficacité de transduction inférieure à 25% est sous-optimale et peut conduire à une reconstitution insuffisante et la survie. Afin d'assurer la récupération de la moelle osseuse optimale et l'efficacité de la transduction, utiliser les médias et les cytokines de culture de tissus fraîchement préparés. Lors de l' expression d' un nouveau TCR utilisant le système retrogenic, la sélection de ce TCR in vivo est inconnu. En fonction de chaque individu TCR à affinité, la sélection du TCR dans le thymus et l' expression périphérique de lymphocytes T variera 17.

14. Souris Irradiation, moelle osseuse Injection et des Soins

  1. Irradiation des souris le jour avant l'injection de moelle osseuse (même jour que l'étape 13). Utilisez les doses suivantes: C57BL / 6 souris (et d' autres souches de type sauvage), 900 rads; Rag1 - / - souris, 500 rads, des souris SCID, 300 rads).
    1. souris Lieu bénéficiaires sur amoxicilline (50 mg / kg / jour) ou un autre traitement antibiotique de l'eau avant l'irradiation, et de garder des antibiotiques pour les deux premières semaines après l'injection de moelle osseuse.
      NOTE: La dose d'irradiation optimale peut être déterminée de manière empirique.
  2. Pour l'injection, charger les cellules de l'étape 13.1 dans une seringue de 1 ml en utilisant des aiguilles émoussées immédiatement avant injection, puis changer l'aiguille de calibre 27 pour l'injection, expulser l'air pour éviter une embolie gazeuse. Des souris thermique sous une lampe chauffante et injecter 0,2 ml de moelle osseuse de souris par voie intraveineuse.
    REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sont assis dans la seringue pour toute longueur de temps ou les cellules se déposent.
  3. Surveiller les souris chaque semaine pour veiller à ce qu'ils restent en bonne santé.
  4. Après 5 - 6 semaines saigner les souris pour vérifier la reconstitution sur la base de la GFP + / amétrine + et TCR co-expression (figure 1B) 11.

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Résultats

Os efficacité de transduction de la moelle est vérifiée à l' étape 13.3 du protocole avant la moelle osseuse est injecté dans la veine caudale iv Dans le représentant de la moelle osseuse transduction figure (figure 1A), environ 10 pi de l'os récolté osseuse a été ajouté à 100 pi de PBS et analysés pour l'expression amétrine. En général, le pourcentage de cellules positives fluorescentes est comprise entre 25% et 70%, en fonction de la construction et le titr...

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Discussion

Dans le protocole, nous détaillons plusieurs étapes essentielles pour assurer la santé de la moelle osseuse optimale, l'efficacité de la transduction et la reconstitution. Première étape critique est la génération et le bon entretien des cellules productrices virale GP + E86. Utiliser des lignées de cellules productrices de passages précoces et maintenir à 80% de confluence ou plus bas avant l'utilisation. Lors de cellules productrices virale GP + E86 frais, assurer que les cellules 293T sont passage précoce et ...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (5K22A1119151-01 et 1R56DK104903-01) à MLB, Programme du Centre de recherche du diabète (P30-de DK079638) au BCM Pilot / faisabilité, la FRDJ 1-FAC-2014-243-AN CSA, ADA 1-15-JF-07, AAI Carrières in Immunology Fellowship à MB, et Le Robert et la Fondation Janice McNair.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM, haute teneur en glucose + glutamineCorning Cellgro10-013-CVModification de Dulbecco du milieu d’Eagle avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium
FBSAtlanta BiologicalS11550
Trypsin-VerseneLonza17-161F
0,45 µ ; Filtre à seringue ThermoScientific194-2545
polybrèneSigmaH9268-10GStérile Filtré en dH2O
Ciprofloxacine  ;VWRAAJ61970-06
5-fluorouracile (5-FU)VWRAAA13456-06
Pyruvate de sodiumCorning Cellgro25-000-CI
MEM Acides aminés non essentielsCorning Cellgro25-025-CI
HEPES 1 M solutionCorning Cellgro25-060-CI
2-MercaptoethanolGibco de Life Technologies21985-023
Pen/StreptCorning Cellgro30-002-CI
L-glutamineCorning Cellgro25-005-CI
Boîtes de culture tissulaire 150 mmGreiner Bio-one639160
Tisue culture plaque plate 6 puitsGreiner Bio-one657160
70 µ ; crépines à cellules en nylon Falcon352350
Souris IL-3InvitrogenPMC0033
IL-6 HumainInvitrogen  ;
Facteur de cellules souches de sourisInvitrogenPMC2113L
10x PBSCorning Cellgro46-D13-CM
Tampon HANKSCorning Cellgro21020147
BD 10 ml SeringueBD300912
BD 1 ml SeringueBD309659
27 G x 1/2 BD Aiguille de glissement de précisionBD
Aiguille de glissement de précision 30 g x 1/2 BD305106
PHC0063305109

Références

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