Nous décrivons une méthode pour produire un modèle animal de fibrose hépatique chez le rat, et évaluons le degré de fibrose par examen histologique du foie. Le modèle peut être utilisé pour étudier le développement d’une maladie du foie ainsi que pour tester l’efficacité d’agents anti-fibrotiques potentiels.
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Article de méthode
Le diméthylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Modèle chez le rat
Dans cet article
Résumé
Résumé
Quatre à six semaines vieux rats mâles Wistar ont été utilisés pour produire des modèles animaux de fibrose du foie. Le processus nécessite quatre semaines d'administration de 10 mg / kg diméthylnitrosamine (DMN), étant donné intrapéritonéale pendant trois jours consécutifs par semaine. injections intra-péritonéales ont été effectuées dans la hotte comme DMN est un hépatotoxine et cancérigène connu. Ce modèle présente plusieurs avantages. Tout d'abord, les changements du foie peuvent être étudiés de manière séquentielle ou à des étapes particulières d'intérêt. Deuxièmement, le stade de la maladie du foie peut être contrôlée par la mesure de sérum alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) enzymes. En troisième lieu, la gravité des dommages au foie à différents stades peut être confirmé par le sacrifice des animaux à des moments désignés, suivie d'un examen histologique des tissus du foie Trichome tachés de Masson. Après quatre semaines de DMN dosage, le score typique de la fibrose est de 5 à 6 sur l'échelle Ishak. Le modèle peut être reproduit de manière cohérente et a étélargement utilisé pour évaluer l'efficacité d'agents anti-fibrotiques potentiels.
Introduction
DMN est une toxine spécifique du foie puissant. Son métabolisme, la distribution tissulaire, et la capacité de causer des blessures aux foies de rats a été signalée par Magee 1, et le mécanisme des dommages des hépatocytes et la mort cellulaire par apoptose a été décrit par Pritchard et Butler 2. L' administration intermittente de ce composé a été rapporté pour induire une fibrose du foie chez les chiens et les rats 3,4.
Les mécanismes et des changements morphologiques de la fibrose hépatique ont été largement étudiés en utilisant ce modèle. Dans les premières études utilisant le rat, le traitement de 3 semaines avec DMN produit une nécrose hémorragique centro - lobulaire suivie d' une cirrhose micronodulaire sans stéatose 5. Il a été montré que la fibrose précoce, le collagène formé est de plus réticulé de type III étant plus important que le type I 6. En commun avec d'autres causes, des changements fibrotiques induite DMN-ont été associés à une augmentation des cellules Kupffer; les macrophages hépatiques qui résident in sinusoïdes. Ces cellules se transforment en myofibroblastes et produisent des quantités excessives de matrice extracellulaire qui est le principal problème de la fibrose 7.
En ce qui concerne la signalisation cellulaire, Nakamura et al. , Ont démontré que le TGF-β joue un rôle critique dans la progression de la fibrose hépatique 8. Ils ont utilisé un adénovirus exprimant un récepteur de TGF-β tronqué de type II, d'inhiber spécifiquement la signalisation du TGF-β. La fibrose hépatique chez ces rats a été interrompue de manière spectaculaire au cours du traitement de DMN par rapport aux groupes témoins. D' autres études ont confirmé que la suppression du TGF-β conduit à la réduction du foie le développement de la fibrose 9,10. Le modèle a également été utilisé dans une étude globale de profilage génétique pour identifier d' autres marqueurs de fibrose et de protéines qui pourraient être utilisés comme cibles de médicaments pour la thérapie anti-fibrotique 11.
D'autres agents chimiques utilisés pour induire une fibrose du foie comprennent thioacétamide (TAA) et ctétrachlorure arbon (CCl 4). TAA a été utilisé pour la première chez les rats et plus tard chez les souris 12. Les avantages de ce modèle comprennent: la facilité d'administration de produits chimiques dans l'eau, la reproductibilité du modèle avec la cirrhose micronodulaire caractéristique et les modifications biochimiques de boisson. Les inconvénients comprennent: la période de 3 mois pour la fibrose hépatique de longue date pour développer et le manque de compréhension du mécanisme moléculaire pour l'induction de la fibrose hépatique. Quant à CCl 4, son utilisation a diminué pour les raisons suivantes: il ne reproduit pas la maladie de foie humain, a des effets nocifs sur la couche d'ozone, provoque la douleur et la détresse des animaux, est très toxique pour les humains et nécessite des précautions supplémentaires dans sa manipulation et élimination 13,14.
Prolongée des voies biliaires obstruction (par une intervention chirurgicale) comme modèle expérimental pour la cirrhose du foie a été rapporté par Kountouras et al. 15. Cette méthode est non toxique pour les humains et les animaux. Houtefois, le temps nécessaire pour que la fibrose du foie pour développer varie. Un examen de 30 rapports par Marques et al. 16, a constaté qu'il a fallu de sept jours à quatre semaines après la chirurgie de la fibrose du foie à se développer. Les changements pathologiques décrites ressemblent à ceux de la fibrose biliaire chronique humaine et le modèle serait plus adapté pour les chercheurs intéressés dans ce domaine.
En résumé, l'administration intermittente d'une dose constante de DMN chez le rat de plus de 4 semaines produit une fibrose hépatique qui imite la maladie humaine. Rats traités montrent le développement progressif des lésions du foie et la fibrose parenchymateuse 4,17. Progression de la maladie et la gravité peuvent être contrôlés par l' intermédiaire d' échantillons de sang ou sacrifice des animaux à des moments spécifiques et l'effet est hautement reproductible 18. Ainsi , le modèle a été largement utilisé pour étudier les mécanismes de la fibrose hépatique et de la cirrhose, ainsi que pour cribler des agents potentiels anti-fibrotiques 10,19,20.
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Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux et l'utilisation de l'École des sciences appliquées, Temasek Polytechnic.
1. Préparation du DMN
- Pipette 200 pi de DMN (1 g / ml de solution mère) et ajouter 19,8 ml de PBS pour préparer une solution de DMN 10 mg / ml pour l'injection.
Remarque: DMN est cancérogène. Utilisez une hotte pour préparer le DMN et effectuer les injections animales.
2. Injection intrapéritonéale de DMN
- Utilisez des rats mâles Wistar d'un poids moyen de 150-200 g. Acclimate rats pour 4 - 7 jours avant le début de l'expérience.
- Maintenir les rats à la température ambiante de 22 ± 1 ° C, avec 12 heures de lumière et 12 heures de cycles sombres. Fournir chow de rat et de l' eau ad libitum.
- Mesurer les prises d'eau et de nourriture quotidienne. Mesurer le poids corporel hebdomadaire.
- Calculer la quantité de DMN pour chaque rat en fonction de la dose de 10 mg / kg de poids corporel. Utiliser une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 25 to tirer le volume calculé de solution de DMN dans la seringue.
- Restreindre le rat pour l' injection intrapéritonéale 21.
- Avec le rat correctement retenu, introduire l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen, tirer sur le piston de la seringue (rien ne doit être aspiré) pour vérifier le placement correct de l'aiguille dans l'espace abdominale et injecter lentement la solution de DMN.
- Lorsque la dose de DMN a été administré, retirer lentement l'aiguille et la jeter dans la poubelle d'objets tranchants.
- Effectuer les injections intra-péritonéales de DMN pendant 3 jours consécutifs par semaine pendant 4 semaines. Administrer les injections à la même heure chaque jour. Re-calculer la dose sur la base du poids corporel au début de chaque semaine des injections.
- Prélever le sang de la veine hebdomadaire de queue pour mesurer les paramètres biochimiques: alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) 22.
- Mesure ALT sérique et AST à l'aide d'un vétérinaire commercialAnalyseur de chimie Test.
3. Examen brut et récolte du foie
- Euthanize les rats par injection intraperitoneale de pentobarbital à la dose de 100 mg / kg de poids corporel. Veiller à la mort en vérifiant l'absence de battements cardiaques.
- Préparer la post - mortem et d' évaluer l'état de l'animal tel que décrit par Parkinson et al. 23 La place des rats morts sur une planche à dissection en décubitus dorsal avec l'abdomen vers le haut.
- Désinfecter et humidifier la peau avec 70% d'éthanol.
- Avec des ciseaux, incise la peau toute la longueur de la partie ventrale de l'anus vers le menton, et reflètent la peau. Avec les ciseaux, inciser la paroi abdominale de l'anus vers le cartilage xiphoïde, pour exposer les viscères abdominaux.
- Examiner les organes abdominaux in situ pour vérifier toutes les anomalies. Notez tous les changements dans la couleur, la taille, l'emplacement des organes et la présence de liquide dans la cavité péritonéale. Examinerla cohérence des organes et noter la présence de toutes les odeurs.
- Avec des ciseaux et des pinces, disséquer entièrement libre du foie de ses ligaments et des pièces jointes.
- Commencez par le hile où elle est attachée au diaphragme et à travailler pour libérer tous les lobes du foie de pièces jointes. Découpez soigneusement tous les ligaments et les vaisseaux sanguins.
- Transférer le foie sur une boîte de Pétri et peser le foie.
- L'utilisation d'un scalpel, couper 2 - 5 mm sections épaisses de lobes du foie. Par souci de cohérence, toujours prendre des échantillons provenant du même lobe du foie. Prenez une cale d' environ 5 mm de diamètre dans l' épaisseur, du lobe latéral droit 24 d' environ 1 cm du bord de la place lobe.Immediately dans 10% de formaline tamponnée pour la fixation. Vérifiez que le tissu et le volume de formaline est de 1:10 ou plus.
- Récolte et geler immédiatement les parties (en utilisant de l'azote liquide) des lobes du foie à ce stade si nécessaire pour d'autres études. En ce qui concerne (3.8), un échantillon du même lobe de foie de cohérence.
4. Traitement, Embedding et Sectionnement du foie
- Fixer les échantillons de foie dans 10% de formaline tamponnée pour un minimum de 24 heures.
- Après fixation, couper le foie, placer dans des cassettes et de les charger dans le panier du processeur de tissu automatisé.
- Placez le panier avec des cassettes dans la première station qui contient 10% de formol tamponné. Assurer les cassettes sont entièrement submergés. Ils peuvent rester dans cette chambre pour un maximum de 12 heures jusqu'à ce que le cycle commence.
- Programmer le processeur de tissus pour faire pivoter les cassettes pendant 1 h chacune, à travers des postes successifs contenant les solutions suivantes: l'éthanol à des concentrations de 50%, 70%, 90%, 100% (2 stations), du xylène (2 stations) et de la paraffine liquide ( 2 stations).
- Transférer les échantillons de foie dans le bain de la station d'enrobage de cire. Faire en sorte que la machine d'enrobage est mis en marche au moins une heure avant.
- Utilisation des pinces pré-chauffé (65 ° C), retirer chaque cassette du wbain de hache et la place sur la plaque chaude (65 ° C) de la machine d'enrobage. Distribuer une quantité suffisante de la paraffine liquide dans le moule de base en acier inoxydable (préchauffée à 65 ° C) jusqu'à la moitié. Transférer la section du foie, de la cassette dans le moule. Que le spécimen est placé avec la surface de coupe (à examiner au microscope) à plat sur le fond du moule.
- Remplissez complètement le moule avec de la paraffine liquide, monter la cassette vide sur le dessus et placez le moule sur la plaque C 4 ° de la machine d'enrobage à refroidir pendant au moins 30 min.
- Vérifiez que la cire a refroidi et solidifié, et retirer le bloc de paraffine du moule. Le bloc devrait sortir facilement et ne colle pas ou se fissurer. Si cela se produit, faire fondre le bloc et répétez cette étape. Le bloc de paraffine peut être sectionné une fois qu'il se solidifie. Les blocs peuvent être stockés à température ambiante pendant de nombreuses années.
- Placer le bloc de paraffine dans le microtome et la section de 10 um d'épaisseur jusqu'à ce que la couche de cireest éliminé suffisamment pour que le tissu hépatique incorporé soit visible.
- Changez le réglage sur le microtome pour couper à 5 um d'épaisseur. En utilisant des pinces, ramasser une section bien coupé en le tenant par le bord et flotter attentivement la section dans le bain d'eau à une température de 40 ° C.
- Placez délicatement une lame de verre propre sous la section flottante et soulevez-le sur la surface de la lame de verre. Placer la lame sur une lame chaude à 37 ° C pendant une nuit.
5. Masson Trichrome Coloration
- Avant d'appliquer les taches, traiter les lames pour enlever la cire et réhydrater les tissus comme suit:
- Immerger les sections dans du xylène pendant 5 min. Répéter 2x.
- Immerger les sections dans 100% d'éthanol pendant 3 min. Répéter 1x.
- Immerger les sections pendant 1 minute dans chacune des solutions suivantes d'éthanol: 90%, 80% et 70%.
- Rincer la lame sous l'eau du robinet pour éliminer tout éthanol existant sur la diapositive.
- Immerger les lames en fer hématoxyline pendant 10 minutes pour colorer le noyau.
- Rincer les lames avec de l'eau pour éliminer l'excès de colorant de la diapositive.
- Immerger les lames dans Biebrich Scarlet-fuchsine acide pendant 2 minutes pour colorer le cytoplasme.
- Rincer les lames avec de l'eau.
- Placer les lames dans / solution d'acide phosphomolybdique Phosphotungstic pendant 10 min pour favoriser l'absorption du Aniline bleu. Changer la solution d'acide phosphotungstique / phosphomolybdique après 2 tours d'utilisation.
- Placer les lames dans une solution de bleu d'aniline pendant 10 minutes pour colorer les fibres de collagène.
- Rincer l'excès tache avec de l'eau et placer les lames dans une solution d'acide acétique à 1% pendant 1 min pour permettre une différenciation au lieu de rendre la couleur de la lame plus délicate et transparente.
- Rincer les lames avec de l'eau et passez à déshydrater les coupes de tissus. Les étapes de déshydratation sont les suivantes:
- Immerger les lames successivement pendant 10 secondes à chaque fois, dans la conce suivantentrations d'éthanol: 70%, 80%, 95% et 100%.
- Immerger les lames pendant 30 secondes dans 100% d'éthanol. Répéter 1x.
- Rincer les lames par 3 stations de xylène pendant 5 minutes chaque éthanol pour éliminer.
- Monter une lamelle de verre sur l'échantillon avec les médias de montage (par exemple, DPX milieu de montage) et laisser sécher.
Note: DPX est une résine synthétique qui sèche rapidement, préserve la tache et protège la section de tissu.
6. Fibrose Scoring sur Trichome Stained Sections Masson de foie
- Avoir un pathologiste vétérinaire évaluer la gravité de la fibrose selon le score de fibrose 25. Il serait optimal si le score de fibrose se fait par deux ou trois pathologistes indépendamment d'une manière aveugle. Dans un tel scénario, obtenir un score final après discussion et l'examen du groupe pour trier les différences de notation.
| But | La description |
| 0 | pas de fibrose |
| 1 | l'expansion fibreuses de certaines zones du portail, avec ou sans court septa fibreux |
| 2 | l'expansion fibreuses de la plupart des zones de portail, avec ou sans court septa fibreux |
| 3 | l'expansion fibreuses de la plupart des zones de portail, portail occasionnel au portail (PP) de pontage |
| 4 | l'expansion fibreuse des zones de portail avec pont marqué (portail au portail (PP), ainsi que portail central (PC) |
| 5 | Marqué pontage (PP et / ou PC) avec des nodules occasionnels (cirrhose incomplète) |
| 6 | Cirrhose, probable ou certain |
Tableau 1: Fibrosis Score utilisé pour la lecture Trichome Stained foie Sections du Masson 25.
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Résultats
les rats traités de DMN perdre du poids et deviennent moins vigoureux avec poil hérissé. Il y a une perte significative de poids corporel moyen de DMN rats traités; première détectable après 2 semaines de traitement DMN et cette différence reste par semaine 3 et 4 , après traitement de DMN (figure 1a). Comme les rats reçoivent DMN au fil des semaines successives, des dommages au foie fait qu'il devient plus petit. L'indice du foie; qui est le pour cent du poids d...
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Discussion
Nous avons décrit un procédé pour rendre un modèle animal de la fibrose hépatique et d'évaluer la gravité de la fibrose hépatique. Il est important de délivrer la dose correcte de DMN et respecter le calendrier des injections intraperitoneales hebdomadaires. Comme l'expérience progresse, il est essentiel de peser les rats et recalculer la dose au début de chaque semaine des injections de DMN. Gardez à l'esprit que DMN est toxique et doit être manipulé dans l'armoire de fumées. Nous effectuons les injecti...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Les auteurs remercient le ministère de l’Éducation de Singapour pour son soutien financier, numéro de subvention MOE2010-IF-1-025.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Diméthylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichomes colorants Aniline | |||
| Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acide Fuschin | Microscopie électronique Sciences | RT42685 | |
| Microscopie | électronique rouge écarlate | #26905 | |
| Acide phosphotungstique hydraté | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Acide phosphomolybdique hydraté | Sigma SG | 221856-25G | |
| Hématoxilyne de fer de Weigert | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Support de montage | Merck | HX066873 | |
| Processeur de tissus | Leica | Leica TP 1020 | |
| Machine d’enrobage | Sakura | ; Sakura Tissue Tek TEC5 Système | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Analyseur de test vétérinaire | Idexx | Vet Test 8008 |
Références
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Réimpressions et autorisations
