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Summary

L'étude des interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes est un domaine important de la recherche biologique. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour mesurer la translocation effecteur par Coxiella burnetii lors de l' inactivation de gène siRNA en utilisant un substrat BlaM.

Abstract

Coxiella burnetii, l'agent causal de la fièvre Q, est un pathogène intracellulaire qui repose sur un type IV Dot / Icm Système Sécrétion d'établir une niche réplicative. Une cohorte de effecteurs sont transloqué à travers ce système dans la cellule hôte pour manipuler les processus d'accueil et de permettre l'établissement d'une vacuole lysosome dérivé unique pour la réplication. La méthode présentée ici implique la combinaison de deux techniques bien établies: silençage génique spécifique en utilisant le siRNA et la mesure de la translocation d'effecteur au moyen d'un substrat à base de FRET qui repose sur l'activité β-lactamase. L'application de ces deux approches, nous pouvons commencer à comprendre le rôle des facteurs de l'hôte en fonction du système de sécrétion bactérienne et effecteur translocation. Dans cette étude, nous avons examiné le rôle de RAB5A et Rab7A, à la fois des régulateurs importants de la voie de trafic endocytose. On démontre que l'inhibition de l'expression d'un des deux protéines à une diminution effecteur translocation efficacité. Ces méthodes peuvent être facilement modifiés pour examiner d'autres pathogènes intracellulaires et extracellulaires qui utilisent également des systèmes de sécrétion. De cette manière, une image globale des facteurs de l'hôte impliqués dans la translocation bactérienne effecteur peut être révélée.

Introduction

Coxiella burnetii est un pathogène intracellulaire unique qui provoque la zoonotique infection humaine fièvre Q. Cette maladie est associée à un large éventail de présentations cliniques s'étendant de séroconversion asymptomatique à une infection chronique potentiellement mortelle qui se manifeste souvent endocardite ans après l' exposition ^1. L'infection humaine se produit principalement par l'inhalation d'aérosols contaminés avec ruminants le principal réservoir d'infection, en particulier, les vaches laitières, les moutons et les chèvres. Bien que l' infection Coxiella chez ces animaux est généralement subclinique, l'infection peut déclencher l' avortement et la charge bactérienne considérable dans le fluide de l' accouchement et le placenta peut contaminer l'environnement local ^1. Un exemple de l'énorme fardeau telle contamination peut avoir sur la santé publique et l'industrie de l' agriculture a récemment été observée dans l'épidémie de fièvre Q qui a eu lieu aux Pays – Bas ^2. Entre 2007 et2010, plus de 4000 cas humains de fièvre Q ont été diagnostiqués et cette épidémie était liée à une contamination importante des exploitations caprines ^3. En outre, Coxiella est une arme biologique potentielle, classé par les US Centers for Disease Control and Prevention, en raison de la stabilité de l' environnement des bactéries et une faible dose infectieuse nécessaire pour provoquer la morbidité et de la mortalité ⁴ sévère.

Coxiella existe en deux phases: Phase I organismes, isolées à partir de sources naturelles, sont extrêmement virulents et les organismes de la Phase II sont fortement atténués in vivo. Par exemple, après quelques passages in vitro dans des Coxiella burnetii phase I Nine Mile organismes, les bactéries de phase II ont été produits qui contiennent une délétion chromosomique irréversible résultant en un lipopolysaccharide tronqué (LPS) ^5. Cette souche, C. burnetii NMII, est phénotypiquement similaire à la phase I dans les modèles de culture de tissus et fournit un mode plus sûrl pour les chercheurs pour étudier la pathogenèse Coxiella dans les laboratoires ^5. Au cours des dernières années , plusieurs avancées ont rapidement fait progresser le domaine de la génétique Coxiella. Plus particulièrement, le développement des médias axénique (acidifié milieu de cystéine citrate – ACCM-2) a permis la croissance sans cellule de Coxiella à la fois liquide et sur ​​des supports solides ^6,7. Cela a entraîné des améliorations directes des outils génétiques disponibles pour Coxiella , y compris un système d'expression génique inductible, des vecteurs navettes et des systèmes de transposon aléatoires ^8-11. Plus récemment, deux méthodes d'inactivation du gène ciblé ont également été mis au point, ouvrant la voie à l' examen des gènes candidats de virulence spécifiques ^12.

Après intériorisation par les macrophages alvéolaires, Coxiella réplique à un nombre élevé dans un compartiment lié à la membrane appelée Coxiella- contenant des vacuoles (CCV). Le CCV nécessite le trafic d'endocytose hôte eendosomes précoces et tardives rugueux jusqu'à ce qu'il arrive à maturité dans un organite lysosome dérivé ^13. Tout au long de ce processus, le CCV acquiert des facteurs hôtes qui soit apparaissent transitoirement ou restent associés à la vacuole, y compris, mais sans s'y limiter, Rab5, Rab7, CD63 et ^{LAMP-13 à 15 janvier.} Réplication de Coxiella dans les cellules hôtes est entièrement dépendante d' un type Dot / Icm système entièrement fonctionnel IVB Sécrétion (T4SS) ^8,16,17. Ce système de sécrétion est une structure multi-protéique héréditairement liés aux systèmes de conjugaison et englobe à la fois les membranes bactériennes et vacuolaires pour délivrer des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytoplasme de l' hôte ^18. Le Coxiella T4SS est fonctionnellement très similaire au type IVB Dot / Icm système Sécrétion bien caractérisé de Legionella pneumophila ^19,20. Fait intéressant, l' activation de l'effecteur translocation T4SS et ultérieure ne se produit pas jusqu'à ce que Coxiella atteint le lysosome dérivé acideorganite, environ 8 heures post-infection ^17,21. À ce jour, plus de 130 effecteurs Dot / Icm ont été identifiés ^9,17,22-24. Beaucoup de ces effecteurs jouent probablement un rôle important lors de la réplication de Coxiella dans les cellules hôtes; cependant, seuls quelques effecteurs ont été caractérisées fonctionnellement ^25-29.

Dans cette étude , nous utilisons une translocation dosage par fluorescence à base qui repose sur le clivage du substrat FRET CCF2-AM (ci – après dénommé le substrat BlaM) via l' activité β-lactamase dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 1). Le gène d'intérêt est fusionnée à TEM-1 β-lactamase (BlaM) sur un plasmide rapporteur qui permet une expression constitutive. Le substrat BlaM est composé de deux fluorophores (coumarine et fluorescéine) qui forment une paire FRET. L'excitation des résultats de la coumarine dans la case de la fluorescéine et le vert émission de fluorescence en l'absence d'effecteur translocation; cependant, si le BlaM effecteur protéine de fusion subit une translocation dans le cytoplasme de l'hôte, la résultante β-lactamase activité clive la bague β-lactame du substrat BlaM, séparant la paire de FRET produisant une émission de fluorescence bleue après excitation. Ce test de translocation a été éprouvée comme une approche pour identifier les protéines effectrices à partir d' une gamme de différentes bactéries intracellulaires et extracellulaires, y compris C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, entéropathogènes E. coli, Salmonella et Brucella ^17,30-35.

Pour déterminer le rôle des facteurs de l' hôte spécifiques sur Coxiella effecteur translocation nous utilisons une méthode bien établie pour l' inactivation de gène connu comme l' interférence ARN, en particulier les petits ARN interférents (siRNA). Initialement identifié dans Caenorhabditis elegans, l' interférence ARN est un processus cellulaire endogène conservé utilisé pour defe innéense contre les virus, ainsi que régulation des gènes ^36,37. Après la liaison de siRNA spécifique de la séquence, la dégradation de l' ARNm se produit à travers RISC (complexe taire induite par l' ARN) conduisant à l' inactivation de gène spécifique ou knockdown ^38. Dans cette étude, l'ARNsi a été utilisé pour cibler deux protéines de l'hôte, et RAB5A Rab7A, qui sont des régulateurs importants de la voie d'endocytose. L'impact du silence RAB5A et Rab7A sur effecteur translocation a été établie à l' aide C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 a été choisi car il a été montré précédemment translocation par le système de sécrétion de point / Icm de Coxiella ^17.

Utilisant à la fois siRNA silençage génique et le test de translocation fluorescencebased décrit ici, nous commençons à établir un rôle de facteurs de l' hôte dans la translocation des protéines effectrices par Coxiella. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de bactéries intracellulaires et extracellulaires qui possèdent secretio similairesLes systèmes responsables de la translocation de protéines effectrices n.

Protocol

Remarque: Toutes les procédures impliquant la croissance ou la manipulation de Coxiella burnetii RSA439 NMII doivent être effectuées dans un niveau de confinement physique 2 laboratoire et dans une enceinte de sécurité biologique dans le respect des directives locales. Un diagramme schématique de la transfection et l' analyse de la translocation flux inverse de celui décrit ci – dessous est représentée sur la figure 2.

1. Préparation de C. burnetii Culture Exprimer CBU0077 Fused à la ß-lactamase (pBlaM-CBU0077) (JOUR 1)

1. Préparer 1X ACCM-2 ^6:
   1. Combiner les composants répertoriés dans le tableau 1. Ajuster le pH à 4,75 avec NaOH 6 M et stériliser par filtration (ne pas l' autoclave). ACCM-2 est stable pendant environ trois semaines stockées à 4 ° C.
2. Générer C. les stocks burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Infectent des cellules HeLa 229 ° C avec souche burnetii portant pBlaM-CBU0077 et le passage jusqu'à ce grand vacuoles sont observées dans la majorité des cellules.
      1. Cultivez le C. burnetii souche portant pBlaM-CBU0077 dans 20 ml ACCM-2 contenant de 3 pg / ml de chloramphenicol dans un tissu de 75 ^cm2 flacon de culture avec bouchon à évent pendant 7 jours à 37 ° C dans 5% de _CO2, 2,5% d' O _2.
      2. Centrifuger le C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 à 15000 × g pendant 15 min à température ambiante.
      3. Remettre en suspension le culot dans 20 ml de DMEM + 10% de sérum de foetus de veau (FCS) + 3 ug / ml de chloramphenicol (milieu d'entretien). Retirez le support à partir d' un 50% confluentes 75 cm ² flacon de cellules HeLa 229. Ajouter re-suspendu C. burnetii à cellules HeLa 229. Incuber pendant 2 jours à 37 ° C dans 5% de _CO2 pour permettre à l' infection de cellules HeLa 229 à établir.
      4. Cellules Divisé en 175 cm ² culture tissulaire flacon.
         1. Retirez le support du 75 cm ² flacon et laver la monocouche deux fois avec 10 ml de PBS préchauffé.
         2. Ajouter 1 ml of 0,05% de trypsine-EDTA solution et de placer les cellules à 37 ° C + 5% de CO ₂ pendant 3 – 5 minutes pour détacher les cellules.
         3. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu d'entretien. Ajouter 2 ml de cellules remises en suspension dans un 175 cm ² flacon contenant 38 ml de milieu de maintenance.
         4. Incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant 3 – 5 jours jusqu'à 100% de confluence est atteinte et on observe de grandes vacuoles.
   2. Recueillir le surnageant de 175 cm ² flacon, ajouter 10 ml _dH2Û afin de couvrir les infectés cellules HeLa 229 et incuber pendant 15 min pour lyser les cellules infectées.
   3. Combiner le surnageant et les cellules lysées et le culot à 15 000 x g pendant 15 min à température ambiante.
   4. Re-suspendre le culot dans 10 ml dH ₂ O. lyser les cellules en faisant passer de façon répétée en outre la remise en suspension à travers une aiguille 23G fixée à une seringue de 10 ml, au moins 20 fois. Pellet à 500 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires.
   <li> Retirez et le surnageant du culot à 15000 × g pendant 15 min à température ambiante pour recueillir C. burnetii.
   5. Re-suspendre C. burnetii dans DMEM + 10% de FCS et quantifier nombre de bactéries que par 4. Diluer à 1 × 10 ⁹ génomes / ml en utilisant DMEM + 10% FCS + 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquote de 50 stocks de pi dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -80 ° C.
3. Inoculer 10 ml de pré-chauffé ACCM-2 contenant 3 pg / ml de chloramphenicol avec 20 pi de C. souche burnetii pBlaM-CBU0077 ¹⁷ ( à partir des stocks générés en 1.2 stocké à -80 ° C) dans un 25 cm ² tissus flacon de culture avec bouchon à évent. Cultiver une culture bactérienne pendant 7 jours à 37 ° C dans 5% de _CO2, 2,5% d' O _2.

2. Inverse transfection de siRNA et Semis de cellules HeLa 229 (JOUR 4)

1. Lors de l'utilisation du expérimental ARNsi pour la première fois de préparerl'ARNsi comme suit:
   1. centrifuger brièvement l'ARNsi lyophilisé pour faire en sorte que le culot de l'ARNsi est recueilli au fond du tube.
   2. Re-suspendre le siRNA pastillé à une concentration du stock final de 20 uM par pipetage le volume approprié de tampon 1x siRNA (tableau 2).
   3. Pipeter la solution de haut en bas 3 – 5 fois pour mélanger et placer sur un agitateur orbital pendant 30 min à température ambiante, inversant le tube tous les 5 – 10 min.
   4. centrifuger brièvement le tube pour assurer l'ARNsi est recueilli au fond du tube.
   5. Aliquoter le siRNA en 50 aliquotes dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
   6. Pour générer 1 uM concentration de siRNA de travail, pipette 950 pi de 1X siRNA tampon dans une aliquote actions de 50 pi (20 uM) lorsque cela est nécessaire. Remarque: Cette concentration de travail 1 uM peut être congelée décongelée plusieurs fois pour transfections répétées.
2. Placer DMEM + 10% de FCS,0,05% de trypsine-EDTA et du PBS dans un bain à 37 ° C, de l'eau (ou équivalent) pendant 30 min à chaud avant l'utilisation.
3. Préparation des composants de transfection:
   Remarque: Le protocole suivant a été optimisé pour des cellules HeLa 229 dans une microplaque de 96 puits avec des murs noirs et plat, fond transparent. L'optimisation de la quantité de réactif de transfection, la concentration de l'ARNsi et l'ensemencement densité de cellules peut être nécessaire pour les différentes lignées cellulaires.
   1. Pour chaque puits, en utilisant 0,1 ul de réactif de transfection, 15,9 ul de milieu sérique réduit (milieu essentiel minimal utilisé pour les transfections, se référer à la table des matières) et 4 pi de 1 pM de siRNA (donnant lieu à une concentration d'ARNsi finale de 40 nM). Utilisez des tubes de microcentrifugation séparés pour OTP, PLK1, RAB5A et Rab7A. Mesurer chaque condition d'essai en triple exemplaire. Un exemple d'agencement d' une plaque de 96 puits est représenté sur la figure 3.
      Remarque: Ce protocole intègre l'utilisation de deux commandes: OTP et PLK1. OTP estcomposé de quatre siRNA communs qui ont été optimisés pour réduire les effets hors-cible et donc OTP est utilisé comme un contrôle non-ciblage négatif. Embrouillé ARNsi peut aussi être utilisé comme témoin négatif. La perte des résultats d'expression de la PLK1 dans une vaste mort cellulaire dans un certain nombre de lignées cellulaires en induisant des voies pro-apoptotiques et donc PLK1 ARNsi est utilisé comme témoin positif pour la transfection où la mort cellulaire est corrélée à l'efficacité de la transfection.
      1. Pour chaque transfection de siRNA expérimentale, mélanger moyenne sérique réduite de 0,4 ul réactif de transfection et 63,6 ul dans un tube individuel de microcentrifugation. Vortex toutes les microtubes et permettre aux composants de se complexer pendant 5 min à température ambiante.
      2. Ajouter 16μl de chaque siRNA expérimental pour les microtubes correspondants contenant le complexe de transfection. Vortex et incuber pendant 20 min à température ambiante. Note: Il est important de ne pas dépasser 30 minutes, que l'efficacité de transfection diminuera.
4. Pendant les 20 min incubation (2.3.1.2) ajouter 20 ul du réactif de transfection + moyen + sérum réduit siRNA mélanger dans les puits appropriés d'un noir, plateau plat transparent stérile 96 puits à fond.
5. Dès que la période d'incubation de 20 minutes est terminée, les semences des cellules HeLa 229 à une densité de 3,92 × 10 ³ cellules / puits.
   1. La récolte des cellules HeLa 229 à partir d' un sous-confluents ou confluents 75 cm ² flacon de culture tissulaire dans du DMEM préchauffé + 10% de FCS et remettre en suspension les cellules jusqu'à une densité finale de 4,9 x 10 ⁴ cellules / ml selon les méthodes standards. Pour assurer l' efficacité de transfection ne soit pas compromise, préparer des cellules pendant la période d'incubation de 20 min (2.3.1.2).
      1. Laver la monocouche de cellules HeLa 229 deux fois avec 10 ml de PBS préchauffé.
      2. Ajouter 1 ml de solution et le lieu de trypsine-EDTA à 0,05% HeLa 229 cellules à 37 ° C + 5% de _CO2 pendant 3 à 5 minutes pour détacher les cellules.
      3. Recueillir les cellules dans 9 ml d'préchauffée DMEM + 10% FCS. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et de préparer les cellules à une densité finale de 4,9 x 10 ⁴ cellules / ml en utilisant du DMEM + 10% de FCS.
   2. Pipette 80 ul de cellules HeLa 229 à une densité de 4,9 x 10 ⁴ cellules / ml dans chaque puits contenant le réactif de transfection + sérum réduit moyen + siRNA mélange. Ceci correspond à une densité de cellules de 3,92 × 10 ³ cellules / puits.
      Remarque: la soustraction de fond est requise pour le substrat BlaM.
      1. Ne pas ajouter de cellules ou siRNA aux puits "blanc" (Figure 3). Au lieu de cela, ajouter 80 ul de DMEM + 10% de FCS à ces puits mis en place en trois exemplaires.
   3. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C + 5% de CO _2.

3. Changer le média (JOUR 5)

1. Après 24 heures, retirer le support à l'aide d'un adaptateur multicanal reliée à une source ou manuellement sous vide avec une pipette multi-canaux, et le remplacer par 100 ul de préchauffer fraised DMEM + 10% de FCS.
2. Laisser incuber pendant encore 48 heures à 37 ° C + 5% de CO _2.
3. À ce stade, vérifier la viabilité des cellules à l'aide visuelle d'un microscope optique standard. Si la transfection inverse a été couronnée de succès, la mort cellulaire significative est observée dans les puits contenant PLK1 par rapport à l'ARNsi ARNsi OTP.

4. Quantification de Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain utilisant qPCR (JOUR 7)

1. Après 7 jours de croissance ACCM-2 à 37 ° C dans 5% de _CO2, 2,5% de O ₂ (1,3), la centrifugeuse 10 ml C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 à 15000 × g pendant 15 min à température ambiante.
2. Remettre en suspension le culot bactérien dans 10 ml de DMEM + 10% de FCS préchauffée. Préparer 1:10 et 1: 100 dilutions de la culture (échantillon) en utilisant dH ₂ O.
3. Mettre en place les éléments nécessaires à la qPCR.
   Remarque: l'extraction ADNg peut être effectué à l'avance et stocké à -20 ° C until nécessaire.
   1. Préparation de normes:
      1. Extrait ADNg de Coxiella burnetii RSA439 NMII souche de type sauvage cultivées dans ACCM-2 à 37 ° C dans 5% de CO _2, 2,5% O ₂ pendant 7 jours en utilisant un kit d'extraction ADNg, selon les instructions du fabricant.
      2. Mesurer la concentration ADNg (g / ul) en utilisant une Nanodrop (ou équivalent) à une absorbance de 260 nm.
      3. Calculer le nombre de copies du génome par ul en utilisant la formule suivante ci-dessous, et convertir en nombre de génomes / ml.
         
      4. Ajuster le nombre de génomes / ml à 10 ⁹ / ml (dans un volume final de 100 ul) dans un nouveau microtube à l' aide dH ₂ O. Cela peut être fait bouillir pendant 10 minutes et stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      5. Le jour de l'infection, de générer des 10 dilutions en série de 10 génomes ⁸ / ml à 10 ⁵ génomes / ml à partir du génome 10 ⁹s / stock ml.
         1. Pipette 10 pi de 10 ⁹ génomes / ml dans 90 ul de dH ₂ O pour générer 10 ⁸ génomes / ml. Vortex pour mélanger. Pipette 10 pi de 10 ⁸ génomes / ml dans 90 ul de dH ₂ O pour générer 10 ⁷ génomes / ml. Vortex et répétez jusqu'à ce que 10 ⁵ génomes / ml.
   2. Mettre en place la réaction qPCR. Créer un mélange maître pour 25 puits pour tenir compte des erreurs de pipetage. Pour chaque puits, utiliser 10 pl qPCR Master Mix; 2 pl de ompA mélange d' amorces (4.3.2.2) et 3 pi de dH ₂ O.
      Note: OmpA est une protéine de la membrane externe de C. burnetii ^'39 et une section 82 paires de bases dans une région hautement conservée a été sélectionné pour être utilisé comme une sonde ⁴⁰ telle que décrite précédemment.
      1. Configurer chaque standard (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ génomes / ml) et de l' échantillon (1:10 et 1: 100 dilution) dans un 96 puits PCR arracher la plaque (non-jupe) en double ou en triple, respectivement. Ajouter 5 pi d'échantillon ou d'étalon dans les puits appropriés.
      2. En utilisant _dH2Û, on dilue à la fois l'amorce directe de ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') et l' amorce inverse OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') à une concentration finale de 4 uM et de combiner dans un même tube de microcentrifugation.
         Remarque: Le mélange d' amorces de ompA peut être préparé à l' avance et stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      3. Mélanger 250 ul qPCR Master Mix, 50 pl ompA mélange d' amorces, 75 ul dH ₂ O et vortex pour mélanger. Ajouter 15 ul de ce mélange maître aux puits contenant des normes ou des échantillons.
      4. Placez 8-couvercle bouchons de bande PCR sur les puits appropriés et impulsion centrifuge les tubes PCR pour assurer que tout est collecté dans le fond des tubes.
      5. Mettre en place le programme suivant sur une ma PCR quantitativebouchain: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, puis 45 cycles de 95 ° C pendant 1 seconde et 60 ° C pendant 20 secondes (figure 4A).
   3. Analyser le Ct (seuil de cycle) les valeurs de la qPCR:
      1. Transférer les valeurs Ct à une feuille de calcul en utilisant la fonction d'exportation du programme.
      2. Créer un diagramme de dispersion des normes 10 ⁵ génomes / ml par 10 à ⁹ génomes / ml (exprimés en valeurs log). Jeter toutes les valeurs aberrantes parmi les trois échantillons. Générer une courbe de tendance logarithmique et déterminer l'équation du graphique.
      3. Calculer le nombre total de génomes / ml dans l'échantillon en utilisant l'équation générée à 4.3.3.2. Ne pas oublier de tenir compte de la dilution initiale (1:10 et 1: 100) des échantillons.

5. Infection Reverse cellules transfectées (JOUR 7)

1. Après avoir calculé le nombre total des génomes / ml dans le C. bardaneculture netii pBlaM-CBU0077 à utiliser pour l' infection, ajuster la culture bactérienne re-suspension pour infecter les cellules à une MOI de 300 dans un volume final de 50 pl / puits en utilisant préchauffée DMEM + 10% de FCS.
   Note: La densité attendue des ensemencées cellules HeLa 229 avec un temps de doublement normal après 72 h est 3.136 × 10 ⁴ cellules / puits. La quantité de bactéries nécessaires pour infecter à une MOI de 300 est de 9,408 × 10 ⁶ à 50 ul, ce qui équivaut à 1,88 × 10 ⁸ bactéries / ml.
   1. En utilisant la valeur calculée à partir des qPCR (génomes / ml) (4.3.3.3), diluer les bactéries remises en suspension en utilisant DMEM + 10% FCS préchauffé dans un volume final de 2 ml pour infecter les cellules transfectées inverses.
2. Retirez le support existant à partir de l'ébauche et inverser les cellules transfectées.
3. Ajouter 50 ul de bactéries diluées (1,88 × 10 ⁸ bactéries / ml) dans les puits appropriés. Ajouter 50 ul de DMEM + 10% de FCS à la fois le vide et upuits ninfected.
4. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C + 5% de CO _2.

6. Ajout de BlaM Substrat pour déterminer le niveau de translocation (JOUR 8)

1. Préparer les solutions pour la solution 6x de chargement de substrat BlaM.
   Remarque: Solution A, B et C sont fournis dans le kit de substrat BlaM (Reportez – vous à la table des matériaux). La solution B peut former un précipité à température ambiante. Chauffer cette solution à 37 ° C avant l'utilisation et le précipité doit se dissoudre.
   1. Lorsque vous utilisez le kit pour la première fois, ajouter 185 pi de DMSO (fournies avec le kit de substrat BlaM) à la solution A. desséchée Ensuite, stocker la remise en suspension Solution A à -20 ° C.
   2. Préparer une solution 0,1 M probénécide à l'avance et stocker dans 1 ml aliquotes à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
      1. Préparer NaOH 0,4 M (1,6 g dans dH ₂ ' O de 100).
      2. Préparer 100 mM de tampon phosphate de Na à pH 8 (1,56 g NaH ₂ PO ₄ .2H <sub> 2 O et 1,41 g de Na ₂ HPO ₄ dans dH ₂ ' O de 100).
      3. Dissoudre 1,25 g de probénécide dans 22 ml de NaOH 0,4 M par une agitation vigoureuse.
      4. Ajouter 22 ml de Na mM tampon phosphate pH 8 100 (solution tournera trouble) et remuer pour dissoudre le précipité qui se forme.
      5. Ajuster le pH à 8 (si nécessaire) en utilisant 1 M de NaOH / HCl.
      6. Agiter vigoureusement et chauffer légèrement (<50 ° C) jusqu'à ce que la solution est la plupart du temps clair.
      7. Filtre (0,2 um de taille des pores) et aliquote en volumes de 1 ml. aliquotes de conserver à -20 ° C.
2. Pour chaque puits, utilisez 0,06 ul Solution A, 0,54 ul Solution B, 7,9 pi de solution C et 1,5 ul de 0,1 M probénécide. Créer un mélange maître pour les 30 puits en combinant d'abord 1,8 pi de solution A et 16,2 pi de solution B ensemble dans un tube de microcentrifugation. Bien mélanger à l'aide d'un vortex. Ajouter 237 pi de solution C et 45 ul de 0,1 M probénécide. Vortex de combiner tous les components.
   Remarque: La solution 6x de chargement est stable pendant 4 heures (dans le noir), mais doit être préparé aussi près que possible avant l'emploi.
3. Ajouter 10 ul de la solution 6x de chargement directement dans tous les puits vierges et inverse transfectées sans enlever les médias existants.
4. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité.
5. Pour déterminer le niveau de translocation, quantifier la quantité de fluorescence à l'aide d'un lecteur de microplaques.
   Remarque: la procédure suivante est spécifique au lecteur ClarioSTAR de microplaques. les lecteurs de microplaques équivalents peuvent également être utilisés.
   1. Créer un nouveau protocole d'intensité de fluorescence en utilisant endpoint comme mode de lecture.
   2. Réglez les paramètres de base comme suit:
      1. Sélectionnez microplaque de 96 puits.
      2. Sous Paramètres optiques, sélectionnez 2 multichromatics avec les paramètres définis par l'utilisateur suivantes: (1) Entrée 410-10 nm excitation et 520-10 nm émission. (2) Entrée excitation 410-10 nm et 450-10 nm émission. Assurer le bien multichromatics est sélectionné.
      3. Sélectionner une moyenne orbital d'un diamètre de 3 mm.
      4. Sous optique, sélectionnez optique bas.
      5. Sous la vitesse et la précision, sélectionnez précis. Cela correspond à huit régions par puits.
   3. Réglez la disposition de la plaque en sélectionnant les puits appropriés comme échantillons.
   4. Sélectionnez la mesure de départ.
   5. Retirer le couvercle et placez le bac dans le lecteur de plaque. Pour éviter d'atteindre des valeurs maximales de fluorescence, d'assurer la valeur de gain est ajusté. Pour ce faire, effectuer un réglage de gain sur l'un des puits infectés qui a été inverse transfectées avec OTP siRNA. Ceci correspond à la plus élevée translocation attendue.
   6. Sélectionnez la mesure de départ pour mesurer tous les puits appropriés en utilisant la fluorescence de fond à une excitation de 410 nm et une émission à la fois 450 nm et 520 nm pour la fluorescence bleu et vert, respectivement.

7. Analyse des résultats:

1. Calculer le rapportde 450 nm à 520 nm (bleu au vert) pour tous les échantillons après réduction en blanc et d'exprimer par rapport à l'échantillon OTP non infecté.
   Remarque: les étapes d'analyse suivantes sont fournies pour un programme de feuille de calcul simple.
   1. En utilisant la fonction d'exportation sur le lecteur de microplaques, transférer les valeurs de fluorescence brutes obtenues pour les 520 nm et à 450 longueurs d' onde d'émission nm (6.5) dans une feuille de calcul.
   2. Calculer la moyenne des lectures "vierges" (médias seulement, pas de cellules) pour la longueur d'onde de 520 nm en ajoutant les 520 valeurs brutes de fluorescence nm et en divisant par le nombre de puits (3). Répéter en utilisant les 450 valeurs nm de longueur d'onde en blanc. Ces valeurs représentent la fluorescence de fond due à la plaque de 96 puits et des médias.
   3. Soustraire la fluorescence de fond. En utilisant les valeurs obtenues dans 7.1.2 soustraire la moyenne du flan 520 nm de longueur d' onde de tous les échantillons de 520 valeurs de fluorescence nm. Répétez l'opération pour les valeurs de 450 nm de longueur d'onde.
   4. Pour obtenir le 450: rapport 520 nm utiliser les valeurs corrigées en blanc (7.1.3). Divisez chaque échantillon de 450 nm valeur de fluorescence par sa valeur de 520 nm correspondant.
   5. Calculer la moyenne des valeurs non infectées ratio OTP en ajoutant les 450: valeurs 520 ratio nm (de 7.1.4) et en divisant par le nombre de puits (3).
   6. Calculer le rapport entre les échantillons non infectés par rapport à l'ANP en divisant 450: rapport 520 nm calculé 7.1.4 par la moyenne de la valeur du rapport calculé OTP non infecté 7.1.5.

8. Ajout de Nuclei Stain pour déterminer le nombre de cellules après Translocation Assay (JOUR 8)

1. Après la quantification de la fluorescence, retirer le support contenant une solution de chargement 6x de tous les puits en utilisant soit un adaptateur multi-canal reliée à une source ou manuellement sous vide avec une pipette multi-canal.
2. Ajouter 50 pi de 4% PFA (paraformaldehyde) solutiondans du PBS dans tous les puits appropriés pour fixer les cellules. Incubation à température ambiante pendant 20 min.
3. Éliminer la solution 4% PFA PBS (conformément à 8.1) et laver les cellules deux fois avec 75 ul de PBS.
4. Ajouter 50 ul d'une coloration nucléaire perméable aux cellules, par exemple, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole), à ​​chaque puits. Acquérir des images avec un microscope à fluorescence et de quantifier le nombre de noyaux présents dans chaque puits après traitement siRNA en utilisant un logiciel d'analyse d'image appropriée, telle que ImageJ ^41.

Representative Results

Discussion

Les systèmes de sécrétion, et les protéines effectrices bactériennes ces systèmes de transport dans le cytoplasme des cellules hôtes sont une composante importante de virulence que de nombreuses bactéries pathogènes utilisent pour établir une infection dans des niches réplicatives uniques. L'objectif de nombreux groupes de recherche a été d'étudier l'interaction entre les effecteurs bactériens et protéines de l'hôte et l'influence de ces effecteurs ont sur les voies cellulaires hôtes. recherche très limitée, le cas échéant, a examiné le potentiel de protéines de l'hôte comme étant nécessaires pour la réussite bactérienne effecteur translocation.

Dans cette étude , nous avons utilisé l'obligatoire, pathogène intracellulaire Coxiella burnetii, l'agent causal de la fièvre Q zoonotique. Après l' entrée dans les cellules hôtes, la vacuole contenant Coxiella trafficking passivement à travers la voie d'endocytose canonique jusqu'à atteindre une vacuole lysosome dérivé acide, où il se réplique à un nombre très élevé. En dehors de prendre advantage de la voie de trafic normal de l' hôte, la capacité de Coxiella d'établir une niche réplicative succès repose également sur ​​un système de type fonctionnel IVB de sécrétion (T4SS) et effecteur subséquente translocation ^8,17. Ce système de sécrétion est fonctionnellement analogue au bien caractérisé Dot / Icm T4SS de Legionella. Cela a été bien démontré en complétant mutants dot / .icm spécifiques de Legionella avec leurs gènes Coxiella respectifs ^19,20. Bien que le T4SSs des deux Legionella et Coxiella sont essentiels pour la réplication, le moment où ces systèmes sont activés est tout à fait différent et reflète la nature divergente de leurs niches respectives réplicatives. La Legionella T4SS est déclenchée immédiatement après le contact avec des cellules hôtes et la translocation rapide des effecteurs permet aux bactéries d'éviter la voie endosomale-lysosomale par défaut et au lieu de créer un vide réplicative ER dérivés uniquesle ^42. En revanche, le T4SS de Coxiella est pas activée jusqu'à environ 8 heures après l'infection, après que les bactéries atteignent le lysosome dérivé vacuole acide ^21.

Étant donné que Coxiella transite passivement à travers la voie d'endocytose et le système de translocation est pas activé jusqu'à ce qu'il atteigne le lysosome, une occasion unique se présente à utiliser Coxiella comme un outil pour étudier la maturation endocytose. L'obligation pour le CCV à s'acidifier avant d'effecteurs sont transportés indique qu'un certain nombre de protéines de l'hôte sont importantes pour la translocation de protéines effectrices dans le cytoplasme de l'hôte, en particulier, mais sans s'y limiter, les protéines impliquées dans la voie de trafic endocytique. Utilisant siRNA de manière ciblée spécifique, nous pouvons commencer à élucider le rôle de certaines protéines de l'hôte sur effecteur translocation. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur deux protéines qui régulent l'trafficki endocytose eucaryoteng voie, et par conséquent ont été prédites pour effectuer la translocation de la Coxiella effecteur CBU0077. RAB5A et le contrôle de Rab7A fusion membranaire avec les endosomes précoces et tardifs, respectivement. Silencing une ou l' autre de ces protéines en utilisant des ARNsi a entraîné une diminution significative de l' efficacité de la translocation CBU0077 par rapport au témoin OTP siRNA (figure 5B). Les résultats représentatifs présentés ici reflètent nos résultats publiés précédents ²¹ et fournissent une validation supplémentaire de l'importance de ces protéines Rab humaines à Coxiella effecteur translocation. Cette technique a également été utilisée pour caractériser l'impact des autres processus d'accueil sur Coxiella Dot / Icm effecteur translocation. Le complexe de rétromère a été jugée importante pour la réplication intracellulaire de Coxiella. En réduisant au silence les composants rétromère, en utilisant siRNA, puis effectuer un essai de translocation nous avons pu montrer que rétromère est nécessaire pour créer l'environnement qui induitCoxiella effecteur translocation ^43.

Bien que les résultats représentatifs présentés ici est une comparaison entre le contrôle OTP infecté et siRNA RAB5A ciblage et Rab7A, le protocole peut être modifié en fonction des besoins expérimentaux. Par exemple, le niveau d'effecteur translocation peut également être comparée à des cellules transfectées avec l'ARNsi brouillés ou des cellules non transfectées.

L'objectif de cette étude était la obligatoire, intracellulaire pathogène C. burnetii et les protéines impliquées dans le trafic endocytique, cependant, les procédés décrits à l'intérieur peuvent être facilement adaptés à d' autres agents pathogènes intracellulaires et extra – cellulaires qui utilisent des systèmes de sécrétion de la virulence. En effet, le dosage de la translocation fluorescente à base qui repose sur l' activité β-lactamase dans le cytoplasme hôte utilisé ici, a déjà été largement utilisée à travers une gamme d'agents pathogènes ^30-32,35,44. Bien entendu, les conditions d'infection de lades lignées cellulaires spécifiques utilisées doivent être adaptés pour tenir compte des conditions d'infection par des bactéries spécifiques. En outre, un effecteur endogène connu fusionnée à la ß-lactamase est primordial pour le succès des procédés décrits à l'intérieur. Une considération importante pour la mise en œuvre réussie du protocole expliqué ici est l'impact taire une cible hôte particulière pourrait avoir sur l'entrée bactérienne et la réplication subséquente. Ici, effecteur translocation par Coxiella est mesurée 24 h infection post. Dans ce cas, et pour les autres bactéries intracellulaires, la capacité de l'organisme à pénétrer dans les cellules de l'hôte est essentielle. En outre, l'inactivation de gène spécifique pourrait également influer sur la réplication bactérienne modifiant donc le niveau de translocation observé. Confirmation du fait que l'ARNsi silençage n'a pas d'incidence significative d'entrée et / ou la replication bactérienne, et par conséquent l'efficacité de translocation pourrait être obtenue en utilisant microscopie ou la numération des bactéries. la translocationles données peuvent alors être normalisées pour le nombre de cellules infectées par le traitement des ARNsi. La réplication bactérienne n'a pas confondu les données présentées ici comme Coxiella subit peu ou pas de réplication pendant la période d'incubation de 24 h.

Cette méthode nécessite une transfection efficace de l'ARNsi dans des cellules hôtes afin d'assurer silençage suffisante du gène d'intérêt. Avec cela à l'esprit, le choix du réactif de transfection correcte est extrêmement important. Mis à part le réactif et les conditions utilisées dans cette étude particulière, qui a été optimisé pour les cellules HeLa 229, il existe de nombreux autres réactifs à sélectionner. L'efficacité knockdown utilisant différents réactifs de transfection peut être quantifiée par RT-qPCR pour assurer que les deux le réactif le plus approprié est sélectionné et que le siRNA choisi spécifiquement cible le transcrit d'intérêt. Bien que pas présenté dans cette étude, nous avons déjà démontré l'efficacité knockdown à la fois RAB5A et Rab7A utilisant RT-qPCR ^21. En outre, l'utilisation d'anticorps dirigés contre la cible d'intérêt et la confirmation par western blot peut également confirmer siRNA silençage des cibles spécifiques.

Deux autres considérations importantes à prendre note de l'utilisation de siRNA comprennent la possibilité d'effets hors-cible et la viabilité cellulaire des cellules transfectées. Off-cible effets se produisent lorsque les cibles involontaires sont également détruits. Cela peut conduire à des changements phénotypiques et pourrait entraîner des faux positifs. Dans cette étude, nous avons utilisé un pool de quatre duplex siARN pour faire taire une cible hôte unique. Si silencing une cible particulière provoque une diminution de l'efficacité de la translocation, la validation que ce résultat ne résulte pas d'effets hors cible peut être obtenue en séparant les quatre duplex de cARNi et en répétant le test de transfert. Au moins deux des quatre duplex de siRNA devrait démontrer un phénotype similaire à la piscine de siRNA originale. Avec ce résultat, on peut être très confiant que le tr observél'efficacité anslocation ne résulte pas d'effets hors cible. La validité des résultats obtenus de translocation est également dépendante de la viabilité cellulaire. L'application d'une coloration des noyaux après l'essai de translocation permet le dénombrement de la viabilité cellulaire après silençage ARNsi. Dans le cas de PLK1, la mort cellulaire significative peut être facilement observée sans coloration; cependant, en utilisant la microscopie à épifluorescence une représentation plus précise peut être obtenue. Si en faisant taire un particulier hôte cible la mort cellulaire significative est observée, par exemple de 50% par rapport au contrôle, il est peu probable qu'une image précise peut être déduite de l'importance de cette protéine hôte particulière à la translocation des effecteurs. Comme le montre cette étude, bien que ce soit au silence RAB5A ou Rab7A a un léger impact sur ​​la viabilité des cellules (Figure 5C), cette réduction ne se prononce pas assez pour nier la validité des données de translocation observées. Une autre considération en ce qui concerne la viabilité des cellules follen raison ARNsi silençage est l'observation que la mort cellulaire significative conduit souvent à une augmentation du taux de translocation. Ceci est bien démontré par les données de translocation rapportées pour PLK1 (figure 5A). Le nombre de cellules réduit se traduit par une augmentation proportionnelle de la multiplicité d'infection. Cela permettra d'accroître le taux d'infection et donc le taux de translocation.

Bien que pas présenté dans cette étude, la visualisation d'effecteur translocation peut également donner un résultat quantitatif gratuit. À l'aide d'un microscope à épifluorescence équipé d'un miroir dichroïque passe-temps pour l'excitation et l'émission de lumière séparée peut fournir une observation visuelle de la fluorescence intracellulaire de substrat BlaM. Une alternative possible au système rapporteur β-lactamase est d'utiliser le système rapporteur adénylate-cyclase. Similaire au système rapporteur décrit ici, le gène d'intérêt est fusionné à un gène adénylcyclase calmoduline-dépendante (cyaA </em>) Dérivée de Bordetella pertussis. Effecteurs translocation peut être mesurée par quantification de l'AMP cyclique intracellulaire (AMPc) à l'aide d'un kit ELISA de dosage immunologique. Puisque l'activité de CyaA est entièrement dépendante de la calmoduline de la cellule hôte, ce qui est seulement présente dans le cytosol hôte effecteur translocation est confirmée par une augmentation des taux d'AMPc. Bien que cette méthode a été utilisée avec succès pour mesurer la translocation effectrices pour une variété de bactéries ^45-47, la quantification de l' AMPc intracellulaire repose sur la lyse des cellules hôtes pour extraire l' AMPc, un processus qui est plus chronophage par rapport à la méthode décrite à l'intérieur. La mesure de la translocation d'effecteur au moyen du système β-lactamase de reporteur à base de FRET est plus efficace puisque le substrat BlaM peut être ajouté directement aux cellules et la fluorescence peut être mesurée en quelques heures. En outre, la méthode décrite ici peut être plus facilement adaptée pour générer des résultats à haut débit, en particulier sous une forme de 96 puitsà.

De nombreux agents pathogènes bactériens dépendent des systèmes de protéines de translocation pour introduire des protéines effectrices dans des cellules hôtes qui permettent la modulation des fonctions de la cellule hôte au profit de l'agent pathogène. Systèmes IV de sécrétion de type sont utilisés par des bactéries intracellulaires tels que Legionella, Coxiella et Brucella et III systèmes de sécrétion sont utilisés par une gamme d'agents pathogènes , y compris Chlamydia, attachant et effaçant E. coli et Salmonella. En comparant l'effet de l'expression de protéines silençage hôtes spécifiques sur effecteur translocation par une gamme d'agents pathogènes, une compréhension des facteurs de l'hôte nécessaires pour effecteur translocation par certains types de systèmes de sécrétion ou spécifiques à un agent pathogène particulier pourrait être élucidé. Ceci fournit une approche unique pour étudier les subtilités des interactions hôte-pathogène.

Materials

<strong>Reagents</strong>
Citric acid	Sigma	C0759	ACCM-2 medium component
Sodium citrate	Sigma	S4641	ACCM-2 medium component
Potassium phosphate	Sigma	60218	ACCM-2 medium component
Magnesium chloride	Calbiochem	442611	ACCM-2 medium component
Calcium chloride	Sigma	C5080	ACCM-2 medium component
Iron sulfate	Fisher	S93248	ACCM-2 medium component
Sodium chloride	Sigma	S9625	ACCM-2 medium component
L-cysteine	Sigma	C6852	ACCM-2 medium component
Bacto-neopeptone	BD	211681	ACCM-2 medium component
Casamino acids	Fisher	BP1424	ACCM-2 medium component
Methyl beta cyclodextrin	Sigma	C4555	ACCM-2 medium component
RPMI + Glutamax	ThermoFisher Scientific	61870-036	ACCM-2 medium component
Chloramphenicol	Sigma	C0378	For bacterial culture
ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)	Dharmacon	D-001810-10-05	Non-targeting control
siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-003290-01-005	Causes cell death; measure of transfection efficiency
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool	Dharmacon	M-010388-00-0005
5x siRNA buffer	Dharmacon	B-002000-UB-100	Use sterile RNase-free water to dilute 5x siRNA buffer to 1x siRNA buffer
DharmaFECT-1 Transfection Reagent	Dharmacon	T-2001-01	For transfection
Opti-MEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	51985-034	Reduced-serum medium used for transfection
DMEM + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10567-014	For cell culture and infection
Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)	Thermo Scientific	SH30071.03	Can use alternate equivalent product
DMSO	Sigma	D8418	For storage of Coxiella strain
PBS			For cell culture
0.05% Trypsin + EDTA	ThermoFisher Scientific	25300-054	For cell culture
dH<sub>2</sub>O			For dilution of samples and standards for qPCR
Quick-gDNA Mini Prep	ZYMO Research	D3007	Can use alternate equivalent product to extract gDNA
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Bioline	BIO-98020	Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction
LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM	Invitrogen	K1032	For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)
Sodium hydroxide	Merck	106469	Probenicid solution component
Sodium phosphate monobasic	Sigma	71505	Probenicid solution component
di-Sodium hydrogen orthophosphate	Merck	106586	Probenicid solution component
Probenicid	Sigma	P8761	Probenicid solution component
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)	ThermoFisher Scientific	62251	Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&nbsp;
4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS	Sigma	P6148	Fixing solution for HeLa 229 cells
25 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	430639	For growth of bacterial strain
96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile	Corning	3603
75 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	430641	For growth of HeLa 229 cells
175 cm<sup>2</sup> tissue culture flask with vented cap	Corning	431080	For growth of HeLa 229 cells
Haemocytometer			For quantification of HeLa 229 cells
Tear-A-Way 96 Well PCR plates	4titude	4ti-0750/TA	For qPCR reaction
8-Lid chain, flat	Sarstedt	65.989.002	For qPCR reaction
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
<strong>Equipment</strong>
Bench top microfuge
Bench top vortex
Orbital mixer
Centrifuge	Eppendorf	5810 R	For pelleting bacterial culture
Nanodrop			For gDNA quantification
Mx3005P QPCR machine	Aligent Technologies	401456	For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture
ClarioSTAR microplate reader	BMG LabTech		For measurement of fluorescence