Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par Coxiella burnetii Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii est un pathogène intracellulaire unique qui provoque la zoonotique infection humaine fièvre Q. Cette maladie est associée à un large éventail de présentations cliniques s'étendant de séroconversion asymptomatique à une infection chronique potentiellement mortelle qui se manifeste souvent endocardite ans après l' exposition ^1. L'infection humaine se produit principalement par l'inhalation d'aérosols contaminés avec ruminants le principal réservoir d'infection, en particulier, les vaches laitières, les moutons et les chèvres. Bien que l' infection Coxiella chez ces animaux est généralement subclinique, l'infection peut déclencher l' avortement et la charge bactérienne considérable dans le fluide de l' accouchement et le placenta peut contaminer l'environnement local ^1. Un exemple de l'énorme fardeau telle contamination peut avoir sur la santé publique et l'industrie de l' agriculture a récemment été observée dans l'épidémie de fièvre Q qui a eu lieu aux Pays - Bas ^2. Entre 2007 et2010, plus de 4000 cas humains de fièvre Q ont été diagnostiqués et cette épidémie était liée à une contamination importante des exploitations caprines ^3. En outre, Coxiella est une arme biologique potentielle, classé par les US Centers for Disease Control and Prevention, en raison de la stabilité de l' environnement des bactéries et une faible dose infectieuse nécessaire pour provoquer la morbidité et de la mortalité ⁴ sévère.

Coxiella existe en deux phases: Phase I organismes, isolées à partir de sources naturelles, sont extrêmement virulents et les organismes de la Phase II sont fortement atténués in vivo. Par exemple, après quelques passages in vitro dans des Coxiella burnetii phase I Nine Mile organismes, les bactéries de phase II ont été produits qui contiennent une délétion chromosomique irréversible résultant en un lipopolysaccharide tronqué (LPS) ^5. Cette souche, C. burnetii NMII, est phénotypiquement similaire à la phase I dans les modèles de culture de tissus et fournit un mode plus sûrl pour les chercheurs pour étudier la pathogenèse Coxiella dans les laboratoires ^5. Au cours des dernières années , plusieurs avancées ont rapidement fait progresser le domaine de la génétique Coxiella. Plus particulièrement, le développement des médias axénique (acidifié milieu de cystéine citrate - ACCM-2) a permis la croissance sans cellule de Coxiella à la fois liquide et sur ​​des supports solides ^6,7. Cela a entraîné des améliorations directes des outils génétiques disponibles pour Coxiella , y compris un système d'expression génique inductible, des vecteurs navettes et des systèmes de transposon aléatoires ^8-11. Plus récemment, deux méthodes d'inactivation du gène ciblé ont également été mis au point, ouvrant la voie à l' examen des gènes candidats de virulence spécifiques ^12.

Après intériorisation par les macrophages alvéolaires, Coxiella réplique à un nombre élevé dans un compartiment lié à la membrane appelée Coxiella- contenant des vacuoles (CCV). Le CCV nécessite le trafic d'endocytose hôte eendosomes précoces et tardives rugueux jusqu'à ce qu'il arrive à maturité dans un organite lysosome dérivé ^13. Tout au long de ce processus, le CCV acquiert des facteurs hôtes qui soit apparaissent transitoirement ou restent associés à la vacuole, y compris, mais sans s'y limiter, Rab5, Rab7, CD63 et ^{LAMP-13 à 15 janvier.} Réplication de Coxiella dans les cellules hôtes est entièrement dépendante d' un type Dot / Icm système entièrement fonctionnel IVB Sécrétion (T4SS) ^8,16,17. Ce système de sécrétion est une structure multi-protéique héréditairement liés aux systèmes de conjugaison et englobe à la fois les membranes bactériennes et vacuolaires pour délivrer des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytoplasme de l' hôte ^18. Le Coxiella T4SS est fonctionnellement très similaire au type IVB Dot / Icm système Sécrétion bien caractérisé de Legionella pneumophila ^19,20. Fait intéressant, l' activation de l'effecteur translocation T4SS et ultérieure ne se produit pas jusqu'à ce que Coxiella atteint le lysosome dérivé acideorganite, environ 8 heures post-infection ^17,21. À ce jour, plus de 130 effecteurs Dot / Icm ont été identifiés ^9,17,22-24. Beaucoup de ces effecteurs jouent probablement un rôle important lors de la réplication de Coxiella dans les cellules hôtes; cependant, seuls quelques effecteurs ont été caractérisées fonctionnellement ^25-29.

Dans cette étude , nous utilisons une translocation dosage par fluorescence à base qui repose sur le clivage du substrat FRET CCF2-AM (ci - après dénommé le substrat BlaM) via l' activité β-lactamase dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 1). Le gène d'intérêt est fusionnée à TEM-1 β-lactamase (BlaM) sur un plasmide rapporteur qui permet une expression constitutive. Le substrat BlaM est composé de deux fluorophores (coumarine et fluorescéine) qui forment une paire FRET. L'excitation des résultats de la coumarine dans la case de la fluorescéine et le vert émission de fluorescence en l'absence d'effecteur translocation; cependant, si le BlaM effecteur protéine de fusion subit une translocation dans le cytoplasme de l'hôte, la résultante β-lactamase activité clive la bague β-lactame du substrat BlaM, séparant la paire de FRET produisant une émission de fluorescence bleue après excitation. Ce test de translocation a été éprouvée comme une approche pour identifier les protéines effectrices à partir d' une gamme de différentes bactéries intracellulaires et extracellulaires, y compris C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, entéropathogènes E. coli, Salmonella et Brucella ^17,30-35.

Pour déterminer le rôle des facteurs de l' hôte spécifiques sur Coxiella effecteur translocation nous utilisons une méthode bien établie pour l' inactivation de gène connu comme l' interférence ARN, en particulier les petits ARN interférents (siRNA). Initialement identifié dans Caenorhabditis elegans, l' interférence ARN est un processus cellulaire endogène conservé utilisé pour defe innéense contre les virus, ainsi que régulation des gènes ^36,37. Après la liaison de siRNA spécifique de la séquence, la dégradation de l' ARNm se produit à travers RISC (complexe taire induite par l' ARN) conduisant à l' inactivation de gène spécifique ou knockdown ^38. Dans cette étude, l'ARNsi a été utilisé pour cibler deux protéines de l'hôte, et RAB5A Rab7A, qui sont des régulateurs importants de la voie d'endocytose. L'impact du silence RAB5A et Rab7A sur effecteur translocation a été établie à l' aide C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 a été choisi car il a été montré précédemment translocation par le système de sécrétion de point / Icm de Coxiella ^17.

Utilisant à la fois siRNA silençage génique et le test de translocation fluorescencebased décrit ici, nous commençons à établir un rôle de facteurs de l' hôte dans la translocation des protéines effectrices par Coxiella. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de bactéries intracellulaires et extracellulaires qui possèdent secretio similairesLes systèmes responsables de la translocation de protéines effectrices n.

Remarque: Toutes les procédures impliquant la croissance ou la manipulation de Coxiella burnetii RSA439 NMII doivent être effectuées dans un niveau de confinement physique 2 laboratoire et dans une enceinte de sécurité biologique dans le respect des directives locales. Un diagramme schématique de la transfection et l' analyse de la translocation flux inverse de celui décrit ci - dessous est représentée sur la figure 2.

1. Préparation de C. burnetii Culture Exprimer CBU0077 Fused à la ß-lactamase (pBlaM-CBU0077) (JOUR 1)

1. Préparer 1X ACCM-2 ^6:
   1. Combiner les composants répertoriés dans le tableau 1. Ajuster le pH à 4,75 avec NaOH 6 M et stériliser par filtration (ne pas l' autoclave). ACCM-2 est stable pendant environ trois semaines stockées à 4 ° C.
2. Générer C. les stocks burnetii pBlaM-CBU0077.
   1. Infectent des cellules HeLa 229 ° C avec souche burnetii portant pBlaM-CBU0077 et le passage jusqu'à ce grand vacuoles sont observées dans la majorité des cellules.
      1. Cultivez le C. burnetii souche portant pBlaM-CBU0077 dans 20 ml ACCM-2 contenant de 3 pg / ml de chloramphenicol dans un tissu de 75 ^cm2 flacon de culture avec bouchon à évent pendant 7 jours à 37 ° C dans 5% de _CO2, 2,5% d' O _2.
      2. Centrifuger le C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 à 15000 × g pendant 15 min à température ambiante.
      3. Remettre en suspension le culot dans 20 ml de DMEM + 10% de sérum de foetus de veau (FCS) + 3 ug / ml de chloramphenicol (milieu d'entretien). Retirez le support à partir d' un 50% confluentes 75 cm ² flacon de cellules HeLa 229. Ajouter re-suspendu C. burnetii à cellules HeLa 229. Incuber pendant 2 jours à 37 ° C dans 5% de _CO2 pour permettre à l' infection de cellules HeLa 229 à établir.
      4. Cellules Divisé en 175 cm ² culture tissulaire flacon.
         1. Retirez le support du 75 cm ² flacon et laver la monocouche deux fois avec 10 ml de PBS préchauffé.
         2. Ajouter 1 ml of 0,05% de trypsine-EDTA solution et de placer les cellules à 37 ° C + 5% de CO ₂ pendant 3 - 5 minutes pour détacher les cellules.
         3. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu d'entretien. Ajouter 2 ml de cellules remises en suspension dans un 175 cm ² flacon contenant 38 ml de milieu de maintenance.
         4. Incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant 3 - 5 jours jusqu'à 100% de confluence est atteinte et on observe de grandes vacuoles.
   2. Recueillir le surnageant de 175 cm ² flacon, ajouter 10 ml _dH2Û afin de couvrir les infectés cellules HeLa 229 et incuber pendant 15 min pour lyser les cellules infectées.
   3. Combiner le surnageant et les cellules lysées et le culot à 15 000 x g pendant 15 min à température ambiante.
   4. Re-suspendre le culot dans 10 ml dH ₂ O. lyser les cellules en faisant passer de façon répétée en outre la remise en suspension à travers une aiguille 23G fixée à une seringue de 10 ml, au moins 20 fois. Pellet à 500 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires.
   <li> Retirez et le surnageant du culot à 15000 × g pendant 15 min à température ambiante pour recueillir C. burnetii.
3. Re-suspendre C. burnetii dans DMEM + 10% de FCS et quantifier nombre de bactéries que par 4. Diluer à 1 × 10 ⁹ génomes / ml en utilisant DMEM + 10% FCS + 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), aliquote de 50 stocks de pi dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -80 ° C.

2. Inverse transfection de siRNA et Semis de cellules HeLa 229 (JOUR 4)

1. Lors de l'utilisation du expérimental ARNsi pour la première fois de préparerl'ARNsi comme suit:
   1. centrifuger brièvement l'ARNsi lyophilisé pour faire en sorte que le culot de l'ARNsi est recueilli au fond du tube.
   2. Re-suspendre le siRNA pastillé à une concentration du stock final de 20 uM par pipetage le volume approprié de tampon 1x siRNA (tableau 2).
   3. Pipeter la solution de haut en bas 3 - 5 fois pour mélanger et placer sur un agitateur orbital pendant 30 min à température ambiante, inversant le tube tous les 5 - 10 min.
   4. centrifuger brièvement le tube pour assurer l'ARNsi est recueilli au fond du tube.
   5. Aliquoter le siRNA en 50 aliquotes dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
   6. Pour générer 1 uM concentration de siRNA de travail, pipette 950 pi de 1X siRNA tampon dans une aliquote actions de 50 pi (20 uM) lorsque cela est nécessaire. Remarque: Cette concentration de travail 1 uM peut être congelée décongelée plusieurs fois pour transfections répétées.
2. Placer DMEM + 10% de FCS,0,05% de trypsine-EDTA et du PBS dans un bain à 37 ° C, de l'eau (ou équivalent) pendant 30 min à chaud avant l'utilisation.
3. Préparation des composants de transfection:
   Remarque: Le protocole suivant a été optimisé pour des cellules HeLa 229 dans une microplaque de 96 puits avec des murs noirs et plat, fond transparent. L'optimisation de la quantité de réactif de transfection, la concentration de l'ARNsi et l'ensemencement densité de cellules peut être nécessaire pour les différentes lignées cellulaires.
   1. Pour chaque puits, en utilisant 0,1 ul de réactif de transfection, 15,9 ul de milieu sérique réduit (milieu essentiel minimal utilisé pour les transfections, se référer à la table des matières) et 4 pi de 1 pM de siRNA (donnant lieu à une concentration d'ARNsi finale de 40 nM). Utilisez des tubes de microcentrifugation séparés pour OTP, PLK1, RAB5A et Rab7A. Mesurer chaque condition d'essai en triple exemplaire. Un exemple d'agencement d' une plaque de 96 puits est représenté sur la figure 3.
      Remarque: Ce protocole intègre l'utilisation de deux commandes: OTP et PLK1. OTP estcomposé de quatre siRNA communs qui ont été optimisés pour réduire les effets hors-cible et donc OTP est utilisé comme un contrôle non-ciblage négatif. Embrouillé ARNsi peut aussi être utilisé comme témoin négatif. La perte des résultats d'expression de la PLK1 dans une vaste mort cellulaire dans un certain nombre de lignées cellulaires en induisant des voies pro-apoptotiques et donc PLK1 ARNsi est utilisé comme témoin positif pour la transfection où la mort cellulaire est corrélée à l'efficacité de la transfection.
      1. Pour chaque transfection de siRNA expérimentale, mélanger moyenne sérique réduite de 0,4 ul réactif de transfection et 63,6 ul dans un tube individuel de microcentrifugation. Vortex toutes les microtubes et permettre aux composants de se complexer pendant 5 min à température ambiante.
      2. Ajouter 16μl de chaque siRNA expérimental pour les microtubes correspondants contenant le complexe de transfection. Vortex et incuber pendant 20 min à température ambiante. Note: Il est important de ne pas dépasser 30 minutes, que l'efficacité de transfection diminuera.
4. Pendant les 20 min incubation (2.3.1.2) ajouter 20 ul du réactif de transfection + moyen + sérum réduit siRNA mélanger dans les puits appropriés d'un noir, plateau plat transparent stérile 96 puits à fond.
5. Dès que la période d'incubation de 20 minutes est terminée, les semences des cellules HeLa 229 à une densité de 3,92 × 10 ³ cellules / puits.
   1. La récolte des cellules HeLa 229 à partir d' un sous-confluents ou confluents 75 cm ² flacon de culture tissulaire dans du DMEM préchauffé + 10% de FCS et remettre en suspension les cellules jusqu'à une densité finale de 4,9 x 10 ⁴ cellules / ml selon les méthodes standards. Pour assurer l' efficacité de transfection ne soit pas compromise, préparer des cellules pendant la période d'incubation de 20 min (2.3.1.2).
      1. Laver la monocouche de cellules HeLa 229 deux fois avec 10 ml de PBS préchauffé.
      2. Ajouter 1 ml de solution et le lieu de trypsine-EDTA à 0,05% HeLa 229 cellules à 37 ° C + 5% de _CO2 pendant 3 à 5 minutes pour détacher les cellules.
      3. Recueillir les cellules dans 9 ml d'préchauffée DMEM + 10% FCS. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre et de préparer les cellules à une densité finale de 4,9 x 10 ⁴ cellules / ml en utilisant du DMEM + 10% de FCS.
   2. Pipette 80 ul de cellules HeLa 229 à une densité de 4,9 x 10 ⁴ cellules / ml dans chaque puits contenant le réactif de transfection + sérum réduit moyen + siRNA mélange. Ceci correspond à une densité de cellules de 3,92 × 10 ³ cellules / puits.
      Remarque: la soustraction de fond est requise pour le substrat BlaM.
      1. Ne pas ajouter de cellules ou siRNA aux puits "blanc" (Figure 3). Au lieu de cela, ajouter 80 ul de DMEM + 10% de FCS à ces puits mis en place en trois exemplaires.
   3. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C + 5% de CO _2.

3. Changer le média (JOUR 5)

1. Après 24 heures, retirer le support à l'aide d'un adaptateur multicanal reliée à une source ou manuellement sous vide avec une pipette multi-canaux, et le remplacer par 100 ul de préchauffer fraised DMEM + 10% de FCS.
2. Laisser incuber pendant encore 48 heures à 37 ° C + 5% de CO _2.
3. À ce stade, vérifier la viabilité des cellules à l'aide visuelle d'un microscope optique standard. Si la transfection inverse a été couronnée de succès, la mort cellulaire significative est observée dans les puits contenant PLK1 par rapport à l'ARNsi ARNsi OTP.

4. Quantification de Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Strain utilisant qPCR (JOUR 7)

1. Après 7 jours de croissance ACCM-2 à 37 ° C dans 5% de _CO2, 2,5% de O ₂ (1,3), la centrifugeuse 10 ml C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 à 15000 × g pendant 15 min à température ambiante.
2. Remettre en suspension le culot bactérien dans 10 ml de DMEM + 10% de FCS préchauffée. Préparer 1:10 et 1: 100 dilutions de la culture (échantillon) en utilisant dH ₂ O.
3. Mettre en place les éléments nécessaires à la qPCR.
   Remarque: l'extraction ADNg peut être effectué à l'avance et stocké à -20 ° C until nécessaire.
   1. Préparation de normes:
      1. Extrait ADNg de Coxiella burnetii RSA439 NMII souche de type sauvage cultivées dans ACCM-2 à 37 ° C dans 5% de CO _2, 2,5% O ₂ pendant 7 jours en utilisant un kit d'extraction ADNg, selon les instructions du fabricant.
      2. Mesurer la concentration ADNg (g / ul) en utilisant une Nanodrop (ou équivalent) à une absorbance de 260 nm.
      3. Calculer le nombre de copies du génome par ul en utilisant la formule suivante ci-dessous, et convertir en nombre de génomes / ml.
         
      4. Ajuster le nombre de génomes / ml à 10 ⁹ / ml (dans un volume final de 100 ul) dans un nouveau microtube à l' aide dH ₂ O. Cela peut être fait bouillir pendant 10 minutes et stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      5. Le jour de l'infection, de générer des 10 dilutions en série de 10 génomes ⁸ / ml à 10 ⁵ génomes / ml à partir du génome 10 ⁹s / stock ml.
         1. Pipette 10 pi de 10 ⁹ génomes / ml dans 90 ul de dH ₂ O pour générer 10 ⁸ génomes / ml. Vortex pour mélanger. Pipette 10 pi de 10 ⁸ génomes / ml dans 90 ul de dH ₂ O pour générer 10 ⁷ génomes / ml. Vortex et répétez jusqu'à ce que 10 ⁵ génomes / ml.
   2. Mettre en place la réaction qPCR. Créer un mélange maître pour 25 puits pour tenir compte des erreurs de pipetage. Pour chaque puits, utiliser 10 pl qPCR Master Mix; 2 pl de ompA mélange d' amorces (4.3.2.2) et 3 pi de dH ₂ O.
      Note: OmpA est une protéine de la membrane externe de C. burnetii ^'39 et une section 82 paires de bases dans une région hautement conservée a été sélectionné pour être utilisé comme une sonde ⁴⁰ telle que décrite précédemment.
      1. Configurer chaque standard (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ génomes / ml) et de l' échantillon (1:10 et 1: 100 dilution) dans un 96 puits PCR arracher la plaque (non-jupe) en double ou en triple, respectivement. Ajouter 5 pi d'échantillon ou d'étalon dans les puits appropriés.
      2. En utilisant _dH2Û, on dilue à la fois l'amorce directe de ompA (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') et l' amorce inverse OmpA (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') à une concentration finale de 4 uM et de combiner dans un même tube de microcentrifugation.
         Remarque: Le mélange d' amorces de ompA peut être préparé à l' avance et stocké à -20 ° C jusqu'à utilisation.
      3. Mélanger 250 ul qPCR Master Mix, 50 pl ompA mélange d' amorces, 75 ul dH ₂ O et vortex pour mélanger. Ajouter 15 ul de ce mélange maître aux puits contenant des normes ou des échantillons.
      4. Placez 8-couvercle bouchons de bande PCR sur les puits appropriés et impulsion centrifuge les tubes PCR pour assurer que tout est collecté dans le fond des tubes.
      5. Mettre en place le programme suivant sur une ma PCR quantitativebouchain: 50 ° C pendant 2 min, 95 ° C pendant 10 min, puis 45 cycles de 95 ° C pendant 1 seconde et 60 ° C pendant 20 secondes (figure 4A).
   3. Analyser le Ct (seuil de cycle) les valeurs de la qPCR:
      1. Transférer les valeurs Ct à une feuille de calcul en utilisant la fonction d'exportation du programme.
      2. Créer un diagramme de dispersion des normes 10 ⁵ génomes / ml par 10 à ⁹ génomes / ml (exprimés en valeurs log). Jeter toutes les valeurs aberrantes parmi les trois échantillons. Générer une courbe de tendance logarithmique et déterminer l'équation du graphique.
      3. Calculer le nombre total de génomes / ml dans l'échantillon en utilisant l'équation générée à 4.3.3.2. Ne pas oublier de tenir compte de la dilution initiale (1:10 et 1: 100) des échantillons.

5. Infection Reverse cellules transfectées (JOUR 7)

1. Après avoir calculé le nombre total des génomes / ml dans le C. bardaneculture netii pBlaM-CBU0077 à utiliser pour l' infection, ajuster la culture bactérienne re-suspension pour infecter les cellules à une MOI de 300 dans un volume final de 50 pl / puits en utilisant préchauffée DMEM + 10% de FCS.
   Note: La densité attendue des ensemencées cellules HeLa 229 avec un temps de doublement normal après 72 h est 3.136 × 10 ⁴ cellules / puits. La quantité de bactéries nécessaires pour infecter à une MOI de 300 est de 9,408 × 10 ⁶ à 50 ul, ce qui équivaut à 1,88 × 10 ⁸ bactéries / ml.
   1. En utilisant la valeur calculée à partir des qPCR (génomes / ml) (4.3.3.3), diluer les bactéries remises en suspension en utilisant DMEM + 10% FCS préchauffé dans un volume final de 2 ml pour infecter les cellules transfectées inverses.
2. Retirez le support existant à partir de l'ébauche et inverser les cellules transfectées.
3. Ajouter 50 ul de bactéries diluées (1,88 × 10 ⁸ bactéries / ml) dans les puits appropriés. Ajouter 50 ul de DMEM + 10% de FCS à la fois le vide et upuits ninfected.
4. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C + 5% de CO _2.

6. Ajout de BlaM Substrat pour déterminer le niveau de translocation (JOUR 8)

1. Préparer les solutions pour la solution 6x de chargement de substrat BlaM.
   Remarque: Solution A, B et C sont fournis dans le kit de substrat BlaM (Reportez - vous à la table des matériaux). La solution B peut former un précipité à température ambiante. Chauffer cette solution à 37 ° C avant l'utilisation et le précipité doit se dissoudre.
   1. Lorsque vous utilisez le kit pour la première fois, ajouter 185 pi de DMSO (fournies avec le kit de substrat BlaM) à la solution A. desséchée Ensuite, stocker la remise en suspension Solution A à -20 ° C.
   2. Préparer une solution 0,1 M probénécide à l'avance et stocker dans 1 ml aliquotes à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
      1. Préparer NaOH 0,4 M (1,6 g dans dH ₂ ' O de 100).
      2. Préparer 100 mM de tampon phosphate de Na à pH 8 (1,56 g NaH ₂ PO ₄ .2H ₂ HPO ₄ dans dH ₂ ' O de 100).
      3. Dissoudre 1,25 g de probénécide dans 22 ml de NaOH 0,4 M par une agitation vigoureuse.
      4. Ajouter 22 ml de Na mM tampon phosphate pH 8 100 (solution tournera trouble) et remuer pour dissoudre le précipité qui se forme.
      5. Ajuster le pH à 8 (si nécessaire) en utilisant 1 M de NaOH / HCl.
      6. Agiter vigoureusement et chauffer légèrement (<50 ° C) jusqu'à ce que la solution est la plupart du temps clair.
      7. Filtre (0,2 um de taille des pores) et aliquote en volumes de 1 ml. aliquotes de conserver à -20 ° C.
2. Pour chaque puits, utilisez 0,06 ul Solution A, 0,54 ul Solution B, 7,9 pi de solution C et 1,5 ul de 0,1 M probénécide. Créer un mélange maître pour les 30 puits en combinant d'abord 1,8 pi de solution A et 16,2 pi de solution B ensemble dans un tube de microcentrifugation. Bien mélanger à l'aide d'un vortex. Ajouter 237 pi de solution C et 45 ul de 0,1 M probénécide. Vortex de combiner tous les components.
   Remarque: La solution 6x de chargement est stable pendant 4 heures (dans le noir), mais doit être préparé aussi près que possible avant l'emploi.
3. Ajouter 10 ul de la solution 6x de chargement directement dans tous les puits vierges et inverse transfectées sans enlever les médias existants.
4. Incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité.
5. Pour déterminer le niveau de translocation, quantifier la quantité de fluorescence à l'aide d'un lecteur de microplaques.
   Remarque: la procédure suivante est spécifique au lecteur ClarioSTAR de microplaques. les lecteurs de microplaques équivalents peuvent également être utilisés.
   1. Créer un nouveau protocole d'intensité de fluorescence en utilisant endpoint comme mode de lecture.
   2. Réglez les paramètres de base comme suit:
      1. Sélectionnez microplaque de 96 puits.
      2. Sous Paramètres optiques, sélectionnez 2 multichromatics avec les paramètres définis par l'utilisateur suivantes: (1) Entrée 410-10 nm excitation et 520-10 nm émission. (2) Entrée excitation 410-10 nm et 450-10 nm émission. Assurer le bien multichromatics est sélectionné.
      3. Sélectionner une moyenne orbital d'un diamètre de 3 mm.
      4. Sous optique, sélectionnez optique bas.
      5. Sous la vitesse et la précision, sélectionnez précis. Cela correspond à huit régions par puits.
   3. Réglez la disposition de la plaque en sélectionnant les puits appropriés comme échantillons.
   4. Sélectionnez la mesure de départ.
   5. Retirer le couvercle et placez le bac dans le lecteur de plaque. Pour éviter d'atteindre des valeurs maximales de fluorescence, d'assurer la valeur de gain est ajusté. Pour ce faire, effectuer un réglage de gain sur l'un des puits infectés qui a été inverse transfectées avec OTP siRNA. Ceci correspond à la plus élevée translocation attendue.
   6. Sélectionnez la mesure de départ pour mesurer tous les puits appropriés en utilisant la fluorescence de fond à une excitation de 410 nm et une émission à la fois 450 nm et 520 nm pour la fluorescence bleu et vert, respectivement.

7. Analyse des résultats:

1. Calculer le rapportde 450 nm à 520 nm (bleu au vert) pour tous les échantillons après réduction en blanc et d'exprimer par rapport à l'échantillon OTP non infecté.
   Remarque: les étapes d'analyse suivantes sont fournies pour un programme de feuille de calcul simple.
   1. En utilisant la fonction d'exportation sur le lecteur de microplaques, transférer les valeurs de fluorescence brutes obtenues pour les 520 nm et à 450 longueurs d' onde d'émission nm (6.5) dans une feuille de calcul.
   2. Calculer la moyenne des lectures "vierges" (médias seulement, pas de cellules) pour la longueur d'onde de 520 nm en ajoutant les 520 valeurs brutes de fluorescence nm et en divisant par le nombre de puits (3). Répéter en utilisant les 450 valeurs nm de longueur d'onde en blanc. Ces valeurs représentent la fluorescence de fond due à la plaque de 96 puits et des médias.
   3. Soustraire la fluorescence de fond. En utilisant les valeurs obtenues dans 7.1.2 soustraire la moyenne du flan 520 nm de longueur d' onde de tous les échantillons de 520 valeurs de fluorescence nm. Répétez l'opération pour les valeurs de 450 nm de longueur d'onde.
   4. Pour obtenir le 450: rapport 520 nm utiliser les valeurs corrigées en blanc (7.1.3). Divisez chaque échantillon de 450 nm valeur de fluorescence par sa valeur de 520 nm correspondant.
   5. Calculer la moyenne des valeurs non infectées ratio OTP en ajoutant les 450: valeurs 520 ratio nm (de 7.1.4) et en divisant par le nombre de puits (3).
   6. Calculer le rapport entre les échantillons non infectés par rapport à l'ANP en divisant 450: rapport 520 nm calculé 7.1.4 par la moyenne de la valeur du rapport calculé OTP non infecté 7.1.5.

8. Ajout de Nuclei Stain pour déterminer le nombre de cellules après Translocation Assay (JOUR 8)

1. Après la quantification de la fluorescence, retirer le support contenant une solution de chargement 6x de tous les puits en utilisant soit un adaptateur multi-canal reliée à une source ou manuellement sous vide avec une pipette multi-canal.
2. Ajouter 50 pi de 4% PFA (paraformaldehyde) solutiondans du PBS dans tous les puits appropriés pour fixer les cellules. Incubation à température ambiante pendant 20 min.
3. Éliminer la solution 4% PFA PBS (conformément à 8.1) et laver les cellules deux fois avec 75 ul de PBS.
4. Ajouter 50 ul d'une coloration nucléaire perméable aux cellules, par exemple, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole), à ​​chaque puits. Acquérir des images avec un microscope à fluorescence et de quantifier le nombre de noyaux présents dans chaque puits après traitement siRNA en utilisant un logiciel d'analyse d'image appropriée, telle que ImageJ ^41.

Pour cette étude, le C. souche burnetii pBlaM-CBU0077 a été choisi comme CBU0077 a été précédemment montré pour être un effecteur translocation du système de sécrétion Coxiella Dot / Icm 17. Avant l'infection, le nombre de génomes / ml dans les sept jours C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 a été dénombrée en utilisant qPCR. La figure 4 montre un exemple du cycle seuil (Ct) des valeurs attendues des deux étalons et les échantillons suivants qPCR. Les valeurs Ct (représentées graphiquement dans la Amplification Plot (figure 4B) et numériquement (figure 4C)) ont été exportées et analysées comme décrit dans 4.3.3. Sur la base des données représentatives montrées, il y avait 2,31 × 10 8 génomes / ml dans 10 ml de culture bactérienne resuspendus (figure 4D). Pour générer la dilution bactérienne appropriée (1,88 × 10 8 génomes / ml in 2 ml), 1,63 ml de bactéries remises en suspension ont été ajoutés à 370 ul de frais DMEM + 10% de FCS préchauffée. Les cellules transfectées avec l' ARNsi inverse ont ensuite été infectés par le C. burnetii pBlaM-CBU0077 à une MOI de 300 pendant 24 heures.

Après incubation de l'inverse des cellules infectées par transfectées avec BlaM substrat quantification d'effecteur translocation peut être déterminée en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence. Suite à l' analyse comme décrit dans 7, toutes les valeurs du rapport qui ont été normalisés à OTP non infectées peuvent également être normalisées à OTP infecté. Le niveau d'effecteur translocation après silençage des gènes de l'hôte peuvent être regroupées en trois résultats après comparaison au contrôle infecté OTP: (1) Pas de changement; (2) Augmentation effecteur translocation; (3) Diminution de la effecteur translocation. Après analyse statistique, par exemple un test t de Student, peut être utilisé pour déterminer l'importance de toute différence observée to infecté contrôle OTP. Le résultat de silence soit RAB5A ou Rab7A sur effecteur translocation à partir de trois expériences indépendantes est représenté sur la figure 5A. Une diminution significative du niveau de BlaM-CBU0077 translocation produite lors de silence à la fois RAB5A et Rab7A par rapport au contrôle OTP (valeur p = 0,0088 (RAB5A) et de la valeur de p = 0,0059 (Rab7A), jumelé, test t de Student). L'impact du traitement siRNA sur la viabilité cellulaire a également été établie. À la suite de l'essai de translocation, les cellules ont été fixées, colorées avec une coloration des noyaux, puis quantifiés. Comme on le voit sur ​​la figure 5C, bien que le traitement soit avec RAB5A ou Rab7A se traduit par une diminution de la viabilité cellulaire par rapport au témoin OTP (12% et 31%, respectivement), cette réduction ne sont pas aussi sévères que PLK1 (97%), un gène connu pour provoquer la mort cellulaire (valeur p = 0,0102 (RAB5A); p = 0,0081 (Rab7A); p <0,0001 (PLK1), jumelé, test t de Student). Ces résultats montrent comment faire taire l'hôte genda utilisant siRNA peuvent modifier négativement les niveaux de bactéries effecteur translocation.

Figure 1. Le mécanisme d'action de la BlaM substrat pendant l' infection. C. burnetii est internalisée par les cellules hôtes et forme une vacuole lysosome dérivé appelé la vacuole -contenant Coxiella. 24 heures après l'infection, les cellules sont chargées avec le substrat BlaM perméable de la membrane qui possède deux fluorophores qui forment une paire de FRET (A). En l'absence de β-lactamase -à- dire, aucune translocation de l'effecteur BlaM-CBU0077, l' excitation de la coumarine à 410 nm résulte en FRET à la fluorescéine, observée comme un signal vert de fluorescence (520 nm) (B). dans le cas d'un système fonctionnel de sécrétion Dot / Icm, la protéine de fusion BlaM-CBU0077 seront transloquées dans la cellule hôte et seront cll' avant - toit du substrat BlaM, via l' activité β-lactamase, ce qui provoque la séparation des deux colorants et entraînant une perturbation de FRET et un signal de fluorescence bleue (450 nm) après excitation à 410 nm (C). Les deux signaux de fluorescence verte et bleue peuvent être détectée en utilisant un lecteur de plaque de fluorescence. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

. Figure 2. Schéma Vue d'ensemble de la fonction Reverse Transfection et Translocation Assay workflow Jour 1: Préparer le C. burnetii pBlaM-CBU0077 culture Jour 4:. transfecter inverse à l' aide de 40 nM de siRNA et de semences HeLa 229 cellules à une densité finale de 3,92 × 10 3 cellules / puits dans un plateau de 96 puits Jour 5: Ch .médias ange Jour 7:. Quantifier le total génomes / ml de C. burnetii pBlaM-CBU0077 culture en utilisant qPCR et ensuite infecter des cellules inverse transfectées avec une MOI de 300. Jour 8:. Ajouter 6x colorant de charge, mesurer la fluorescence et de quantifier le nombre de cellules S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. La plaque de mise en page 96 puits utilisé pour configurer la fonction Reverse Transfection et Ensemencement des cellules HeLa 229. Les puits «blancs» (en rouge) contiennent des médias seulement et ne nécessitent pas l'addition soit siRNA ou cellules HeLa 229. Le Bureau du Procureur siRNA (représenté en bleu clair pour les puits non infectés et bleu foncé pour les puits infectés) est utilisé comme un contrôle non-ciblage, car il a été optimisé pouront moins d'effets hors-cible. Le marron et les puits verts représentent la RAB5A et Rab7A siRNA, respectivement. PLK1 siRNA (en jaune) est utilisé comme une mesure de l' efficacité de transfection que la perte d'expression de PLK1 peut induire des voies pro-apoptotiques et une vaste mort cellulaire dans une grande majorité des lignées cellulaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Représentant qPCR Ct Valeurs utilisés pour quantifier le nombre total de génomes / ml dans C. burnetii pBlaM-CBU0077 Culture. (A) Les conditions de cycle utilisées dans le qPCR d'énumérer le nombre de génomes / ml dans les cultures Coxiella. Les valeurs de Ct pour les étalons et les échantillons sont représentés dans graphique (B) et numérique (C)formats. (D) Les valeurs Ct standard ont été en moyenne, de graphiques et une courbe de tendance logarithmique a été calculée. En utilisant l'équation et les moyennes des valeurs Ct de l'échantillon le nombre de génomes / ml dans le C. culture burnetii pBlaM-CBU0077 a été déterminée à 2,31 × 10 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. translocation de la Dot / Icm effecteur BlaM-CBU0077 pendant siRNA Silencing de RAB5A et Rab7A. Cellules HeLa 229 ont été inverse transfectées avec le siRNA spécifique à RAB5A (barres marron), Rab7A (barres vertes), OTP (barres bleues) ou PLK1 (barres jaunes) et incubées pendant 72 heures avant l' infection par le C. souche burnetii pBlaM-CBU0077 à une MOI de 300 pendant 24 heures. après til addition du substrat BlaM, la fluorescence a été mesurée en utilisant un lecteur de microplaques (A) Le tableau montre les valeurs de fluorescence brutes obtenues à partir d' une expérience unique aux côtés de la 450:. 520 nm rapport relatif au contrôle OTP non infecté après soustraction des valeurs vides (médias seulement, pas de cellules). Le niveau de translocation (B) et la viabilité des cellules (C) sont présentés sous forme de pourcentage moyenne ± écart - type par rapport à des cellules infectées transfectées OTP inverse à partir de trois expériences indépendantes. * P <0,05; ** P <0,01; **** P <0,0001 (apparié, t -test de Student). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1. Les composants nécessaires pour faire 1x ACCM-2.

Tableau 2. Volume de 1x siRNA Buffer requis pour Hydratant lyophilisé siRNA à la concentration appropriée.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.