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Article de méthode

Répétitif stimulation magnétique transcrânienne à l'Unilatérale hémisphère de cerveau de rat

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DOI :

10.3791/54217

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22 octobre 2016

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1Department of Rehabilitation Medicine, Chungnam National University Hospital, Daejeon, 2Department of Biomedical Engineering, Seoul National University College of Medicine, 3Institute of Medical and Biological Engineering, Medical Research Center, Seoul National University, 4Department of Biomedical Engineering, Seoul National University Hospital, 5Department of Nuclear Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Gangwon Do Rehabilitation Hospital, 7Department of Rehabilitation Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous avons appliqué une stimulation magnétique transcrânienne répétitive (rTMS) à l’hémisphère unilatéral du cerveau du rat, en plaçant une bobine en forme de 8 de 25 mm à 1 cm du sommet sur la ligne biauriculaire et en angulant la bobine de 45°. Un système de refroidissement par eau interne a été utilisé pour le rTMS pendant plus de 20 min.

Résumé

Les modèles précédents de stimulation magnétique transcrânienne répétitive (SMTr) ont adopté la stimulation cérébrale globale au lieu de la SMTr hémisphérique unilatérale, ce qui est différent des protocoles utilisés pour les sujets humains. Nous rapportons une application réussie de la SMTr à l’hémisphère unilatéral du cerveau du rat. La SMTr a été administrée à l’aide d’un protocole de stimulation à basse fréquence (1 Hz), à haute fréquence (20 Hz) ou simulé à un côté du cerveau à l’aide d’une petite bobine en forme de 8 de 25 mm. Nous avons placé le centre de la bobine à 1 cm du sommet sur la ligne biauriculaire et angulé la bobine à 45° par rapport au sol pour minimiser un effet direct potentiel de la rTMS sur le cortex controlatéral. Nous avons également utilisé un système de refroidissement par eau interne pour permettre une stimulation magnétique répétitive pendant plus de 20 minutes, même à une fréquence de stimulation de 20 Hz. Les augmentations des transcriptions des gènes précoces immédiats (Arc, Junb et Egr2) étaient plus importantes après la SMTr qu’après une stimulation simulée. Après 5 jours consécutifs de SMTr à 1 Hz de 20 minutes, l’expression de l’ARNm bdnf était significativement plus élevée dans le cortex stimulé que dans le côté controlatéral. Le modèle présenté ici permettra d’élucider les mécanismes moléculaires de la SMTr en permettant l’analyse de la différence inter-hémisphérique dans son effet.

Introduction

La stimulation magnétique transcrânienne répétitive (SMTr), un outil pour la stimulation cérébrale non invasive et neuromodulation, a été appliqué dans le traitement de diverses conditions telles que la douleur centrale 1,2, la dépression 3, la migraine 4, et même temps 5-7. l'évolution rapide du courant électrique à travers des bobines sur la tête induit un champ électrique sur le cortex cérébral et une activation neuronale résultant. L'excitabilité du cortex cérébral peut être modulée par SMTr, qui peut durer plus de 30 minutes après la stimulation est terminée.

Mécanismes suggérés des rTMS après-effet à long terme comprennent potentialisation / dépression comme l' effet 8, changement transitoire dans l' équilibre ionique 9 et métabolique change 10. En outre, Di Lazzaro et al. suggèrent que la stimulation de salve thêta intermittente affecte les entrées synaptiques excitateurs aux pyramidal neurones des voies, à la fois dans la stimulationet l'hémisphère controlatéral 11.

Des limites importantes, cependant, ont empêché les chercheurs de la conversion des preuves sur banc à des situations cliniques. Tout d' abord, dans des études animales précédentes, rTMS a été utilisée pour la stimulation du cerveau entier 12. La stimulation du cerveau entier est tout à fait différent des protocoles utilisés dans les études humaines 9. L'autre problème est lié à la durée de stimulation. Ceci est au moins en partie attribuable au fait qu'un système de refroidissement efficace est indisponible pour les petites bobines dans le passé.

Au cours des dernières années, des articles séminales ont été publiés en proposant des moyens permettant de surmonter ces difficultés dans l'expérience rTMS sur le petit cerveau de l'animal. Par ces modèles animaux, il a été révélé que le cerveau du rat montre également des modifications de l' excitabilité du cortex semblables chez l'être humain en réponse à la rTMS à basse fréquence 13. Plus important encore, les mécanismes cellulaires et moléculaires de la rTMS sont de plus en plus being étudiée en utilisant des modèles animaux de rTMS. Un exemple en est que un type distinct de interneuron inhibitrice est connu pour être le plus sensible à la stimulation thêta intermittente rafale 14. modèles murins de rTMS, par conséquent, offrent de nouvelles opportunités pour explorer des questions très recherchés sur les bases moléculaires des changements rTMS-induits. Si des petits modèles animaux de rTMS peuvent être utilisés dans plusieurs laboratoires, il peut grandement accélérer et renforcer la recherche dans ce domaine.

Nous décrivons maintenant comment appliquer rTMS à l'hémisphère unilatéral de cerveau de rat, une extension des travaux antérieurs 15. les changements induits par stimulation ont été évalués à l'aide de micro-tomographie par émission de positons (TEP) et les microréseaux d'ARNm pour étudier SMTr induite par des changements dans le cortex cérébral stimulé.

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Protocole

Toutes les procédures utilisant des animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'hôpital universitaire national de Séoul.

1. Configuration expérimentale

  1. préparation des animaux
    1. Permettre des rats mâles Sprague-Dawley de 1 semaine à adapter à leur nouvel environnement avant de commencer l'expérience.
      NOTE: Bien que 8 semaines chez des rats âgés ont été utilisés dans la présente étude, un développement ou cerveau adulte peut être choisi en fonction des hypothèses de recherche.
  2. anesthésie par inhalation pour l'induction
    1. Et maintenir une anesthésie induire à 5% et 2% d'isoflurane dissous dans 40% / 60% et 25% / 75% d' oxygène / azote par l' intermédiaire d' une chambre et le nez conique, respectivement. Régler la profondeur de l'anesthésie au niveau de l'abolition du réflexe de retrait de la pédale de pincement de l'orteil pour confirmer anesthetization bon.
      REMARQUE: L'utilisation d'animaux réveillées peut être un meilleur choix en termes de traduction, mais il y a des difficultés à retenir lors de la SMTr et they sont sujettes à un stress excessif.
    2. Surveiller la température du corps avec une sonde rectale et le maintenir à 37 ° C à l'aide d'une couverture homéothermique. Surveiller profondeur de l'anesthésie en utilisant la pédale réflexe de retrait, la température, la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque.
  3. Mettez-over à l'anesthésie par voie intraveineuse pour l'entretien
    1. Préparer la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Cathétériser une veine de la queue latérale avec un cathéter veineux calibre 24 pour le passage à l' anesthésie intraveineuse (figure 1A). Charge propofol par voie intraveineuse (1 mg / kg · [min] pendant 10 min, en utilisant 10 mg / ml d'émulsion) aux animaux. Cesser isoflurane 5 min après le début de propofol chargement.
    2. Maintenir sédation au propofol à un taux de 500 pour perfusion - 700 ug / (kg · min) tout au long de l'expérience, comme dans une étude précédente 16. Supplément d' oxygène à 0,8 L / min par l' intermédiaire d' un cône de nez.
      NOTE: L'anesthésie avec du propofol est de réduire la suppression potentielle de l'excitabilité corticale par le inhalAgent ation 17-19. Cependant, l'anesthésie ne soit pas obligatoire dans les expériences SMTr, et les animaux Réveillé peut également être utilisé. méthodes d'anesthésie devraient être décidées en tenant compte des hypothèses de recherche.
    3. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    4. Appliquer la stimulation magnétique (voir Section2) 10 min après la transition complète de l' anesthésie iv.
  4. conditions de récupération
    1. Surveiller les signes vitaux pendant la phase de récupération. Ne pas laisser l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Si un animal a subi une intervention chirurgicale, ne reviennent pas à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
      REMARQUE: si une intervention chirurgicale pour un modèle de maladie est effectuée, la gestion de la douleur post-chirurgicale est nécessaire. Cependant, la gestion de la douleur est pas nécessaire pour cette expérience rTMS.

2. Répétitive stimulation magnétique transcrânienne

  1. Stimulateur et la bobine
    1. Appliquer la stimulation à l'aide d' un stimulateur répétitif qui fournit des stimuli biphasique via un 25 mm en 8 bobine. Localisez le centre de la bobine de 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular et angulate la bobine 45 ° par rapport au sol.
      NOTE: La force maximale magnétique de la bobine de champ est de 4,0 T. La bobine magnétique est monté fermement sur un support intégré.
  2. seuil de moteur
    1. Déterminer le seuil moteur (MT) au point chaud, avec le centre de la bobine positionnée 0,5 cm latéralement au sommet sur la ligne biauricular et avec le plat de la surface sur la calvaria. Ceci est la même méthodologie utilisée dans une étude précédente 20.
      NOTE: Définir MT que l'intensité minimale de stimulation évoquant 5 ou plus palpables contractions sur la patte controlatérale de 10 stimuli consécutifs. Vérifier si la stimulation est principalement la cause de la contraction du muscle controlatéral pour assurer une stimulation unilatérale.
  3. Application de rTMS
    1. Appliquer rTMS 10 min après la stabilisation de l'anesthésie profonde. Placez le centre de la bobine sur le site SMTr cible, choisi parmi les cortex cérébraux en fonction des questions de recherche. Ensuite, incliner la bobine pour assurer un contact direct entre le centre de la bobine et la surface du crâne au point de stimulation.
      NOTE: Par exemple, angulate la bobine de 45 ° par rapport au sol afin de minimiser un effet direct potentiel de SMTr sur le cortex controlatéral (Figure 1B et 1C).
    2. Soumettre les animaux à une session de 20 min-rTMS de l'hémisphère unilatérale. Utilisation de la console du logiciel, de livrer rTMS avec une basse fréquence (1 Hz), à haute fréquence (20 Hz), ou d'un protocole de stimulation factice, et régler l'intensité de la stimulation à 100-110% de la MT.
    3. Effectuer 1 stimulation Hz sans repos. Utilisation de la console d'entrée du logiciel "1200" plans pour "20" min). Pour 20 stimulation Hz, effectuer 2 sec de la stimulation suivie par 28sec de repos. Utilisation de la console d'entrée du logiciel "1.600" plans pour min "20".
    4. Pour une stimulation factice, inclinez la bobine perpendiculaire (rotation de 90 °) à la calvaria et placer le bord de la bobine 2 cm en dehors de la surface de la tête (figure 1D). Fixer le support de bobine fermement à l'appareil principal; il n'y a pas besoin de tenir la bobine à la main lors de l'expérience.
      REMARQUE: Pour compenser les effets non spécifiques acoustiques et d'autres, les protocoles de faux distincts doivent être utilisés pour des protocoles de stimulation distincts. Par exemple, une stimulation factice 1-Hz peut être utilisé pour 1 Hz SMTr expériences.
  4. Le refroidissement de la bobine
    1. Utilisez un système de refroidissement de l' eau pour permettre la stimulation magnétique répétitive pendant plus de 20 min à 1- et 20 Hz fréquences de stimulation (figure 2). Faire circuler l'eau glacée entourant toute la longueur de la bobine pendant l'expérience pour éviter la surchauffe, bien que la température de la bobine ou stimulateur est pas surveillée.
      REMARQUE: disponibles dans le commerce des bobines refroidies de rat peuvent également être utilisés.
    2. Si possible, surveiller la température de la batterie en observant la jauge de chauffage de la machine rTMS. NOTE: Il n'y avait pas de conséquences fâcheuses liées à la stimulation rTMS. Il y a, cependant, un risque de brûlure potentiel si les étiquettes d'identification de l'oreille de métal sont utilisés à proximité de la bobine stimulant.

3. tomographie par émission de positons Micro

  1. préparation des animaux
    1. Procéder à l'anesthésie par inhalation pour l'induction et l'anesthésie iv pour l'entretien (voir étape 1.2.1 et 1.3.1). Appliquer 1 Hz rTMS à un animal pendant 10 minutes à une intensité de stimulation de 100 à 110% du MT.
    2. Cinq minutes après la fin de la stimulation rTMS, injecter 1 mCi de 2- [F-18] fluoro-désoxyglucose (FDG 18) dissous dans 0,5 ml de sérum physiologique par voie intraveineuse à l'aide d' un cathéter dans la veine caudale. Autoriser 30 min pour 18 FDG. REMARQUE: Placez le rat sous anesthésie pendant toute la micro-PEexpérience T.
  2. L'analyse d'image
    1. Utilisez un scanner TEP pour l'imagerie cérébrale pour réaffirmer l'unilatéralité de la stimulation. Reconstruire images avec un 3-D algorithme itératif. Pour évaluer les changements dans le métabolisme induites par SMTr, identifier les régions d'intérêt (ROI) dans les images des coupes de cerveau transversales 21.
  3. Euthanasie
    1. Après avoir effectué l'imagerie micro-PET, l'euthanasie, les rats dans une chambre remplie au préalable avec du dioxyde de carbone, tandis que les rats sont en anesthésie profonde.

4. ARNm Microarray

  1. Euthanasie
    1. Et maintenir une anesthésie induire à 5% et 2% d'isoflurane dissous dans 40% / 60% et 25% / 75% d' oxygène / azote par l' intermédiaire d' une chambre et le nez conique, respectivement. Anesthetize profondément au niveau de l'abolition du retrait de la pédale réflexe de pincement de l'orteil avant d'être décapité.
    2. Décapitez les rats pour l'euthanasie 5 min après 1 session de 1 Hz SMTr.
  2. récolte de tissus
    1. Disposez les matériaux et les instruments chirurgicaux dans l'ordre d'utilisation, y compris les serviettes pliées en papier, une gouge osseuse, microciseaux, ciseaux chirurgicaux plus grands, un microforcep, une lame de scalpel n ° 10 ou 11, 10 cm plat lidded de Pétri en verre rempli de glace et 1,5 ml tubes. Préparer un sac en plastique pour l'élimination de la carcasse.
    2. Faire une incision cutanée médiane dans le anterioposteriorly du crâne. Carrément disséquer les tissus mous et les muscles environnants avec des ciseaux chirurgicaux, et enlever le morceau de crâne d'os en utilisant une gouge osseuse. disséquer rapidement le cerveau frais soigneusement du crâne. Ensuite, posez-le sur la glace en utilisant les microforceps et microciseaux. Rincer le tissu cérébral dans la glace froide solution saline normale.
    3. Transférer le cerveau à la glace sèche immédiatement, puis le stocker à -80 ° C dans un tube jusqu'à ce que le traitement ultérieur.
    4. Décongeler le tissu cérébral avant la récolte.
    5. Placez le cerveau dorsale vers le haut, et récolter le tissu cérébral de la stimulated cortex cérébral (autour du point chaud dans le cortex moteur primaire) sur la glace en utilisant les microforceps et microciseaux. Placez le tissu prélevé dans le tube de 1,5 ml.
  3. préparation d'ARN
    1. Extraire l' ARN total à partir des homogénats de tissus en utilisant le réactif de lyse 22. Processus avec la digestion de DNase et les procédures de nettoyage. Quantifier les échantillons d'ARN et aliquotes et stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation.
    2. Pour le contrôle de qualité, d'évaluer la pureté et l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel dénaturant, à un rapport de DO 260: 280, et de les analyser sur un analyseur disponible dans le commerce.
  4. Marquage et purification
    1. Amplifier et purifier l'ARN total en utilisant un kit d'amplification d'ARN disponible dans le commerce pour donner ARNc biotinylé. En bref, reverse-transcription 550 ng d'ARN total en ADNc en utilisant une T7 oligo (dT). Synthétiser et in vitro transcrire le deuxième brin d' ADNc, puis l' étiqueter avec de la biotine-NTP.
    2. Après purification, quantifier l'ADNc en utilisant un spectrophotomètre.
  5. Hybridation et exporter des données 23
    1. Utiliser le BeadChip d'expression pour l'analyse de l'expression de l'ARNm. Hybrider les 750-ng échantillons d'ADNc marqués à chaque rat-12 expression perles tableau pour 16 - 18 h à 58 ° C. Effectuer la détection du signal de réseau en utilisant la streptavidine-Cy3.
    2. tableaux de numérisation avec un scanner confocal. Effectuer des données de réseau de traitement et d'analyse d'exportation en utilisant un logiciel disponible dans le commerce.

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Résultats

Quinze 8 semaines vieux rats Sprague-Dawley ont été utilisés pour une interévaluateurs analyse de fiabilité distincte de la détermination MT. Utilisation de la palpation des contractions musculaires, les MTs ont été obtenus dans tous les rats et mesurées à 33,00 ± 4,21% de sortie maximale du stimulateur (% MSO) et 33,93 ± 0,88% MSO, respectivement, par deux chercheurs indépendants. biais Bland-Altman était -0.93, et les limites de l'accord de 95% étaient à 7,26% -9,13.

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Discussion

Le but principal de cette étude était d'introduire un modèle animal de la rTMS unilatérales. Bien que la stimulation unilatérale est l'une des caractéristiques les plus fondamentales de la recherche rTMS humaines, de nombreuses études ont pas adopté dans les petits animaux. Cependant, Rotenberg et al. 15 enregistré MPE controlatéral avec une stimulation de 100% de MT en utilisant une bobine de chiffre 8 d'un diamètre de lobe extérieur de 20 mm, tandis que la stimulation avec 112,5% ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation pour la recherche sur la Corée financée par le gouvernement coréen (KRF-2008-313-E00458). Les auteurs remercient Jin-Joo Lee pour l’assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Couverture homéothermique avec sonde rectaleAppareil Harvard507222F
Isoflurane (Forane sol.)Choongwae
Propofol (Provive Inj. 1 % 20 ml)Claris Lifesciences
Stimulateur magnétique répétitif (Magstim Rapid2)Magstim Company Ltd
25 mm bobine en 8Magstim Company Ltd1165-00
PET-CTGE Healthcare
QIAzol Lysis ReagentQiagen(Brevet américain n° 5,346,994)
RNeasy Lipid Tissue Mini KitQiagen74804
RNeasy Mini Spin ColumnsQiagen(Mat No. 1011708)
Agilent 2100 Bioanalyzer AgilentTechnologies
Ambion Illumina Kit d’amplification d’ARNAmbion
Nanodrop SpectrophotomètreNanoDropND-1000
Illumina RatRef-12 Expression BeadChipIllumina, Inc.
Amersham fluorolink streptavidin-Cy3GE Healthcare Bio-Sciences

Références

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