Isoler cellules progénitrices Mesangiogenic (PPM) de Human Bone Marrow

Résumé

Nous décrivons ici un protocole optimisé et hautement reproductible pour isoler les cellules progénitrices mésodermiques (MPC) de la moelle osseuse humaine (hBM). Les MPC ont été caractérisées par cytométrie en flux et expression de la nestine. Ils ont montré leur capacité à donner lieu à des cultures cellulaires de type CSM à croissance exponentielle tout en conservant leur potentiel angiogénique.

Résumé

Dans une étude de recherche visant à isoler des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) dérivées de la moelle osseuse humaine (CSM) pour des applications cliniques, nous avons identifié une nouvelle population cellulaire spécifiquement sélectionnée pour la croissance dans un milieu supplémenté en sérum humain. Ces cellules sont caractérisées par des caractéristiques morphologiques, phénotypiques et moléculaires distinctes des CSM et nous les avons nommées cellules progénitrices mésodermiques (MPC). Les MPC sont rondes, avec une région centrale épaisse et hautement réfringente ; Ils présentent une forte adhérence résistante à la trypsine au plastique. L’incapacité à étendre directement les MPC a révélé qu’ils sont lents à cycler. C’est aussi ce que suggère la négativité du Ki-67. D’autre part, la culture de MPC dans un milieu standard conçu pour l’expansion des MSC a donné naissance à une population de cellules de type MSC à croissance exponentielle. En plus de montrer une capacité de différenciation mésenchymateuse, les MPC ont conservé un potentiel angiogénique, confirmant leur nature progénitrice de lignées multiples. Nous décrivons ici un protocole optimisé et hautement reproductible pour isoler et caractériser les hBM-MPC par cytométrie en flux (CD73, CD90, CD31 et CD45), l’expression de la nestine et l’organisation de l’actine F. Des protocoles de différenciation mésengène et angiogénique des MPC sont également fournis. Ici, nous suggérons également une nomenclature plus appropriée pour ces cellules, qui a été rebaptisée « cellules progénitrices mésangiogéniques ».

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont une valeur clinique pertinente pour leur capacité de différenciation de lignées multiples et de leur capacité à soutenir l' hématopoïèse, pour sécréter des facteurs de croissance / cytokines , ainsi que pour jouer un rôle dans l' immunorégulation ^1. Dans la définition de la production et de l' application à base de MSC thérapies cellulaire ont fait l'objet d' une vaste recherche clinique et pré-clinique ^2, avec une attention particulière à la réglementation internationale spécifique pour la sécurité et l' efficacité de la cellule produit médicinal (CBMP) traitements ³ base. MSCs humaines sont largement cultivées dans des milieux contenant des suppléments et des réactifs d'origine animale, tel que le sérum fœtal bovin (FBS) et de la trypsine bovine. Par conséquent, aux côtés de risques infectieux associés à la manipulation des cellules, les patients sont également confrontés à prion exposition ainsi que les risques immunologiques liés à des protéines, des peptides ou d'autres biomolécules d'origine animale qui pourraient persister après la récolte de cellules et Transplantation ^4.

Pour contourner le problème, nous avons cultivé l'os humain MSCs -derived dans un milieu exempt d'animaux de moelle (HBM), en remplacement de FBS avec humain regroupé type AB sérum (PhABS). Dans ces conditions, aux côtés de MSCs croissance, nous avons identifié une nouvelle population de cellules. Ces cellules sont morphologiquement et phénotypique différent de MSCs et ont montré un profil d'expression des gènes distinctifs ainsi que les propriétés caractéristiques culture / adhérence. Ils conservaient les deux cellules mesengenic et le potentiel angiogéniques et ont donc été nommés mésodermique progénitrices (PPM) ^5. Par la suite, nous avons été en mesure de définir les conditions de culture sélective et reproductibles pour générer au PPM haute qualité de pureté ^6.

Nous avons également étudié les propriétés morphologiques et biologiques des PPM. Les PPM ont montré être nestine positif, lent dans le cyclisme, Ki-67-négatif, et avec des chromosomes caractérisés par de longs télomères ^5. Ils ont exprimé plurFacteurs de transcription ipotency associé MSC principaux régulateurs Runx2 et Sox9 ^{7 octobre-4} et Nanog plutôt que. Phénotypique, PPMs exprimé endogline (CD105) au niveau inférieur à MSCs tout en manquant des marqueurs mésenchymateuses CD73, CD90, CD166. PPM a également montré un motif distinctif de molécules d'adhésion caractérisés par l' expression cohérente de PECAM (CD31), intégrines αL (CD11a), aM (CD11b), aX (CD11c) ainsi que β2 intégrine (CD18) qui soutient spécifiquement les structures podosomes-like ⁸ . Dans les médias de l' expansion de MSC standard, PPM différencié rapidement en MSCs par une étape intermédiaire , avec l'activation de Wnt5 / calmoduline signalisation cellulaire ^9. PPM a également conservé des propriétés angiogéniques, comme l'a démontré leur capacité à germer à partir de sphéroïdes dans murins matrice extracellulaire (ECM) cultures protéines 3D. Le potentiel angiogénique a été rapidement perdu après différenciation MPC le long de la lignée mesengenic.

Nous présentons ici protocols optimisés pour isoler et caractériser PPMs hautement purifiés à partir d'échantillons de sang HBM. protocoles reproductibles pour MPC mesengenic et la différenciation angiogéniques sont également décrits.

Protocole

NOTE: Après consentement écrit, des échantillons HBM ont été obtenus au cours de la chirurgie orthopédique pour le remplacement de la hanche. Immédiatement après l'ostéotomie du col du fémur et du fémur avant aléser une seringue de 20 ml contenant 500 UI d'héparine, a été utilisée pour aspirer le BM frais. Le protocole doit être considéré comme largement applicable à toute source BM.

1. Isolement de l'os humain de cellules de moelle osseuse mononucléaires (HBM-PTM)

1. Diluer 5 - 10 ml de BM frais de 50 ml, en appliquant la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) et on mélange par inversion. répartir également 25 ml dans deux nouveaux tubes coniques de 50 ml, ajouter 25 ml de D-PBS à chaque tube et mélanger par retournement.
2. Laisser les tubes reposer pendant 10 min à température ambiante, pour la séparation de fragments d'os minéraux et de matières grasses de la solution.
3. Retirez délicatement la graisse flottante avec une pipette et filtre Pasteur suspension cellulaire stérile à travers 70 um filtres sans perturber l'os minéral fragment pellet.
4. Ensemble de quatre tubes de 50 ml avec 15 ml de milieu à gradient discontinu de densité de centrifugation (1,077 g / ml). Assurez-vous que ce milieu est à la température ambiante.
5. Déposer délicatement 20 - 25 ml de dilution BM au-dessus du milieu de gradient de densité. Effectuez cette opération avec soin, laissant suspension cellulaire filet sur les parois du tube pour empêcher les couches de mélange.
6. Effectuer un gradient de densité centrifugation à 400 xg pendant 30 min à température ambiante avec frein désactivé.
7. Récupérer la bague blanchâtre de cellules situées entre les deux phases à l'aide d'une pipette Pasteur stérile et le transférer dans un nouveau tube de 50 ml.
8. Laver les cellules avec un milieu de culture frais: rouge de phénol libre, faible taux de glucose (1,000 mg / l) milieu de Eagle modifié Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) mise en commun de type AB sérum humain (PhABS), 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (DMEM / 10% PhABS). Centrifuger à 400 g pendant 5 min.
9. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 à 10 ml de DMEM frais / 10% PhABS.
10. Passez à la numération cellulaire.Déterminer le nombre de globules blancs par dilution 1: 1 en trypan. Appliquer à l'hémocytomètre, et observer sous microscope à contraste de phase. Exclure les petites et parfaitement arrondis érythrocytes et les cellules mortes colorées en bleu de la numération cellulaire.
    NOTE: Il est fortement recommandé de PhABS écran lots pour leur performance dans la récupération MPC. PhABS provenant de sources USA ont donné de meilleurs résultats alors que la plupart des sérums d'origine différente a donné lieu à des cultures MPC avec des pourcentages plus élevés de cellules MSC-like.

2. Isolement des PPM de HBM-PTM

1. Fixer hydrophobes flacons T-75 avec 15 ml de DMEM frais / 10% PhABS et laisser le pH et la température équilibrent par une pré-incubation à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant 30 min.
2. Seed 4-6 x 10 ⁷ HBM-MNC par flacon et incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pendant 48 heures.
3. Aspirer et jeter les cellules moyennes et non-adhérentes des flacons. Ajouter 15 ml de DMEM frais / 10% PhABS et incuber à 37 ° Cà 5% de CO _2. Maintenir les cultures pour 6 - 8 jours, le changement moyen toutes les 48 heures.
   EN OPTION: Pour augmenter le rendement MPC, les cellules non-adhérentes de 2.3 pourraient être ré-étalées dans un nouveau flacon de culture et maintenus comme décrit pour les cultures primaires.
4. Aspirer et jeter milieu des flacons, laver avec du DMEM frais et ajouter 2 ml d'animaux protéase libre solution détachant. Incuber à 37 ° C pendant 5 - 15 min (éviter une incubation prolongée).
5. Ajouter 10 ml de DMEM frais / 10% PhABS, aspirer la suspension cellulaire et centrifuger à 400 g pendant 5 min
6. Aspirer et éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 - 2 ml de DMEM frais / 10% PhABS. Passez à nombre de cellules comme décrit à l'étape 1.10.
   NOTE: Ne pas utiliser de trypsine / EDTA comme détachant réactif. PPMs sont trypsine résistants. le dépistage morphologique des cultures, avant la récolte des cellules, est fortement recommandée afin d'évaluer la présence de cellules MSC-like en forme de fuseau. En cas quantité considérable de cellules MSC-like sont detected, d'augmenter la pureté du produit cellulaire en éliminant sélectivement les cellules contaminées. Pour ce faire, digestion par la trypsine peut être réalisée avant la récolte MPC, en ajoutant 2 ml de trypsine / EDTA 0,05% pendant 2 min. cultures Laver deux fois avec 5 ml de DMEM / 10% PhABS, puis procéder à la protéase traitement comme ci-dessus.

3. Cellule Caractérisation

1. La cytométrie en flux
   1. Mettre en place des échantillons en double de 10 ⁵ cellules fraîchement isolées dans la solution de lavage: D-PBS additionné de 0,5% (v / v) de sérum - albumine bovine (BSA) et 0,02% (p / v) d' azoture de sodium. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.
      ATTENTION: L' azoture de sodium est toxique.
   2. Remettre en suspension des pastilles dans 200 ul de solution de lavage et ajouter de l'anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 et anti-CD31 des anticorps conjugués avec des colorants fluorescents ( «TEST»); en parallèle mis en place des contrôles isotypiques ( "CTRL").
      NOTE: Les quantités de coloration des anticorps doivent être déterminés par titrage ou according aux instructions du fabricant.
   3. Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30 min.
   4. Centrifuger à 400 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 500 ul de solution de lavage et l' acquisition d' au moins 5 x 10 ⁴ sur le flux des événements multicolore cytomètre ^{7 9 10.}
   5. Analyser les résultats par point-parcelles et utiliser "CTRL" événements enregistrés pour définir quadrants.
      NOTE: Afin de définir la culture comme la culture MPC le pourcentage de CD73 CD90 ^{neg neg} CD45 ⁺ CD31 ⁺ cellules devrait être supérieure à 95%. Pour certaines applications spécifiques, par exemple une analyse d'expression génique, la reprise de coupure doit être augmenté à 97-98%.
2. détection Nestin et F-actine analyse de l'organisation
   1. Plate PPMs fraîchement isolés sur des lames de la chambre de culture (20 000 / cm ^2). Permettre aux cellules d'adhérer par une incubation pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de _CO2.
   2. Laver les cellules dans une solution de lavage et de fix dans 4% (p / v) de para-formaldéhyde à la température ambiante pendant 15 min. Pour supprimer fixateur ajouter la solution de lavage, incuber pendant 2 min et versez.
   3. Répéter deux fois le lavage.
   4. Perméabiliser les cellules dans D-PBS additionné de 0,05% (v / v) de Triton X-100 pendant 15 min à température ambiante.
   5. Arrêter la réaction en protéine libre amplificateur de signal (30 min à température ambiante) ou d'une solution de blocage standard (D-PBS additionné de 3% (p / v) de BSA).
   6. Retirer le signal activateur / solution de blocage.
   7. Ajouter 7 pg / ml (p / v) de l'anticorps primaire anti-humain de la nestine et incuber à 4 ° C pendant une nuit dans une chambre humidifiée. En parallèle, utiliser des anticorps de contrôle isotypiques pour évaluer les signaux de fluorescence non spécifiques.
   8. Laver les lames en ajoutant D-PBS, laisser pendant 2 minutes et verser. Répéter deux fois.
   9. Ajouter 2 pg / ml (p / v) de colorant fluorescent, un anticorps secondaire conjugué et on incube à 4 ° C pendant 1 heure dans l'obscurité.
   10. Laver les lames comme ci-dessus.
   11. Ajouter phalloïdine fluorescente (5 UI / ml), laisser à température ambiante pendant 30 mdans dans l'obscurité et laver 3 fois dans D-PBS.
   12. Retirer les parois de la chambre et monter les diapositives dans un milieu de montage aqueux additionné de antifade réactif et 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour la détection des noyaux. Passez à l' imagerie ^{7 9 10.}

4. Mesengenic Différenciation des PPM

1. Planche 2 x 10 ⁴ / cm ² PPMs fraîchement isolés dans TC-traités T75 flacons de culture et laisser les cellules adhérer pendant une nuit dans DMEM / 10% PhABS à 37 ° C dans 5% de CO _2.
2. Remplacer le milieu DMEM / 10% PhABS avec un milieu standard de sérum réduit, d' environ 200 pl / cm ^2, conçu pour l' expansion des cellules mésenchymateuses du stroma (milieu CSM-RS). Cultiver les cellules jusqu'à la confluence (P1-MSCs), généralement de 7 à 10 jours à compter de l'induction. Actualisez moyenne tous les 2 jours.
3. Aspirer et jeter milieu des flacons, se laver avec du milieu MSC-RS fraîche et ajouter 2 ml d'animaux protéase libre solution détachant. Incuber à 3776; C pendant 5 - 15 min (éviter une incubation prolongée).
4. Ajouter 10 ml de milieu MSC-RS fraîche, aspirer la suspension cellulaire et centrifuger à 400 g pendant 5 min
5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 - 2 ml de milieu MSC-RS frais. Passez à nombre de cellules comme décrit à l'étape 1.10
6. Passez à la sous-culture par ensemencement les 3-5 x 10 ³ cellules / cm ^2. Cultiver les cellules jusqu'à la confluence (P2-MSCs).
7. cellules de récolte par protease digestion comme décrit à l'étape 4.3 à l'étape 4.5 et de procéder à la caractérisation comme décrit dans la section 3.
   REMARQUE: Un pourcentage de CD73 ⁺ CD90 ⁺ CD45 des cellules CD31 ^{nég nég} inférieure à 95% indique que la différenciation partielle et exiger un nouveau passage en culture.
8. Plate P2-MSCs à 2 x 10 ⁴ / cm ² dans six plaques et TC-traitées et de croître jusqu'à la confluence dans un milieu MSC-RS.
9. Marquer deux puits comme "No Diff" et actualisez moyen MSC-RS.
10. Mark deux biens comme «ostéo» et remplacer moyenne avec 200 pl / cm ² de milieu osteogene standard, spécialement conçu pour la différenciation MSC.
11. Marquer deux puits comme "Adipo" et remplacer moyenne avec 200 pl / cm ² de milieu adipogénique standard, spécialement conçu pour la différenciation MSC.
12. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO ₂ en changeant l'ensemble des supports 48 par heure.
    NOTE: Il est fortement recommandé d'utiliser les médias de différenciation standards disponibles dans le commerce pour la reproductibilité du test. Après 2/3 semaines dans des conditions de différenciation, les dépôts de calcium apparaissent dans ostéogéniques induit des cultures, tandis que des gouttelettes lipidiques intracellulaires accumulation est évident dans les cellules adipogènes induite.
13. Aspirer et jeter les milieux de culture, puis laver avec du D-PBS.
14. Fixer les cultures en ajoutant 1 ml de 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 15 minutes à température ambiante.
15. Pour supprimer fixateur ajouter D-PBS, incuber pendant 2 min et versez. Répétez le lavagedeux fois.
16. Colorer un "No Diff" en même temps que les deux «ostéo» marqué puits dans une solution fluorescente spécifique hydroxyapatite et un "No Diff" avec les deux "Adipo" marqué puits dans 200 nM solution rouge Nil. Incuber pendant 30 min à température ambiante , ^11,12.
17. Retirer la coloration des solutions et laver dans D-PBS deux fois.
18. Retirer du D-PBS, ajouter du D-PBS supplémenté avec 50% (v / v) de glycérine et de procéder à l' imagerie ^{7 9 10.}

5. MPC Spheroid Germination Assay

1. Pour produire sphéroïdes 3D, poser des gouttes de 20 pi de suspension fraîchement isolés de MPC (1,5 x 10 ⁴ cellules / goutte) sur la surface intérieure d'un plat couvercle Petri.
   NOTE: Comme des gouttes de manipulation pourraient conduire à leur rupture, il est fortement recommandé de les poser en excès.
2. utiliser avec précaution le couvercle pour récapituler une boîte de Pétri contenant du D-PBS pour empêcher la pendaison chute évaporation. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂la nuit pour permettre aux cellules d'agréger en sphéroïdes 3D.
3. Définir un gel épais de protéines murines matrice extracellulaire (ECM) en ajoutant 300 uL d'aliquotes de protéines d'ECM standards dans une plaque de pré-réfrigérée culture à 24 puits et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
4. Basculez avec précaution sur le plat couvercle Petri et ramasser doucement les sphéroïdes à l'aide d'une pipette Pasteur stérile.
5. Déposer sphéroïdes sur le gel de protéine d'ECM, ajouter 700 ul de parties aliquotes de milieu de croissance endothélial cellulaire VEGF riche standard et laisser incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2.
6. Après 24 heures et à 7 jours de culture, prendre des photos des cultures 3D à 4X puissance de grossissement. Évaluer la germination de sphéroïdes appliquant un logiciel d'analyse d'image en mesurant la distance radiale entre la dernière cellule d'invasion et le bord sphéroïde. mesures répétées le long d'au moins 20 directions différentes. la distance moyenne est considéré comme positif lorsque 50 um ou plus.

Résultats

Les conditions de culture sélective décrites ici ont permis l'isolement d'une nouvelle population de cellules adhérentes et presque monomorphe que 1,0% de la HBM-MNC (0,5 - 2,0 x 10 ⁶ HBM-SMN de 5 - 10 ml d'échantillons BM frais) ^5,6 . Nous avons identifié ces grands (40 - 60 m de diamètre), arrondie, les cellules au repos, Ki-67-négatives PPM ^5. Morphologiquement, ils sont caractérisés par un oeuf-forme distinctive frit avec une région centrale épaisse entourée d'une périphérie mince plat montrant beaucoup de filopodes à une puissance de grossissement (flèches blanches sur la figure 1 A.1). Allongement polaire de la limite externe de la cellule est souvent observée (flèches noires sur la figure 1 A.1). Une telle morphologie est clairement différente de l'apparence mésenchymateuses de cellules stromales fusiforme typique rapportée dans des cultures de MSC standards. Cytométrie de flux a montré plus de 95% des PPM fraîchement isolés pour exprimer CD31 et CD45 en mmarqueurs associés de esenchymal CD90 et CD73 ¹³ étaient indétectables (Figure 1 A.2). Nous considérons cet ensemble restreint de quatre antigènes comme indicatif pour les PPM. D' autres caractéristiques distinctives des PPM sont en pointillés distribution F-actine révélant un certain nombre de structures de podosomes-like (rouge dans la figure 1 A.3) et l' expression intense de nestine (vert sur ​​la figure 1 A.3), qui est détecté dans les cellules coloré avec l'anticorps témoin isotypique (données non présentées).

PPMs culture dans standard RS moyen conçu pour obtenir des résultats d'expansion MSC dans la différenciation rapide dans les cellules MSC-like en croissance exponentielle (Figure 1 B.1). Après deux passages cellules finalement passer leur phénotype de CD73 ^{neg neg} CD90 CD45 ⁺ CD31 ⁺ CD73 ⁺ CD90 à ⁺ CD45 ^{neg neg} CD31 (Figure 1 B.2). Dans le processus, PPMs re-organize F-actine en fibres de stress alors que l' expression de la nestine devient limitée à quelques rares cellules (Figure 1 B.3). MPC différenciation mesengenic en un phénotype MSC comme défini se produit par deux étapes distinctes révélées par différentes morphologies cellulaires. Après une semaine en milieu MSC RS une population résiduelle de cellules MPC-like est encore détectable dans une couche confluente de plat, des cellules multibranchées polygonales (P1-MSCs dans la Figure 2 A). Un autre passage est nécessaire pour obtenir une culture presque monomorphe de cellules MSC comme la broche en forme (P2-MSCs dans la Figure 2 A). Ces cellules en croissance exponentielle peuvent facilement se différencier en ostéoblastes ou adipocytes lorsqu'ils sont transférés dans des milieux sélectifs pendant au moins 2 semaines, confirmant ainsi leur MSC nature. Dans ostéogéniques induite cultures, les dépôts de calcium peuvent être détectés par l' une tache Alizarine-S colorimétriques ou des colorants fluorescents spécifiques (vert dans la figure 2 B). Après que les cellules d'induction adipogéniquesmontrer gouttelette lipidique accumulation comme l'a révélé soit colorimétriques Oil Red ou fluorescent rouge Nil tache (rouge dans la figure 2 B).

MPC typage a été confirmée par la germination dosage de l'angiogenèse. PM ont montré leur capacité d'envahir (plus de 50 pm) de gel de protéine d'ECM sphéroïdes de souris 3D après 24 h VEGF-stimulus (figure 2 C). Après que les cellules envahissant d'une semaine ont été détectés à 300-600 um de distance. A l' inverse, la capacité d'invasion a été perdu dans P2-après différenciation des MSC mesengenic (figure 2 D).

Figure 1. PPMs fraîchement isolés ont des caractéristiques distinctives. La culture HBM-MNC dans DMEM / 10% PhABS pendant sept jours donne lieu à une population de PPM de repos (A) facilement distinguables de MSCs (B) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. PPMs Différencier en MSCs standard et Afficher Germination angiogenèse in vitro. Le remplacement de DMEM / PhABS avec RS disponibles dans le commerce à moyen conçu pour l' expansion MSC déclenche l' induction mesengenic des PPM. Après une semaine en culture quelques PM résiduels sont encore détectables (P1-MSC) , tandis qu'un autre passage dans du milieu CSM-RS conduit à une population de cellules confluentes MSC-like (P2 MSCs, A barres d'échelle = 100 um). P2-MSCs différencier en ostéocytes terminale ou adipocytes sous des stimuli appropriés comme révélé par le dépôt de calcium (vert B) et de l' accumulation de lipides de gouttelettes (rouge B, barres d'échelle = 200 um), respectivement. PPMs montrent la germination cohérente de sphéroïdes en gel de protéine de ECM murin (C) à une différence avec P2-MSCs (D, barres d'échelle = 1,0 mm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Au cours des dernières décennies, les CSM ont fait l’objet de recherches approfondies et d’évaluations précliniques en vue d’une éventuelle application dans le traitement de divers troubles osseux/articulaires, immunologiques, neurologiques, cardiovasculaires, gastro-intestinaux et hématologiques^14,15. L’isolement facile et peu coûteux de CSM multipotentes, à partir de nombreux tissus différents, ainsi que leur absence d’immunogénicité significative¹⁶, contribuent à faire de ces cellules l’une des populations cellulaires les plus intéressantes à appliquer dans les thérapies cellulaires. Néanmoins, la très faible fréquence dans le tissu d’origine représente une grande limitation à l’application des CSM en clinique, forçant l’expansion de ces cellules, in vitro, avant la perfusion ou la transplantation.

Les cultures MSC élargies ont révélé des niveaux élevés d’hétérogénéité et de variabilité^17-19 , ce qui rend difficile l’obtention d’un consensus sur les protocoles de production et de caractérisation des MSC. De plus, des études récentes ont suggéré la présence de plusieurs ancêtres in vivo des CSM dans un large éventail de tissus, ce qui contribue à l’hétérogénéité de la culture^10,20. En fait, il a été proposé que des conditions de culture particulières puissent sélectionner ou simplement promouvoir des sous-populations spécifiques de progéniteurs de CSM présents, en pourcentages divers, dans des échantillons « bruts » et non traités comme la moelle osseuse (hBM-MNCs) ou les tissus adipeux (fraction vasculaire stromale)². Ainsi, la variabilité des populations cellulaires initiatrices de CSM, ainsi que le grand nombre de protocoles d’enrichissement/isolement et de culture différents appliqués, représentent un grand obstacle à la définition de thérapies réalisables à base de CSM.

Un facteur crucial affectant l’hétérogénéité des cultures MSC est la supplémentation sérique²¹. Entre nos mains, le remplacement du FBS par du PhABS dans les cultures primaires à partir de MH-MNC, combiné à un ensemencement à haute densité sur des plastiques hydrophobes, a conduit à l’isolement d’une nouvelle population cellulaire hautement adhérente avec des caractéristiques biologiques distinctes appelées MPCs^5,6. Nous avons observé que l’ajout de petits pourcentages de PhABS aux cultures primaires FBS permettait également l’isolement des MPC, suggérant la présence d’agents inducteurs de MPC dans le sérum humain⁶. À l’heure actuelle, le protocole d’isolement/caractérisation des MPC est une méthode unique disponible pour obtenir des MPC presque pures. Le protocole a été soigneusement ajusté et il est hautement reproductible pour le criblage de qualité des préparations MPC avant d’autres applications.

Les MPC pourraient être utilisées comme source pour la production de MSC, limitant ainsi la variabilité introduite par l’utilisation de matières premières non fractionnées. La définition précise des multiples étapes caractérisant la différenciation mésengène des MPC rapportée⁹ permettrait une expansion synchronisée des cellules mésenchymateuses. Néanmoins, cette dernière condition a pu être réalisée exclusivement en appliquant une population de MPC hautement purifiées, en conséquence de la caractérisation des produits cellulaires obtenus par le protocole décrit ici, résultats d’une importance cruciale. Cette méthode d’isolement a été rapportée permettant la récupération des MPC avec une pureté généralement autour de 95 %. Cependant, la variabilité donneur/patient, ainsi que la variabilité liée aux différents lots de sérum humain mélangé appliqués, pourraient conduire à un pourcentage significatif de cellules de type CSM co-isolées avec des CMP, dans des conditions sélectives.

Il n’est pas clair si ces cellules « contaminantes » de type CSM pourraient provenir des autres progéniteurs in vivo décrits dans la moelle osseuse²² ou d’une différenciation incontrôlée et spontanée des CPM. Dans tous les cas, un pourcentage constant de cellules de type MSC dans les produits MPC annule la possibilité d’appliquer ces cellules comme matériau de départ homogène pour l’expansion MSC. Ainsi, il a été suggéré ici une méthode simple et peu coûteuse, basée sur la résistance du MPC à la digestion de la trypsine, augmentant la pureté des produits MPC. Des résultats similaires, voire meilleurs, pourraient être obtenus en matière de purification des cultures MPC par le tri cellulaire fluorescent ou magnétique effectuant une appauvrissement en CD73 et/ou CD90, mais en prolongeant considérablement le temps de traitement et en augmentant les coûts.

De plus, les MPC ont montré l’expression de marqueurs associés à la pluripotence et de Nestin, tous rapidement perdus lors de la différenciation mésengène⁷. Le test de germination a révélé la capacité de la MPC à envahir le gel de protéine ECM murin. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les MPC doivent être considérées comme un progéniteur plus immature, conservant le potentiel angiogénique. Néanmoins, l’enthousiasme initial pour le potentiel de différenciation mésodermique des MPC est en train de s’estomper. En fait, après plus de 7 ans d’études sur les MPC, le potentiel mésengène et angiogénique a été largement décrit^5-9, mais la différenciation vers d’autres cellules d’origine mésodermique fait encore défaut. Ainsi, nous proposons ici une nouvelle définition, plus rigoureuse, de ces cellules en tant que « cellules progénitrices mésangiogéniques », en maintenant l’acronyme MPCs.

Nous pensons également que la plupart des controverses sur le potentiel angiogénique des CSM pourraient être liées à la composition hétérogène des cultures élargies composées de sous-populations de CPM et de CSM en pourcentages variables²³.

Enfin, les MPC pourraient également jouer un rôle crucial pour la mise en œuvre de CBMP applicables à la reconstruction tissulaire, car ces cellules pourraient également soutenir la néo-vascularisation. En fait, les études futures sur la régénération devraient prendre en considération le fait que la croissance tissulaire nouvellement formée devrait être soutenue par une néo-angiogenèse concomitante. La coexistence du potentiel mésengène et angiogénique dans les MPC pourrait améliorer significativement le potentiel de régénération de nouvelles approches thérapeutiques impliquant ces cellules intéressantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrigel Console de membrane basale	BD Bioscience (San Jose, CA-USA)	354230	Protéines ECM murines Concentration de stock : 100 % (9 - 12 mg/ml) Concentration finale : 100 %
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	D8537
70 &mu ; m Filters	Miltenyi Biotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM  ;	GE Healthcare (Uppsala, Suède)	17-5442-03	milieu pour centrifugation à gradient de densité discontinuos
Sérum humain de type AB regroupé (PhABS)	LONZA (Walkersville MD-USA)	14-490E	Concentration finale : 10 %
Glutamax-I	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	35050-038	L-Glutamine stabilisée Concentration stock : 100x Concentration finale : 2 mM
d’albumine sérique bovine (BSA)	Sigma (St. Louis, MO, USA)	A8412	Concentration stock : 7,5 % Concentration finale : 0,5 %
Azoture de sodium	Sigma (St. Louis, MO, USA)	S8032	Concentration finale : 0,02
Pénicilline/Streptomycine (Pen Strep)	Gibco ( Grand Island, NY, États-Unis)	15070-063	Antibiotiques Concentration du stock : 5 000 UI/ml de pénicilline, 5 000 μ ; g/ml Streptomycine Concentration finale : 50 UI/ml de pénicilline, 50 μ ; g/ml
Fiole de culture de streptomycine T-75 pour cultures en suspension	Greiner Bio-one  ; (Frickenhausen, Allemagne)	658 190
Fiole de culture T-75 traitée TC	Greiner Bio-one  ; (Frickenhausen, Allemagne)	658170
ThermoFisher TrypLE Select	(Waltham,  ; MA USA)	12563-011	Solution de détachement de protéases exemptes d’animaux Concentration de stock : 1x Concentration finale : 1x
Trypsin/EDTA	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	15400-054	Phenol red free Concentration de stock : 0,5 % Concentration finale : 0,25 %
anticorps anti-CD90 APC. (CD90)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-095-402	Concentration finale : 1:40
d’anticorps anti-CD45 APC-Vio770 (CD45)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-096-609	Concentration finale : 1:40
d’anticorps anti-CD73 PE (CD73)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-095-182	Concentration finale : 1:40
d’anticorps anti-CD31 PE Vio-770 (CD31)	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-105-260	Concentration finale : 1:40
Anticorps IgG1 APC de souris	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-098-846	Concentration finale : 1:40
Anticorps IgG2a APC Vio770 de souris	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-096-637	Concentration finale : 1:40
Anticorps IgG1 PE de souris	MiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Allemagne)	130-098-845	Concentration finale : 1:40
Anticorps IgG1 PE Vio-770 de souris	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-098-563	Concentration finale : 1:40
Low Glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium  ; (DMEM)	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	13-1331-82	Sans rouge de phénol milieu essentiel minimal Concentration stock : 1 000 mg/L de glucose
Sérum fœtal bovin  ; (FBS)	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	10500	Concentration stock :0.2 mg/ml Concentration finale : 2 &mu ; g/ml
réactif anti-décoloration Prolong Gold avec 4',6-diamidino-2-phénylindole	Invitrogen (Waltham, MA,  ; États-Unis)	P-36931	Milieu d’enrobage aqueux + DAPI Concentration finale : 1x
Paraformaldéhyde	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P6148	Fixatif Concentration finale : 4 %
LAB-TEK lames de chambre à deux puits	Sigma (St. Louis, MO, USA)	C6682
Anticorps anti-Nestin [clone 10C2]	Abcam (Cambridge, UK)	ab2035	Concentration du stock : 1 mg/ml Concentration finale : 7 &mu ; g/ml
Alexa Fluor 555 Phalloidin	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	A34055	Concentration de stock : 200 UI/ml Concentration finale : 5 UI/ml
Triton X-100	Euroclone (Milan, Italie EMR237500		Concentration finale : 0,05 %
MesenPRO RS Medium  ; (MSC-RS moyen)	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	12746-012
Alexa Fluor 488 kit SFX anti-souris	ThermoFisher (Waltham,  ; MA USA)	A31619	Anticorps secondaire anti-souris de chèvre + amplificateur de signal Concentration stock : 2 mg/ml Concentration finale : 2 &mu ; g/ml
Pipette Pasteur	Kartell Labware  ; (Noviglio (MI), ITALIE )	329
StemMACS AdipoDiff  ; Média	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-091-679
StemMACS OsteoDiff  ; Média	MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Allemagne)	130-091-678
Ostéoimage Dosage de minéralisation osseuse	LONZA (Walkersville MD-USA)	PA-1503	Solution de coloration fluorescente spécifique à l’hydroxyapatite
50 ml Tube conique en polystyrène	Greiner bio-one (Kremsmü ; nster Autriche)	227261
ThermoFisher rouge du Nil	(Waltham,  ; MA USA)	N1142	Solution de coloration fluorescente pour lipides Concentration stock : 100 mM Concentration finale : 200 Nm
Glycérine	Sigma (St. Louis, MO, USA)	G2289	Concentration finale : 50 %
Boîtes de Pétri Polistirene	Sigma (St. Louis, MO, USA)	P5606
Plaques à 24 puits traitées TC	Greiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Allemagne)	662160
Milieu de croissance endothéliale, EGM-2 BulletKit  ; (AGE-2)	LONZA (Walkersville MD-USA)	CC-3162	Milieu de croissance des cellules endothéliales riche en VEGF
Leica Qwin Image Analisys Software	Leica (Wetzlar, Allemagne)		Logiciel d’analyse d’images